Transcript Stanovení katecholaminů vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií

Stanovení katecholaminů vysokoúčinnou
kapalinovou chromatografií
RNDr. Alice Vránková
Laboratoř endokrinologie a metabolismu ÚKBLD a III.interní kliniky
1. LF UK, Praha, Česká Republika
Katecholaminy a jejich metabolismus
-
Alkylamino deriváty O-dihydroxybenzenu (adrenalin, noradrenalin a dopamin)
V organismu fungují jako neurotransmitery (nervový systém, mozek) a hormony
tvořené dření nadledvin
Biosyntéza probíhá v
mozku, dřeni nadledvin,
extraadrenální chromafinní
tkáni a sympatických
nervových zakončeních
THL
L-ADC
DBH
PNMT
Tyrosin → L- DOPA → Dopamin → Noradrenalin → Adrenalin
COMT
MAO
COMT
MAO
COMT
3-methoxytyramin 3-hydroxyfenyloctová Normetanefrin 3,4-dihydroxymandlová Metanefrin
kyselina
kyselina
MAO
COMT
MAO
Homovanilmandlová
kyselina
COMT
MAO
Vanilmandlová
kyselina
Proč se katecholaminy stanovují?
-
Důvodem sledování je zjištěná souvislost mezi zvýšenou koncentrací
katecholaminů a jejich metabolitů v moči a v plazmě a výskytem nádoru
feochromocytomu
-
Feochromocytom sekretuje katechoaminy
-
Vědecké studie uvádí vysokou senzitivitu testu stanovení volných metanefrinů
vzhledem k feochromocytomu
diagnostické markery
Dieta a odběr vzorku před stanovením
Stanovení katecholaminů z plazmy:
-
Odběr krve nalačno, 2 dny před odběrem omezené užívání určitých léků,
nepít kávu a čaj (kofein)
-
Zavedena kanyla 15 min před odběrem → proplach kanyly heparinem
(fyziolog. roztokem) → odběr do odpadní zkumavky → odběr do
zkumavky s heparinem nebo EDTA → chlazení ledem → odstředění v
chlazené centrifuze → odběr plazmy
Stanovení katecholaminů z moči:
-
-
14 dní před sběrem moči omezené užívání léků, 2 dny před sběrem moči
nepít kávu, čaj, vyvarovat se alkoholu, citrusových plodů, zeleniny, ořechů
a dalších potravin obsahujících látky interferující na chromatogramu,
pacient omezí příjem tekutin na max. 2 l
24 h sběr moči do nádoby obsahující 10 ml 12. 5 % HCl. Nejdříve odběr
do odpadu, poté 24 h sběr, uchování v chladu
Co předchází chromatografickému stanovení?
Stanovení katecholaminů z plazmy:
-
Aplikace plazmy spolu s vnitřním standardem (IS) na Al2O3 sorbent (adsorbce
katecholaminů)
-
Třepání, odstředění, promytí promývacím činidlem (odstranění matrice a
nežádoucích příměsí)
-
Třepání, odstředění, eluce (uvolnění) analytů ze sorbentu elučním činidlem
-
Aplikace na kolonu HPLC
Stanovení katecholaminů z moči:
-
pH upraveno na 3. 5 - 4, centrifugace, přídavek IS
-
Automatická dvoukolonová metoda: Nástřik → MFe o vysokém pH →
extrakční kolona s obsahem kyseliny fenylborité (zachycení analytů a
vyplavení nečistot) → MFe o nízkém pH (eluce) → analytická kolona
(separace)
HPLC stanovení
HPLC = High performance liquid chromatography = Vysokoúčinná
kapalinová chromatografie (též vysokotlaká)
-
Rozdělení analytů mezi dvě nemísitelné fáze (mobilní /MF/ a stacionární /SF/)
na základě fyzikálně-chemických interakcí
-
MFe protéká konstantní rychlostí systémem, SFe je umístěna v koloně
-
Rozdělení látek pohybujících se v MFi na jednotlivé zóny podle síly interakce
se SFí (eluční křivky - píky)
Detektory - měří určitou fyzikálně-chemickou vlastnost závislou na
koncentraci
-
Detektor pro stanovení plazmatických katecholaminů: coulochemický (měří
náboj přenesený při elektrochemické reakci)
-
Detektor pro stanovení močových katecholaminů: fluorescenční (využití
přirozené fluorescence sledovaných látek)
Chromatogram
Chromatogram = chromatografický záznam - výstup z chromatografického systému
Počítač převede analogový signál detektoru na digitální výstup ploch píků
15
9.
96
4
Ar
DA
ea
:
Standard
10
19.368
FLD1 A, Ex=275, Em=320 (KAT1406\002-0201.D)
LU
9
NA
A13.899
re
a:
62
.2
79
1
8
7
DHBA
6
A16.853
re
a:
32
.1
99
5
HMBA
A
Area:62.2791
A14.738
re
a:
16
.3
94
7
5
4
3
2
13
14
15
16
17
18
19
20 min
97
0.
94
8
Pacient s feochromocytomem
ea
:
NA
Ar
40
13.972
FLD1 A, Ex=275, Em=320 (KAT1209\023-0101.D)
LU
35
30
Area:970.948
25
DA
15
DHBA
A
HMBA
5
14
15
A17.085
re
a:
29
.4
43
6
A14.926
re
a:
23
.1
55
6
10
A19.625
re
a:
21
6.
42
20
16
17
18
19
20
min
Nestresujte se, ať máte
katecholaminy v
normě !
Děkuji Vám za pozornost