Transcript Stanovení metanefrinů v plazmě vysokoúčinnou kapalinovou

Stanovení metanefrinů v plazmě
vysokoúčinnou kapalinovou
chromatografií
(G.Eisenhofer, Clinical Neurochemistry laboratory, NIH, Bethesda, USA)
Alice Vránková
Laboratoř endokrinologie a metabolismu ÚLBLD - VFN a III.interní
kliniky 1. LF UK, Praha, Česká Republika
Dieta a odběr vzorku před stanovením
Interferující medikace:
- Acetaminofen v jakékoli formě (např. Tylenol, Paralen, Excedrin a kombinované léky proti
nachlazení).
- Léky obsahující katecholaminy a jejich deriváty (např. α-methyldopa, α- methyl-para-tyrosin,
isoproterenol, dobutamin, carbidopa).
- Interferují rovněž některá antidepresiva.
Interferující potraviny:
- Kofein (káva, čaj a další povzbuzující nápoje).
Odběr krve:
Odběr krve ráno, nalačno, kanylou. (Kanyla se zavádí nejméně 15 min před odběrem, ležícímu
pacientovi - omezení stresu).
Po 15i minutách - proplach kanyly heparinem nebo fyziologickým roztokem
- odběr do odpadní zkumavky (odstranění heparinu)
- vlastní odběr - zkumavka s heparinem (Vacutainer zelená)
- zkumavka s EDTA (Vacutainer fialová)
Zkumavky před odběrem je vhodné předchladit, po odběru obložit ledem a do dvou hodin
zcentrifugovat.
Laboratoř:
Centrifugace při 4°C, odběr plazmy do plastové zkumavky, zmrazení (-80°C).
Extrakce analytů z plazmy
Extrakční kolonky je nutné nejdříve aktivovat a promýt 10% hydroxidem amonným a 2 ml 1%
hydroxidu draselného v methanolu a poté 2 ml vody.
Poté je možné uvést 0,5 ml plazmy na kolonku se standardními vzorky. Současně se na
všechny kolonky uvádí vnitřní standard (IS) HMBA v množství 2 ng (74 nmol.l-1) na kolonku.
Dalším krokem je promytí extrakčních kolonek 2 ml 10 mmol.l-1 kyseliny octové v methanolu,
poté 2 ml 20 mmol.l-1 fosforečnanu amonného o pH 8,5 a nakonec 2 ml vody.
Analyty zadržené na kolonkách nakonec eluujeme 2 ml 10% hydroxidu amonného v
methanolu.
Eluát odpařujeme ve vakuové odparce a odparek rozpustíme ve 150 µl mobilní fáze (MF).
Takto připravený roztok nakonec dávkujeme na kolonu kapalinového chromatografu.
HPLC stanovení
Standardy: NMN ((±) normetanefrin hydrochlorid), MN ((±) metanefrin hydrochlorid)
a HMBA (4-hydroxy-3-methoxybenzylamin-hydrochlorid)
používaný jako vnitřní standard (Sigma-Aldrich, St.Louis, USA)
Chromatografie: HPLC systém Agilent 1100 složený z odplyňovače G1379A,
kvartérní pumpy G1311A, autosampleru G1329A,
termostatu autosampleru G1330B, termostatu kolony G 1316A (Agilent Technologies,
Wilmington, USA)
Detektor a analytická kolona: Elektrochemický (coulometrický) detektor,Coulochem III (ESA, Chelmsford, USA), coulometrické cely (ESA, Chelmsford, USA
(excl.zast.Radanal)), předkolona SecurityGuard [4,0x3,0 mm] a analytická kolona C18,
velikost částic 5 µm, [250x4,6 mm] (Phenomenex, Torrance, USA)
Mobilní fáze (MF): 88 mM NaH2PO4. 2H2O, 590 µM oktan sulfonát, 27 µM EDTA,
CH3CN: deionizovaná H2O
(7,5 : 100), pH 3,25
Vybrané publikace a prezentace
Původní články:
ZELINKA, Tomáš; ŠTRAUCH, Branislav; PETRÁK, Ondřej; HOLAJ, Robert; VRÁNKOVÁ, Alice, et al.
Increased blood pressure variability in pheochromocytoma compared to essential hypertension patients.
Journal of Hypertension. 2005, 23, s. 2033-2039.
