Transcript stanoveni-enzymovych-aktivit

Jednotky enzymové aktivity
• Katalytická aktivita (rychlost přeměny substrátu) 
mol.s-1. Jednotkou katalytické aktivity je katal (kat).
Pozor!!!
• Reakční rychlost (fyzikálně-chemický smysl)  mol.l-1.s-1
• V praxi (např. při fotometrickém stanovení) měříme
změny koncentrace v čase (tj. reakční rychlost)  pro
vyjádření katalytické aktivity je nezbytné vztáhnout
změřenou hodnotu na celkový objem
Jednotky enzymové aktivity
• Donedávna byla katalytická aktivita
(rychlost přeměny substrátu) vyjadřována
v μmolech substrátu přeměněného za 1
minutu (1 U).
• Vzájemný přepočet mezi U a kat
1 U = 1 μmol.min-1 = 1 μmol/60 s =
16,67 nmol. s-1 = 16,67 nkat
Jednotky enzymové aktivity
• Koncentrace katalytické aktivity  kat.l-1
• Specifická katalytická aktivita  kat.kg-1
• Molární katalytická aktivita  kat.mol-1
Úprava vzorku před měřením
• Nevhodné zpracování vzorku může vést ke
zcela zkresleným výsledkům
• Biologický materiál se zpracovává při 0 - 4 °C
• Šetrná desintegrace a homogenizace vzorku
(uvolnění intracelulárních enzymů) ElvehjemPotterův homogenizátor
• Centrifugace, úprava pH, ředění vzorku
• Práce s multienzymovými systémy  zabránění
nežádoucí proteolýzy (přídavek inhibitorů
proteas)
• Skladování v ledničce nebo mrazničce
Podmínky stanovení
• Výsledek stanovení aktivity enzymu je závislý na použité
metodě
• Aktivity enzymů nutno měřit za přesně definovaných
experimentálních podmínek
• Podmínky měření je nutno optimalizovat (nejvhodnější
typ pufru a jeho koncentrace, pH, iontová síla; přídavek
aktivátorů, typ substrátu a jeho koncentrace, objem
vzorku v reakční směsi …)
• Enzymová reakce by měla probíhat pomalu  přeměna
malého množství substrátu  konstantní rychlost reakce
 naředění vzorku enzymu
• Substrát ani pufr nesmí obsahovat kontaminující látky
(detergenty, ionty těžkých kovů ......)
Teplota
• Enzymové reakce jsou citlivé na změny teploty
• Zvýšení teploty o 1 °C  zvýšení katalytické aktivity zhruba o 10 20 %  nutno dodržovat teplotu s přesností vyšší než 0,1 °C
• Teplotní kvocient Q10 (udává, kolikrát se zvýší reakční rychlost,
pokud teplota vzroste o 10 °C; většinou Q10 = 2)
• Standardní teplota pro stanovení  30 °C
• Často používaná teplota 37 ° může vést k postupné denaturaci
enzymu
• Enzymy z extremofilních organismů  odlišné teploty pro stanovení
aktivity
• Každý enzym vykazuje optimální teplotu pro svou aktivitu; její
hodnota závisí na době měření (čím kratší doba stanovení, tím vyšší
optimální teplota)
Teplota ovlivňuje
• Stabilitu enzymu (je vyšší v přítomnosti
substrátu nebo kompetitivního inhibitoru)
• Ionizaci funkčních skupin
• Afinitu substrátu k enzymu (k1 a k-1)
• Rychlost štěpení komplexu ES (kcat)
• Změna pH pufru
• Rozpustnost O2
Optimální teplota enzymu
• Hodnota záleží na
době inkubace
substrátu a enzymu
• Čím je inkubace delší,
tím je optimální
teplota nižší
Tlumivé roztoky a pH
• pH reakční směsi závisí na druhu pufru, iontové
síle a teplotě
• Dostatečně vysoká pufrační kapacita
• Typ pufru ovlivňuje rychlost enzymové reakce
(např. enzym je aktivován Ca2+ ionty  fosfátový
pufr vytvoří obtížně rozpustný fosfát vápenatý 
snížení enzymové aktivity)
• Různé substráty pro jeden enzym  mohou
vyžadovat různé pH
• Různé enzymy vykazují různé pH optimum
Optimální pH enzymu
• Každý enzym vykazuje
maximální aktivitu v
úzkém rozsahu pH (pH
optimum)
• pH optimum často
odráží pH tělní tekutiny
ve kterých se enzym
nachází
• Při reakci mimo pH
optimum se snižuje
enzymová aktivita
Volba substrátu
• Sloučenina přeměňovaná za fysiologických
podmínek
• Syntetický substrát (obvykle levnější, stabilnější,
dobře rozpustný, lépe definovaný...)
