Transcript PROTEAZOMY
PROTEAZOMY
Zuzana KAUEROVÁ
4.r. biochemie
2004/2005
1. Když se řekne proteazom
Velké membránové multipodjednotkové
komplexy, obsahující proteázy
Hlavní úkol: degradace intracelulárních
proteinů
Výskyt: jádro a cytoplazma nejen u
eukaryotních buněk, ale i u archebakterií
(Thermoplasma acidofillum)
1.1. Historie
Poprvé objeveny americkými vědci
Sherwinem Wilkem a Marianem
Orlowskim, členy farmakologické fakulty
Mount Sinai School of Medicine v roce
1980, jako komplexy endopeptidáz,
izolované ze srdce pacienta postiženého
hypertrofií srdce
V roce 1988 vědec Arrigo prokázal, že
tento systém proteáz, nazývaný dosud MPC
(multikatalytický proteázový komplex) je
identický s již objevenou částicí –
prozomem (objeven německou skupinou
Klause Scherrera)
Prozom přejmenován na oficiální název
proteazom
1.2. Hlavní funkce
Odstraňují abnormální proteiny z buňky
Podílejí se na reakcích na stresové situace
degradací proteinů, označených ubikvitinem
(Ub)
Jako součást Ub systému se zapojují do
regulace buněčných procesů
Kontrolují diferenciaci buněk (degradují
transkripční faktory a metabolické enzymy)
Velkou roli hrají v imunitním systému, kde
vytváří peptidy MHC glykoproteinů I. třídy
2. Proteinová degradace
Nově objevený mechanizmus buněčné
regulace
Hlavní výhoda proteolýzy – rychlost,
umožňující buňce rapidní redukci hladiny
určitých proteinů
Nevratný děj – kompletní ztráta funkcí
Základní požadavek: vysoká specifita
2.1. Ubikvitinace
Nejobecnější způsob označování proteinů k
degradaci v proteazomech
Připojení řetězce ubikvitinu o 76 aminokyselinách
Katalýza:
- E1 aktivující enzymy
- E2 konjugační enzymy
- E3 vazebné enzymy (pouze v některých
případech)
Proces degradace s
ubikvitinem:
Ubikvitin je aktivován vytvořením
thiosterové vazby s aktivačním
enzymem E1. Ubikvitin je pak
přenesen do aktivní cysteinové
skupiny konjugačního enzymu
E2, který ubikvitin naváže na
aminoskupinu zbytku lyzinu
substrátového proteinu. Pro tento
proces je v některých případech
nutná kooperace s enzymem E3.
Opakovaná konjugace ubikvitinu
s lyzinovými zbytky vede ke
vzniku multiubikvitinových
řetězců, které, navázané na
substrátový protein, jsou
rozeznány a degradovány v
proteazomech. Multiubikvitinový
řetězec se uvolní z komplexu a
ubikvitin je recyklován.
http://www.cytomics.fr/html_uk/m2_1.html
2.2. Další způsoby označení
proteinů k degradaci
„PEST sekvence“ = degradační signály
(obsah v prolinu, kys. aspartové a
glutamové, serinu a threoninu)
Vymazání PEST sekvence => stabilita
Neoznačené proteiny obsahují „destrukční
boxy“ – silně zakonzervované
aminokyseliny, navozující signál k
degradaci
3. Struktura proteazomů
2 části:
20S proteazom jádrem větší částice 26S
proteazomu
Oba komplexy existují v dynamické
rovnováze
Hlavní rozdíl: 26S proteazom degraduje
ubikvitinované proteiny, 20S proteazom
ne
3.1. 20S proteazom
3.1.A Struktura
Často demonstrován na 26S proteazomu
archebakterie Thermoplasma acidofillum – téměř
identické s 20S proteazomy všech eukaryot
Dutý cylindr, molekulová hmotnost 700 kDa
Velké množství nízkomolekulárních podjednotek
(25 – 35 kDa), 2 typy:
αaβ
Uspořádány do 4 prstenců, každý o 7
podjednotkách
Délka cylindru – 148 podjednotek (15 nm)
Výška cylindru – 113 podjednotek (11 nm)
Vytváří kanál se 3 velkými výdutěmi (šířka 0,13
nm):
1. Dvě vnější výdutě na povrchu formovány α a β
prstenci
2. Centrální výduť formována beta prstenci =
centrum proteolytické aktivity
Přístup do tohoto centra kontrolován 4 úzkými
bránami (vnější brána, která je vytvářena α
podjednotkami, propouští pouze otevírající se
113ti jednotkový průměr)
RRozdíly mezi α a β podjednotkami minimální
PPouze: α podjednotka vytváří strukturu α helixu
napříč vrchní částí = součást výdutě, napomáhá
transportu substrátových proteinů do centrálního
kanálu
NNezralá β podjednotka obsahuje N-terminální
konec (Thr), který ji inaktivuje (funguje jako
samostatná jednotka) => odstřihnutím =>
proteolyticky aktivní (ochrana před neadekvátní
proteolýzou v cytoplazmě)
Obr.: Proteazom na gelu a v elektronovém mikroskopu
