Transcript 8 HPLC Aplikace verze 1

Využití HPLC v
analýze
potravin
HPLC aplikace
1
HPLC aplikace
2
HPLC aplikace
3
Stanovení
přirozených
složek potravin
HPLC aplikace
4
Lipidy
• Nasycené a nenasycené triacylglyceroly – zpracování potravin
• Nízká stabilita triacylglycerolů obsahujících nenasycené mastné
kyseliny
• Reakce se světlem a kyslíkem – vznik hydroperoxidů – ovlivnění
chuti a kvality tuků
• Falšování přídavkem jiných tuků, použití ztužených tuků – stanovení
obsahu triacylglycerolů (př. falšování olivového oleje)
Stanovení triacylglycerolů, hydroperoxidů, sterolů a vitaminů
• UV-DAD spektra – stopy hydroperoxidů
nasycené x nenasycené triacylglyceroly
• Př. nenasycené triacylglyceroly v olivovém oleji – charakteristické
spektrum
• Příprava vzorku – extrakce petroletherem, rozpuštění v THF
HPLC aplikace
5
Profil triacylglycerolů
Starý slunečnicový olej
Odezva při 240 nm – hyroperoxidy
HPLC aplikace
6
Analýza olivového oleje
280 nm – konjugované dvojné vazby –
špatná kvalita oleje
HPLC aplikace
7
Profil triacylglycerolů
v olivovém oleji
HPLC aplikace
8
Mastné kyseliny
• Stanovení nenasycených mastných kyselin
C4-C22
• Př. máslo a margariny se liší v zastoupení
kyseliny máselné v triacylglycerolech
• Stanovení jednotlivých mastných kyselin
• Hydrolýza (horký metanol a KOH), online
derivatizace (bromid fenacylbromidu zavedení chromoforu) - HPLC/UV
HPLC aplikace
9
Složení tuku
HPLC aplikace
10
Sacharidy
• Glukosa, galaktosa, rafinosa, fruktosa, mannitol,
sorbitol, laktosa, maltosa, cellobiosa, sacharosa
• Nepřítomnost chromoforu nebo fluoroforu: nelze
UV-VID nebo FLD
• RID – hladiny mg/kg
• Elektrochemická detekce - hladiny µg/kg
• Příprava vzorku (dle matrice): odplynění, filtrace,
extrakce, SPE přečištění
HPLC aplikace
11
Stanovení sacharidů
HPLC aplikace
12
Vitaminy
Přírodní i syntetické
Zlepšení nutriční hodnoty potravin
Ve vodě rozpustné vitaminy: C, B6, B2, B1, B12
V tuku rozpustné vitaminy: E, D, A
Hladiny µg/kg
Labilní (světlo, teplo)
UV, DAD – kvalitativní i kvantitativní stanovení
Elektrochemická detekce
HPLC aplikace
13
UV detekce
HPLC aplikace
14
Elektrochemická detekce
Vitaminový přípravek
HPLC aplikace
15
V tuku rozpustné vitaminy
UV detekce
HPLC aplikace
16
V tuku rozpustné vitaminy
Elektrochemická detekce
HPLC aplikace
17
Tokoferoly – normální fáze
HPLC aplikace
18
Stanovení tokoferolů v extraktu margarinu
FLD detekce
HPLC aplikace
19
Biogenní aminy
• Stanovení biogenních aminů
• Volné aminy přítomny v potravinách a
nápojích (ryby, sýry,víno, pivo)
• Maximální přípustné hladiny MRL
• derivatizace
HPLC aplikace
20
UV detekce
Víno - po derivatizaci (dansyl chlorid)
HPLC aplikace
21
Aminokyseliny
•
•
•
•
•
Primární a sekundární aminokyseliny v jednom stanovení
Stanovení původu masných výrobků – falšování potravin
Chirální stacionární fáze stanovení D a L formy
Automatická online derivatizace - předkolonová, FLD detekce
Příprava vzorku: hydrolýza (HCL, enzym)
HPLC aplikace
22
STANOVENÍ AMINOKYSELIN
Příprava hydrolyzátu pro stanovení aminokyselin - převedení
aminokyselin, které jsou převážně vázané v bílkovinách, do formy
volných aminokyselin
Analytická koncovka – přesnost, správnost, rychlost
HPLC
Separace - ionexy (automatické analyzátory aminokyselin)
reverzní fázi - oktadecyl (C18), gradientová eluce
Detekce a kvantifikace – po předchozí derivatizaci
Derivatizace před i za kolonou, UV i fluorescenční detekce
interní standard kompenzuje:
nižší výtěžky derivatizační reakce
ztráty při přípravě vzorku
variabilní objem při nástřiku vzorku
Jako vnitřní standardy se používají: norleucin, norvalin, aminomáselná kyselina, -aminomáselná kyselina, -aminomáselná
kyselina a homoserin, mohocystin, ethanolamin aj.