• Pokud možno použití co nejvyšší koncentrace
(malá změna koncentrace substrátu v průběhu
reakce)
• Možné problémy při použití přirozených
substrátů (http://www.worthingtonbiochem.com/LY/default.html)
Volba substrátu
Maximum activity
Reaction
Rate
substrate concentration
Substráty pro proteasy
• Přirozené substráty (proteiny)
- rozpustné (kasein, hemoglobin, albumin)
- nerozpustné (kolagen, keratin, fibrin)
• Modifikované přirozené substráty
- chromolytické (azokasein, barvená zesítěná
želatina, barevný fibrin)
• Syntetické substráty
- chromogenní nízkomolekulární substráty
(nitroanilidy, např. TAPA  tosyl-L-arginyl-pnitroanilid); fluorescenční substráty, substráty
značené radionuklidy
Aktivátory
• Přítomnost aktivátorů zvyšuje enzymovou
aktivitu
• Přídavek divalentních iontů
• Přídavek EDTA
• Přídavek sloučenin obsahujících -SH
Přehled metod pro stanovení aktivit
• Využívá se kinetická metoda (metoda založená
na měření reakční rychlosti)
• Reakční rychlost je ovlivněna řadou vnějších
faktorů (pH, teplota, iontová síla, typ substrátu,
typ pufru, přítomnost aktivátoru ...)
• Reakční rychlost je funkcí koncentrace
substrátu, enzymu, aktivátorů a inhibitorů
• Všechny složky reakční směsi (kromě enzymu)
musí být v přebytku  kinetika prvého řádu
Stanovení reakční rychlosti z
průběhu reakce
• Měří se změny koncentrace vybraného
reaktantu (substrát, produkt, kofaktor ...)
jako funkce času
• Strmost této závislosti je úměrná aktivitě
stanovovaného enzymu
• Obvykle se měří změny fyzikálněchemických parametrů jako je pH,
absorbance, fluorescence ..., které se
vynesou do grafu proti času
Citlivost reakce
Citlivost reakce (schopnost detegovat malá množství
enzymu) může být zvýšena prodloužením inkubační doby
2 ug enzyme / ul
[ produkt ]
1 ug enzyme / ul
0
0
čas
Spontánní hydrolýza substrátu
[ PN ]
substrát
“spontánní”
rychlost
produkt
bez enzymu
0
0
time
Klasifikace metod pro stanovení
enzymových aktivit
• Optické - spektrofotometrie
- fluorimetrie
- polarimetrie
- luminiscence
• Manometrické
• Elektrochemické - potenciometrie
- ampérometrie
- polarografie
- konduktometrie
• Radiometrické
• Ostatní - viskozimetrie
- mikrokalorimetrie
- titrace
Spektrofotometrické metody
• Některý z reaktantů nebo produktů má výrazné
absorpční maximum v UV, VIS nebo IR oblasti,
jímž se odlišuje od dalších látek
• Raději měříme přírůstek absorbance
• Snažíme se měřit při takové vlnové délce, kdy
absorbuje pouze jedna složka směsi
• Dáváme přednost měření složky s větším
molárním koeficientem  větší citlivost
• Vhodná instrumentace  dvoupaprskové
přístroje umožňující kontinuální měření, s
možností temperace
Spektrofotometrické metody
• Nejvýznamnejší
aplikace:
NAD+  NADH + H+
Nárůst absorbance při
340 nm
Lamber-Beerův zákon
A=e.c.b
Absorbance (A) = záporný
dekadický logaritmus
poměru zářivého toku
propuštěného k
dopadajícímu
Využití pro kvantitativní analýzu:
1) Při znalosti e: c = A/e.b
2) Kalibrační přímka
A
c
Instrumentace
Fluorescenční metody
• Citlivější než spektrofotometrické metody
• Založeny na tvorbě fluoreskující
sloučeniny v průběhu enzymové reakce
lipasa
dibutyrylfluorescein ---------- > fluorescein + kys. máselná
Fluorescenční metody
• NADH i NADPH vykazují v alkalické oblasti
silnou fluorescenci
• Problém:
- zhášení fluorescence vysoce absorbujícími
molekulami (odnímají energii fluoreskujícím
molekulám  snižují jejich fluorescenci)
- interferující látky fluoreskující ve stejné oblasti
Manometrické techniky
• Reakce při nichž se uvolňuje nebo spotřebovává
plyn
• Objemová změna se převádí na změnu tlakovou
(práce při konstantním objemu)
• Oxidoreduktasy (vývoj nebo spotřeba kyslíku)
• Lyasy (vývoj nebo spotřeba CO2 a NH3)
• Nevýhoda: pracné
• Výhoda: možnost měření v suspenzích, tkáních,
pletivech ...