http://delphi.phys.univ-tours.fr/Prolysis/proteasome.html
3.1.B Funkce
20S proteazom je jádrem proteinové
degradace
Reprezentuje unikátní typ proteáz –
threonin proteázu
Působí při degradaci řetězce A a B
v inzulínu
Oxiduje proteiny in vitro
Veškeré procesy katalýzy probíhají
uvnitř komplexu beta podjednotek
3.2. 26S proteazom
3.2.A Struktura
Na rozdíl od 20S proteazomů, které in vitro
degradovaly pouze určité proteiny denaturací či
oxidací za nepřítomnosti ATP, 26S proteazomy
degradují ubikvitinové konjugáty v reakci
závislé na ATP
26 proteazom = velký proteázový komplex, cca
1700kDa
Struktura typická jako pro 20S proteazom, ale se
dvěma přídavnými podstrukturami navázánými na
oba konce = 19S části , tzv. „víčka“
3.2.B 19S struktura
Asociována s 20S proteazomy na ATP závislým
způsobem
19S víčka jsou prostředníkem mezi ubikvitinovým
systémem a 26S proteazomem
Složena z 20 různých podjednotek (25 – 110 kDa)
Dosud přesně určeno pouze 6 podjednotek 19S
struktury s ATPázovou aktivitou, které vytváří
prstenec, sousedící s výdutí, ohraničenou α
podjednotkami
3.2.C Funkce 19S víček
Slouží k zachycení a přitáhnutí označeného
proteinu do proteazomu
Hydrolýza ATP je spojena se vstupem
označeného proteinu do proteolytického
centra, přesný mechanizmus však není
znám
19S struktura se nevyskytuje u
archebakterií, typický pouze pro eukaryota
3.2.D Funkce 26S proteazomu
Plní životně důležité funkce:
kontrola buněčného cyklu
buněčná diferenciace
regulace metabolických drah
role ve stresových situacích
odstraňování abnormálních proteinů
Kontrola buněčného cyklu
Cyklus dělení eukaryotických buněk kontrolován
cyklin-dependentními protein kinázami (CDK)
Vznik a zánik dílčích aktivovaných kinázových
komplexů během různých fází buněčného cyklu
regulován syntézou a proteolytickou degradací
specifických cyklinů v proteazomech
Inhibitory CDK jsou také kontrolovány
proteolytickou destrukcí: cyklinová degradace
potřebná pro zastavení aktivace CDK, proteolýza
CDK inhibitorů => přepnutí CDK aktivity
Stresová odpověď imunitního
systému
Prostřednictvím NF-B = regulátor transkripce
velkého množství genů, zapojujících se do
imunitních a zánětlivých reakcí
Tyto geny kódují zánětlivé a chemotaktické
cytokiny, hematopoetické růstové faktory,
adhezivní molekuly, protilátky, MHC
glykoproteiny I. třídy a receptory pro cytokiny
NF-B silně regulovaný a aktivovaný širokou
směsicí většinou patogenních stimulů (např. viry,
bakteriemi, energeticky bohatou radiací, oxidanty
a zánětlivými cytokiny TNF- a IL-1)
1.
2.
V aktivní formě je NF-B heterodimerní
komplex, 2 podjednotky:
p50 podjednotky (NF-B1) a p65
podjednotky (Re1A)
=> inaktivace dvěma různými mechanizmy:
asociace proteinového inhibitoru I-B s p50p65 komplexem
syntéza NF-B1 - prekurzorového 105ti
kilodaltonového proteinu, který se sice může
kompletovat s p65 podjednotkou, ale nevytváří
aktivní komplex.
Proteazomy jsou zodpovědné za aktivaci
NF-B degradací proteinu I-B a
převedením 105ti kilodaltonového
prekurzoru NF-B na p50 aktivní formu
Proteazomy tedy nejsou pouze zodpovědné
za kompletní degradaci proteinů, ale také
jsou nezbytné pro aktivaci proteinů při
procesu aktivace prekurzorů.
Antigenní prezentace
Proteazomy mohou syntetizovat krátké peptidové
fragmenty => prezentovány na povrchu lymfocytů
v MHC komplexu glykoproteinů
Hrají důležitou roli ve schopnosti buněk reagovat
na stresové situace
V buňkách imunitního systému jsou některé β
podjednotky nahrazeny gamma-interferon
indikačními homology, které zvyšují efektivnost
degradace v proteazomech (struktura téměř stejná)
4. ZÁVĚR
Proteazomy mohou být považovány za funkčně
propracované doplňky ribozomů. Regulace
hladiny proteinů destrukcí prostřednictvím
proteazomů je nezbytný nástroj buňky. Je zřejmé,
že několik dodnes objevených substrátů
v proteazomech reprezentují pouze špičku
ledovce. Přesto jsou však velkou výzvou k objevu
všech
buněčných
procesů,
které
se
v proteazomech odehrávají, stejně tak jako detailní
mechanizmy, zdůrazňující tyto selektivní procesy.