HPLC aplikace
23
Derivatizační činidla
o-Phthaldialdehyd (OPA)
9-fluorenyl-methyloxycarbonyl chlorid (FMOC-Cl)
Ninhydrin
Dansylchlorid
AQC (6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl
carbamát)
Phenylisothiokyanát (PITC)
HPLC aplikace
24
o-Phthaldialdehyd (OPA)
Reakce o-phthaldialdehydu za přítomnosti merkaptoethanolu s
primárními aminokyselinami - rychlá, za laboratorní teploty
Výhoda - sám nefluoreskuje, deriváty s aminokyselinami mají
vynikající fluorescenci
excitační maxima 340 nm, emisní maxima 450 nm
Nevýhoda - reaguje pouze s primárními aminokyselinami
HPLC aplikace
25
Separace OPA derivátů aminokyselin
Chromatografické podmínky
Gradient: solvent A: 15 mM Na2HPO4 pH 7,2/tetrahydrofuran (96+4); solvent
B: 15 mM Na2HPO4/CH3OH/CH3CN (40+36+24). Průtok: 3,5 ml/min;
26
HPLC aplikace
program: 0-100 % B/A, 27 min. Kolona: Radial Pak 5 m C18 cardtridge.
Porovnání vlastností jednotlivých derivatizačních činidel
používaných k derivatizaci aminokyselin
Charakteristika
OPA
FMOC-Cl
Ninhydrin
Dns-Cl
AQC
PITC
Detekce
FLD
FLD
UV
UV (FLD)
FLD
UV
Citlivost
fmol
fmol
mol
pmol (nmol)
fmol
pmol
Stabilita derivátu
špatná
dobrá
--
dobrá
dobrá
střední
Rychlost
derivatizace
rychlá
rychlá
malá
malá
rychlá
střední
Sekundární
aminokyseliny
ne
ano
ano
ano
ano
ano
Interference
reagentu
ne
ano
ne
ano
ano
ano
Interference
matrice
malý
střední
ne
malý
ne
vysoký
HPLC aplikace
27
Stanovení aminokyselin v pivu
po derivatizaci (OPA)
HPLC aplikace
28
Stanovení aminokyselin v bramborách (HPLC/FLD v reverzní fází, derivatizace OPA)
%F
30
asparagin
homoserin
25
glutamin
20
15
kyselina asparagová
10
kyselina glutamová
5
4
6
8
10
12
min
Podmínky stanovení:
analytická kolona: MERCK, LichroCART (250x4 mm), LiChrospher 100 RP-18 (5m)
analytická předkolona: MERCK, LichroCART (4x4 mm), LiChrospher 100 RP-18 (5 m)
teplota kolony: 30 °C
mobilní fáze: 0,01 M Na2HPO4; 0,013 mM Na2EDTA; methanol (Merck); pH 6,4
gradientová eluce: 0 – 15 min.
28 - 50 % methanolu
15 -20 min.
