Transcript PROTEAZOMY

PROTEAZOMY
Zuzana KAUEROVÁ
4.r. biochemie
2004/2005
1. Když se řekne proteazom

Velké membránové multipodjednotkové
komplexy, obsahující proteázy
 Hlavní úkol: degradace intracelulárních
proteinů
 Výskyt: jádro a cytoplazma nejen u
eukaryotních buněk, ale i u archebakterií
(Thermoplasma acidofillum)
1.1. Historie

Poprvé objeveny americkými vědci
Sherwinem Wilkem a Marianem
Orlowskim, členy farmakologické fakulty
Mount Sinai School of Medicine v roce
1980, jako komplexy endopeptidáz,
izolované ze srdce pacienta postiženého
hypertrofií srdce
V roce 1988 vědec Arrigo prokázal, že
tento systém proteáz, nazývaný dosud MPC
(multikatalytický proteázový komplex) je
identický s již objevenou částicí –
prozomem (objeven německou skupinou
Klause Scherrera)
 Prozom přejmenován na oficiální název
proteazom

1.2. Hlavní funkce





Odstraňují abnormální proteiny z buňky
Podílejí se na reakcích na stresové situace
degradací proteinů, označených ubikvitinem
(Ub)
Jako součást Ub systému se zapojují do
regulace buněčných procesů
Kontrolují diferenciaci buněk (degradují
transkripční faktory a metabolické enzymy)
Velkou roli hrají v imunitním systému, kde
vytváří peptidy MHC glykoproteinů I. třídy
2. Proteinová degradace
Nově objevený mechanizmus buněčné
regulace
 Hlavní výhoda proteolýzy – rychlost,
umožňující buňce rapidní redukci hladiny
určitých proteinů
 Nevratný děj – kompletní ztráta funkcí
 Základní požadavek: vysoká specifita

2.1. Ubikvitinace
Nejobecnější způsob označování proteinů k
degradaci v proteazomech
 Připojení řetězce ubikvitinu o 76 aminokyselinách
 Katalýza:
- E1 aktivující enzymy
- E2 konjugační enzymy
- E3 vazebné enzymy (pouze v některých
případech)


Proces degradace s
ubikvitinem:
Ubikvitin je aktivován vytvořením
thiosterové vazby s aktivačním
enzymem E1. Ubikvitin je pak
přenesen do aktivní cysteinové
skupiny konjugačního enzymu
E2, který ubikvitin naváže na
aminoskupinu zbytku lyzinu
substrátového proteinu. Pro tento
proces je v některých případech
nutná kooperace s enzymem E3.
Opakovaná konjugace ubikvitinu
s lyzinovými zbytky vede ke
vzniku multiubikvitinových
řetězců, které, navázané na
substrátový protein, jsou
rozeznány a degradovány v
proteazomech. Multiubikvitinový
řetězec se uvolní z komplexu a
ubikvitin je recyklován.
http://www.cytomics.fr/html_uk/m2_1.html
2.2. Další způsoby označení
proteinů k degradaci
„PEST sekvence“ = degradační signály
(obsah v prolinu, kys. aspartové a
glutamové, serinu a threoninu)
Vymazání PEST sekvence => stabilita
 Neoznačené proteiny obsahují „destrukční
boxy“ – silně zakonzervované
aminokyseliny, navozující signál k
degradaci

3. Struktura proteazomů
2 části:
 20S proteazom jádrem větší částice 26S
proteazomu
 Oba komplexy existují v dynamické
rovnováze
 Hlavní rozdíl: 26S proteazom degraduje
ubikvitinované proteiny, 20S proteazom
ne

3.1. 20S proteazom
3.1.A Struktura
Často demonstrován na 26S proteazomu
archebakterie Thermoplasma acidofillum – téměř
identické s 20S proteazomy všech eukaryot
 Dutý cylindr, molekulová hmotnost 700 kDa
 Velké množství nízkomolekulárních podjednotek
(25 – 35 kDa), 2 typy:
αaβ
 Uspořádány do 4 prstenců, každý o 7
podjednotkách

Délka cylindru – 148 podjednotek (15 nm)
Výška cylindru – 113 podjednotek (11 nm)
 Vytváří kanál se 3 velkými výdutěmi (šířka 0,13
nm):
1. Dvě vnější výdutě na povrchu formovány α a β
prstenci
2. Centrální výduť formována beta prstenci =
centrum proteolytické aktivity
Přístup do tohoto centra kontrolován 4 úzkými
bránami (vnější brána, která je vytvářena α
podjednotkami, propouští pouze otevírající se
113ti jednotkový průměr)

 RRozdíly mezi α a β podjednotkami minimální
 PPouze: α podjednotka vytváří strukturu α helixu
napříč vrchní částí = součást výdutě, napomáhá
transportu substrátových proteinů do centrálního
kanálu
 NNezralá β podjednotka obsahuje N-terminální
konec (Thr), který ji inaktivuje (funguje jako
samostatná jednotka) => odstřihnutím =>
proteolyticky aktivní (ochrana před neadekvátní
proteolýzou v cytoplazmě)
Obr.: Proteazom na gelu a v elektronovém mikroskopu
http://delphi.phys.univ-tours.fr/Prolysis/proteasome.html
3.1.B Funkce