Elektrochemické stanovení
• Iontově selektivní elektrody
- skleněná elektroda  změna pH (v praxi
se pH udržuje konstatní, pH-statem se
přidává kyselina nebo zásada)
- elektrody měřící obsah plynného kyslíku
(kyslíková elektroda)
- elektrody pro NH3 a CO2
Radiometrické metody
• Substrát značený radionuklidem
• Po reakci je nutno oddělit radioaktivní produkt
od zbylého substrátu (např. vysrážením,
chromatograficky, elektroforeticky, extrakcí
organickým rozpouštědlem, adsorbcí na vhodný
adsorbent...)
• Změření radioaktivity
• Vysoká citlivost stanovení, možnost měření v
kalných roztocích
• Nulové pozadí
Stanovení bílkovin
• Nezbytné pro posouzení specifické aktivity
enzymu
• Sledování průběhu purifikace enzymu
• Nejčastějším standardním proteinem je
hovězí sérový albumin
• Stanovujeme celkové bílkoviny
Stanovení bílkovin
Biuretová metoda
Citlivost
1-20 mg / ml
Interference: některé aminokyseliny,
zwiterionty
Lowryho metoda (595 nm)
Kombinace biuretové reakce a
Folin-Ciocalteau reakce (zahrnuje
reakce tyrosinových zbytků)
Citlivost
10 ug / ml
Zdlouhavost (2 kroky)
Interference: ruší sulfát amonný., glycin,
SH reagenty, EDTA > 0.1 mM
Stanovení bílkovin
562 nm
Bicinchoninát
Citlivost vysoká
1 ug / ml
Pracná metoda – 2 kroky
Interference: ruší EDTA, SH reagenty
Stanovení bílkovin
Posun maxima
Ze 465 na 595 nm
Metoda podle Brafordové
Citlivost vysoká
1 ug / ml
Rychlá metoda (náročná na pečlivost)
Interference: ruší Triton X-100, SDS, silně bazické pufry
Stanovení bílkovin
Absorpce v UV oblasti (Tyr, Try) – 280 nm
Citlivost 50 ug / ml
Velmi rychlá metoda, nedestruktivní
Interference: ruší NK, zákal
C (mg/ml) = A 280
C (mg/ml) = A280/e
C (mg/ml) = 1,55.A280 – 0,76 A260
e (ml/mg)
BSA = 0,63
Ig = 1,38
Ovalbumin = 0,70
Sety pro stanovení enzymových
aktivit
• Výrazné zjednodušení stanovení
• Obsahují všechny potřebné složky, včetně
pufrů a standardů, a návod
• Nejčastěji se využívá spektrofotometrie
• Více než 100 druhů souprav
Automatické analyzátory
• Analýza velkého množství vzorků
• Až 40 analýz v jednom vzorku
Detekce amylasové aktivity
Amylase (-)
Amylase (+)
Agarová plotna se zabudovaným škrobem
Zaočkování testovanými organismy, kultivace
Přelití jodovým roztokem (detekce nerozloženého škrobu)
Jasné zóny indikují rozklad škrobu (amylasa positivní kmeny)
Substrátové desky
• Skleněné desky pokryté
tenkou vrstvou
biopolymeru (zesítěná
želatina, fibrin, škrob,
dextran)
• Využitelné pro detekci
hydrolytických enzymů
(proteasy, amylasy,
dextranasy)
• Použití: detekce enzymů
ve frakcích po kapalinové
chromatografii, v
kultivačních médiích ...
Kde hledat informace?
• Kompendium
Methods of
Enzymatic Analysis
• Editor-in-Chief:
Hans Ulrich Bergmeyer
• Vydavatel:
Verlag Chemie,
Weinheim