50 % methanolu
průtok: 0,7 ml/min
nástřikový program: 10 μl derivatizačního činidla a 10 μl vzorku bylo v nástřikové smyčce
desetkrát promícháno a po minutové prodlevě byl proveden nástřik na kolonu
FLD detektor: ex = 340 nm; em =HPLC
455 nm
29
aplikace
D,L-alanin
Chirální separace optických izomerů
kolona : 25 cm x 4 mm
stac. fáze : Nucleosil Chiral-1
eluent : 1 mM vodný roztok (CH3COO)2Cu (pH = 5,6)
průtok eluentu : 1,2 ml/min
teplota : 60 ˚C
detekce : UV 240 nm
1. D-alanin
2. L-alanin
HPLC aplikace
30
Bílkoviny
kolona : 25 cm x 9,4 mm
stac. fáze : Zorbax GF-250
eluent : 130 mM NaCl + 20 mM KCl + 50 mM Na2HPO4 (pH = 7,0)
průtok: 1 ml/min
detekce : UV 210 nm
1. myší IgM, Mh = 900 000
2. hovězí thyroglobulin, Mh = 669 000
3. β-amylasa z brambor, Mh = 200 000
4. hovězí serum albumin, Mh = 66 000
5. kuřecí albumin, Mh = 45 500
6. hovězí RNAasa, Mh = 13 700
7. azid (tmax), Mh = 65
HPLC aplikace
31
Stanovení peptidů fytochromu
V semenech ovsa rostoucích ve tmě
HPLC/UV a MS detekce
UV mapování
HPLC aplikace
32
Stanovení peptidů fytochromu
semena ovsa rostoucí ve tmě
LC-MS
TIC
MS spektrum
T12 a T58
HPLC aplikace
33
Deriváty purinu
kolona : 30 cm x 4 mm
stac. fáze : Nucleosil 50-5
eluent : methanol-voda-dichlormethan 47:17:936 (v/v/v)
průtok: 0,8 ml/min
detekce: UV 280 nm
1. kofein
2. theofyllin
3. theobromin
HPLC aplikace
34
HPLC/UV analýza fytoestrogenů (po SPE přečištění)
přečištění SPE
A)
Daidzein
25
Genistein
mAU
20
15
10
5
4
5
6
7
8
9
B)
Daidzein
25
Genistein
B)
mAU
20
10
11
min
bez přečištění
15
10
5
4
5
6
7
8
HPLC aplikace
9
10
11
min
35
Stanovení glykoalkaloidů v rajčatech LC-MS/MS
Porovnání HPLC-UV a LC-MS/MS metody
VWD1 A, Wavelength=205 nm (C:\HPCHEMLC\1\DATA\GA2005\02280023.D)
VWD1 A, Wavelength=205 nm (C:\HPCHEMLC\1\DATA\GA2005\02280019.D)
R40 56,8mg/kg
mAU
RT: 0,00 - 14,99 SM:15G
90
NL: 1,04E7
m/z=
1016,0-1017,0 F: +
c ESI SRM ms2
1034,60@34,00 [
1015,60-1017,60]
MS R40
RT: 11,30
MA: 190273064
SN: 1333
Tomatin
77,01 mg/kg
100
80
Relative Abundance
250
200
70
60
50
40
30
20
ST 37 g/ml
10
0
150
90
80
100
NL: 1,94E5
m/z=
1014,0-1015,0 F: +
c ESI SRM ms2
1032,90@38,00 [
1013,50-1015,50]
MS R40
RT: 9,84
MA: 3442329
SN: 439
Dehydrotomatin
2,51 mg/kg
100
70
60
50
40
50
30
20
10
0
0
1
2
3
4
5
0
6
7
8
9
10
11
12
13
14
Time (min)
1
2
3
4
5
6
7
8 min
HPLC-UV a LC-MS/MS chromatogram vzorku R40 (zelené rajče)
LC-MS/MS 20x nižšího LOD, lepší opakovatelnost a výtěžnost ve srovnání
s HPLC-UV (vhodná pro zralá rajčata)
Parametry metody
HPLC-UV
Analyty
Tomatin
Opakovatelnost
4%
Výtěžnost
Dehydrotomatin
85,0% (100
mg/kg)
Nelze stanovit
LC-MS/MS
Tomatin
Dehydrotomatin
2,6%
3,1%
94,4% (9 mg/kg)
82,9% (0,9mg/kg)
Detekční limit (LOD)
2 mg/kg
HPLC aplikace 0,1 mg/kg
0,05 mg/kg
Mez kvantifikace (LOQ)
6 mg/kg
0,3 mg/kg
0,15 mg/kg
36
Potravinářská
aditiva
HPLC aplikace
37
Acidulanty a regulátory kyselosti
Kyselina sorbová a citrónová
Octová, propionová, jantarová, adipová, mléčná, fumarová, jablečná,
vinná kyselina