20S proteazom je jádrem proteinové
degradace
 Reprezentuje unikátní typ proteáz –
threonin proteázu
 Působí při degradaci řetězce A a B
v inzulínu
 Oxiduje proteiny in vitro
 Veškeré procesy katalýzy probíhají
uvnitř komplexu beta podjednotek
3.2. 26S proteazom
3.2.A Struktura

Na rozdíl od 20S proteazomů, které in vitro
degradovaly pouze určité proteiny denaturací či
oxidací za nepřítomnosti ATP, 26S proteazomy
degradují ubikvitinové konjugáty v reakci
závislé na ATP
 26 proteazom = velký proteázový komplex, cca
1700kDa
 Struktura typická jako pro 20S proteazom, ale se
dvěma přídavnými podstrukturami navázánými na
oba konce = 19S části , tzv. „víčka“
3.2.B 19S struktura

Asociována s 20S proteazomy na ATP závislým
způsobem
 19S víčka jsou prostředníkem mezi ubikvitinovým
systémem a 26S proteazomem
 Složena z 20 různých podjednotek (25 – 110 kDa)
 Dosud přesně určeno pouze 6 podjednotek 19S
struktury s ATPázovou aktivitou, které vytváří
prstenec, sousedící s výdutí, ohraničenou α
podjednotkami
3.2.C Funkce 19S víček
Slouží k zachycení a přitáhnutí označeného
proteinu do proteazomu
 Hydrolýza ATP je spojena se vstupem
označeného proteinu do proteolytického
centra, přesný mechanizmus však není
znám
 19S struktura se nevyskytuje u
archebakterií, typický pouze pro eukaryota

3.2.D Funkce 26S proteazomu
Plní životně důležité funkce:

kontrola buněčného cyklu
 buněčná diferenciace
 regulace metabolických drah
 role ve stresových situacích
 odstraňování abnormálních proteinů
Kontrola buněčného cyklu

Cyklus dělení eukaryotických buněk kontrolován
cyklin-dependentními protein kinázami (CDK)
 Vznik a zánik dílčích aktivovaných kinázových
komplexů během různých fází buněčného cyklu
regulován syntézou a proteolytickou degradací
specifických cyklinů v proteazomech
 Inhibitory CDK jsou také kontrolovány
proteolytickou destrukcí: cyklinová degradace
potřebná pro zastavení aktivace CDK, proteolýza
CDK inhibitorů => přepnutí CDK aktivity
Stresová odpověď imunitního
systému
Prostřednictvím NF-B = regulátor transkripce
velkého množství genů, zapojujících se do
imunitních a zánětlivých reakcí
 Tyto geny kódují zánětlivé a chemotaktické
cytokiny, hematopoetické růstové faktory,
adhezivní molekuly, protilátky, MHC
glykoproteiny I. třídy a receptory pro cytokiny
 NF-B silně regulovaný a aktivovaný širokou
směsicí většinou patogenních stimulů (např. viry,
bakteriemi, energeticky bohatou radiací, oxidanty
a zánětlivými cytokiny TNF- a IL-1)



1.
2.
V aktivní formě je NF-B heterodimerní
komplex, 2 podjednotky:
p50 podjednotky (NF-B1) a p65
podjednotky (Re1A)
=> inaktivace dvěma různými mechanizmy:
asociace proteinového inhibitoru I-B s p50p65 komplexem
syntéza NF-B1 - prekurzorového 105ti
kilodaltonového proteinu, který se sice může
kompletovat s p65 podjednotkou, ale nevytváří
aktivní komplex.

Proteazomy jsou zodpovědné za aktivaci
NF-B degradací proteinu I-B a
převedením 105ti kilodaltonového
prekurzoru NF-B na p50 aktivní formu
 Proteazomy tedy nejsou pouze zodpovědné
za kompletní degradaci proteinů, ale také
jsou nezbytné pro aktivaci proteinů při
procesu aktivace prekurzorů.
Antigenní prezentace

Proteazomy mohou syntetizovat krátké peptidové
fragmenty => prezentovány na povrchu lymfocytů
v MHC komplexu glykoproteinů
 Hrají důležitou roli ve schopnosti buněk reagovat
na stresové situace
 V buňkách imunitního systému jsou některé β
podjednotky nahrazeny gamma-interferon
indikačními homology, které zvyšují efektivnost
degradace v proteazomech (struktura téměř stejná)
4. ZÁVĚR

Proteazomy mohou být považovány za funkčně
propracované doplňky ribozomů. Regulace
hladiny proteinů destrukcí prostřednictvím
proteazomů je nezbytný nástroj buňky. Je zřejmé,
že několik dodnes objevených substrátů
v proteazomech reprezentují pouze špičku
ledovce. Přesto jsou však velkou výzvou k objevu
všech
buněčných
procesů,
které
se
v proteazomech odehrávají, stejně tak jako detailní
mechanizmy, zdůrazňující tyto selektivní procesy.