WIDIMSKÝ, Jiří Jr; ZELINKA, Tomáš; PETRÁK, Ondřej; ŠTRAUCH, Branislav; ŠAFAŘÍK, Libor;
KASALICKÝ, Mojmír; VRÁNKOVÁ, Alice; HOLAJ, Robert. Regrese intimo - mediální tloušťky
společné karotidy u nemocných po operaci feochromocytomu. Vnitřní lékařství. 2007, 53, 4, s. 428-433.
HOLAJ, Robert; ZELINKA, Tomáš; PETRÁK, Ondřej; ŠTRAUCH, Branislav; WICHTERLE, Dan;
VRÁNKOVÁ, Alice; et al. Increase carotid intima-media thickness in patients with pheochromocytoma in
comparison to essential hypertension. Journal of Human Hypertension. 2009, 23, 5, s. 350-358.
VRÁNKOVÁ, Alice; ŠKRAMLÍKOVÁ, Tereza; WIDIMSKÝ, Jiří Jr; ZELINKA, Tomáš; et al.
Determination of Metanephrine and Normetanephrine in Blood Plasma by HPLC with Electrochemical
Detection. Chemické Listy. 2010, 104, s. 251-256.
VRÁNKOVÁ, Alice; ŠKRAMLÍKOVÁ, Tereza; WIDIMSKÝ, Jiří Jr; ŠKRHA, Jan; JŮZOVÁ, Zdenka.
Porovnání výsledků HPLC metod na stanovení metanefrinu a normetanefrinu z moče a z krevní plazmy
vzhledem k diagnostice tumoru feochromocytomu. Chemické Listy. 2010, 104, 16, s. 784-787.
Abstrakta k posterovým sdělením:
VRÁNKOVÁ, Alice; JŮZOVÁ, Zdenka; WIDIMSKÝ, Jiří Jr; ZELINKA, Tomáš; ŠKRHA, Jan.
Příprava metody stanovení volných plazmatických metanefrinů vysokoúčinnou kapalinovou
chromatografií s elektrochemickou detekcí. Chemické Listy. 2006, 100, 8, s. 605.
VRÁNKOVÁ, Alice; JŮZOVÁ, Zdenka; WIDIMSKÝ, Jiří Jr; ZELINKA, Tomáš; ŠKRHA, Jan.
Stanovení plazmatických katecholaminů vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií s
elektrochemickou detekcí. FONS. 2006, s. 127. (Ocenění posterového sdělení)
VRÁNKOVÁ, Alice; JŮZOVÁ, Zdenka; WIDIMSKÝ, Jiří Jr; ZELINKA, Tomáš; ŠKRHA, Jan.
Příprava metody stanovení volných plazmatických metanefrinů vysokoúčinnou kapalinovou
chromatografií s elektrochemickou detekcí. Chemické zvesti. 2007, 1, 3, s. 162.
VRÁNKOVÁ, Alice; JŮZOVÁ, Zdenka; WIDIMSKÝ, Jiří Jr; ZELINKA, Tomáš; ŠKRHA, Jan.
Stanovení volných plazmatických metanefrinů vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií
s elektrochemickou detekcí. Klinická Biochemie a metabolismus. 2007, 15, s. 84.
VRÁNKOVÁ, Alice; JŮZOVÁ, Zdenka; WIDIMSKÝ, Jiří Jr; ZELINKA, Tomáš; ŠKRHA, Jan.
Determination of plasma metanefrines by HPLC-EC. Vitamins 2007 Nutrition and diagnostics. The
abstract book. 2007, s. 154-155.
PETRÁK, Ondřej; ŠTRAUCH, Branislav; ZELINKA, Tomáš; ROSA, Ján; HOLAJ, Robert;
VRÁNKOVÁ, Alice. Influence of Catecholamines on Arterial Stiffness in Pheochromocytoma. Artery
Research. 2007, 1, 2, s. 62-63.
Příprava na program TIP - Katecholaminy:
Vzorky plazmy:
Počet vzorků změřené plazmy od pacientů s normálními hodnotami NMN a MN:
905
Počet vzorků změřené plazmy od pacientů s vysokými (patologickými) hodnotami NMN a MN:
65
3 – Methoxytyramin:
T yrosin
THL
DOPA
L-ADC
COMT
Dopamin
MAO
DBH
Noradrenalin
COMT
COMT
Homovanilmandelát
Adrenalin
COMT
MAO
3-Methoxytyramin 3,4-dihydroxyfenylacetát Normetanefrin
MAO
PNMT
MAO
3,4-dihydroxymandelát Metanefrin
COMT
Vanilmandelát
MAO