• Ochucovadla - zintenzivnění chuti, maskování nežádoucích pachutí
• Pufrování – kontrola pH (zpracování potravin, finální výrobky)
• Konzervační prostředky, zamezení růstu mikroorganismů
• Prevence žluknutí a hnědnutí – antioxidační účinky
• Úprava viskozity pečených výrobků
• Přídavky při tavení - tavené sýry, cukrovinky
• Zlepšení barvy a chuti při konzervování masa
Destilace s vodní parou, SPE
HPLC UV/DAD
HPLC aplikace
38
Bílé víno
HPLC aplikace
39
Citrónová kyselina ve vodce
HPLC aplikace
40
Antioxidanty
HPLC aplikace
41
HPLC/UV-VIS (DAD) antioxidantů
Žvýkačka
HPLC aplikace
42
Konzervační prostředky
Benzoová kyselina
Sorbová kyselina
Propionová kyselina
Methyl-, ethyl-, propyl- estery p-hydroxy benzoové kyseliny
(PHB.methyl, PHB-ethyl, PHB-propyl
Inhibice růstu mikroorganismů
Prodloužení životnosti potravin
HPLC aplikace
43
HPLC/UV-VIS (DAD)
HPLC aplikace
44
Umělá sladidla
Acesulfam
Aspartam
Sacharin
Nízkokalorická sladidla: nápoje
Regulace hladin – legislativa
Možný toxický účinek
HPLC aplikace
45
Aspartam
On-column derivatizace, PR chromatografie
Srovnání spektra derivatizovaného (OPA)
a nederivatizovaného aspartamu
HPLC aplikace
46
Syntetická barviva
Použití: při zpracování potravin
ve farmaceutickém průmyslu
v chemickém průmyslu
Zakrytí kazů, zvýraznění barvy potravin,
zamaskování vlivů zrání a stárnutí
Zlepšení přitažlivosti potravin
Kontrola kvality, stanovení stopových koncentrací
původních látek a degradačních produktů – vývoj
citlivých a selektivních analytických metod
HPLC/UV-VIS - charakteristická maxima
400 nm (žlutá) – 500 nm (červená) – 600 – 700
nm (zelená, modrá, HPLC
„černá“)
aplikace
47
Syntetická barviva v limonádě
Spektra žlutého, červeného, modrého a „černého“ barviva
HPLC aplikace
48
Ochucovadla
Zlepšení chuti potravin
Nejčastěji použité látky:
Esenciální oleje (silice), hořké látky, ostré pálivé látky
Příklady:
• Lupulon a humuklon (hořké látky chmele)
• Vanilin
• Naringenin a hesperidin (hořké látky)
Nejčastěji používaná metoda: GC (head-space, SPME)
HPLC – málo těkavé látky, tepelně nestabilní látky
HPLC aplikace
49
Vanilin
HPLC/UV, RP
Kvalita extraktu vanilinu
HPLC aplikace
50
Stanovení vanilinu v koňaku
Identifikace srovnáním spekter
HPLC aplikace
51
Hořké látky: hesperidin a naringenin
Pomerančový džus
HPLC/UV, RP
HPLC aplikace
52
Rezidua a
kontaminanty
HPLC aplikace
53
Aplikace v reziduální analýze
Analýza stopových množství sledovaných látek:
- vysoká citlivost analytické metody
- nízké meze stanovitelnosti (závisejí na citlivosti a šumu použitého detektoru,
na zředění látky při průchodu kolonou a na rušivých vlivech daných
složkami mobilní fáze či kontaminanty v mobilních fázích nebo v
analyzovaném vzorku.
Pro ideální (gaussovský) profil píku lze odvodit vztah mezi výškou píku,
zaznamenaného detektorem, a koncentrací látky ve vzorku, dávkovaném
do chromatografu,
Zlepšení citlivosti - ovlivnění faktorů na pravé straně rovnice, tak aby byla
výška píku maximální.
Snížení mezí detekce - zvýšení odstupu signálu od šumu
Snížení šumu - termostatovaná kolona a cela detektoru, použití čerpadel se
stabilním hladkým průtokem, mobilních fází připravených z velmi čistých
složek (zejména při gradientové eluci), důkladně odplyněných a přečištěním
vzorku
54
HPLC aplikace
Nejčastější aplikace
Stanovení reziduí léčiv
(stanoveny MRL)
(dobytek drůbež, maso, mléko, vejce …; působení rezistence)
• Chemoterapeutika (sulfonamidy, antibiotika …)
• Antiparazitika
• hormony
Mykotoxiny
Polyaromatické uhlovodíky
Pesticidy
Příklady:
HPLC aplikace
55
Rezidua léčiv ve vzorcích vajec
HPLC/UV-VIS (DAD); RP
HPLC aplikace
56
Stanovení reziduí tetracyklinů v mase
HPLC/UV-VIS (DAD); RP
LOD 0,1 mg/kg
HPLC aplikace
57
Mykotoxiny:
Fumonisiny - Fusarium monoliformae
LC/MS
MS spektra fumonisinu B1, 2, 3
HPLC aplikace
58
Identifikace fumonisinů ve vzorcích kukuřice,
Následná konfirmace dle fragmentových iontů
HPLC aplikace
59
Mykotoxiny
HPLC aplikace
60
Mykotoxiny
HPLC aplikace
61
Mykotoxiny
Aflatoxiny
HPLC UV/FLD
HPLC aplikace
62
HPLC/FLD stanovení zearalenonu
Porovnání přečištění pomocí SPE a GPC
FLD1 A, Ex=235, Em= 440 (ZEARAL~1 \ZEARAL~1\MN Z60302 \SP IKE 1A.D)
LU
PŘEČIŠTĚNI SPE – IMUNOAFINITNÍ SORBENT
A
ZEA (32 ng)
250
16.181
200
150
100
1.1
91
50
0
2.5
62
2
4
6
8
10
12
14
16
18
m in
FLD1 A, Ex=235, Em=440 (ZEARAL~1 \ZR200202\SARKA-I.D)
LU
PŘEČIŠTĚNI GPC – Bio Beads S-X3
B
250
ZEA (25 ng)
16.072
Area: 1821.58
200
150
100
50
0
2
4
6
8
10
Zearalenon
manuálně
SPE - výtěžnost
109 %
HPLC aplikace
SPE - opakovatelnost
31 %
12
14
x
16
18
min
ASPEC
92 %
3%
63
Bisphenol A diglycidyl-ether (BADGE)
LC/MS CID (collision induced dissociation)
Extrakt z tuňáka; 0,2 mg/kg; 1 μl nástřik
HPLC aplikace
64
Bisphenol A diglycidyl-ether (BADGE)
LC/MS CID (collision induced dissociation)
Extrakt ze sardinek; 20 mg/kg; 1 μl nástřik
HPLC aplikace
65
Pesticidy
Rezidua pesticidů ve vzorku salátu
Carbendazim – výtěžnost pouze 40%
HPLC aplikace
66
Stanovení reziduí pesticidů ve vzorcích papriky
HPLC aplikace
67
Karbamáty
Nesystémové insekticidy
HPLC/FLD
Pokolonová derivatizace
(OPA/NaOH)
Materiál: ovoce, zelenina
HPLC aplikace
68
Karbamáty
Analýza standardů
HPLC aplikace
69
Glyfosát
systémový herbicid
HPLC/FLD
Pokolonová derivatizace
Standard
HPLC aplikace
70
FUNGICIDY
Extrace z ovoce: dichlormetan
Kolona: Nucleosil 7 C18
eluent : 5 g/l kys. mravenčí + NaOH
 (pH 7,5) 40 % se 60 % methanolu

1.
2.
3.
4.
5.
thiabendazol
o-fenylfenol
Difenylamin
Ethoxychin
bifenyl
HPLC aplikace
71
PAH HPLC/DAD UV spektrum
HPLC aplikace
72
Parametry DAD a FLD stanovení
HPLC aplikace
73
LOD: DAD, FLD
HPLC aplikace
74
300
200
0
400
5
0
10
15
20
HPLC aplikace
25
26.294 - I [cd]P
25.606 - B[ghi ]P
ex/em 216/336 nm
20
24.274 - DB[ah]A
LU
22.933 - B[a]P
15
21.810 - B[k]F
500
10
20.972 - B[b]F
5
18.499 - Chr
0
24.182 - B[ghi]P
24.711 - I[cd]P
23.034 - DB[ah]A
21.852 - B[a]P
20.790 - B[k]F
19.858 - B[b]F
17.147 - B[a]A
17.752 - Chr
14.623 - Pyr
13.710 - Flt
olej, 10 mg matrice v nástřiku
17.604 - B[a]A
60
14.919 - Pyr
80
13.915 - Fl t
100
12.625 - Ant
ex/em 216/336 nm
11.632 - Phe
140
12.754 - Ant
160
10.457
10.658- - Ace
Fln
180
11.616 - Phe
120
7.947 - Naph
LU
10.281 - Ace
10.543 - Fl n
7.685 - Naph
IDENTIFIKACE / KVANTIFIKACE - HPLC/FLD
(po GPC přečištění)
FLD1 A, Ex=248, Em=374, TT (C:\DATAHP~1\DATA98\MT98OLEJ\025-2201.D)
40
20
0
FLD1 A, Ex=248, Em=374, TT (C:\HPCHEM\FLD154-4\DATA\MT00X904\043-4201.D)
25
30 min
jablka, 250 mg matrice v nástřiku
100
75
min