Transcript suspenzní buněčné kultury final

Suspenzní kultury
Způsoby kultivace rostlinných pletiv
a buněk na tekutých médiích?
stacionární (můstky, buničitá vata,
čedičová vata, polyuretanová pěna,
membrány apod.)
provzdušňovaná
• - řepačky
• - klinostaty
• - míchaná
• - probublávaná
Rostou a dělí se několikanásobně
rychleji než kultury na pevných
médiích
Využití:
• jako experimentální model
• K produkci sekundárních metabolitů
• K indukci somaklonální variability a
následné selekci
• K mikropropagaci (pod kontrolou
genetické stability)
Měření a regulace průběhu
procesu v bioreaktorech
Během procesu se měří F a FCH činitele:
• fyzikální: teplota, tlak páry, vody a stlačeného vzduchu,
příkon, tvorba a množství pěny, průtok plynů a kapalin
• fyzikálně-chemické: pH, redox potenciál, množství
rozpuštěného kyslíku (kyslíková elektroda), chemické
činitele (měření koncentrace stimulátorů a inhibitorů
růstu nebo tvorby produktů – C, N, P, S, Mg, K, Na , Fe,
regulátory růstu, prekursory…, měření koncentrace NH4+,
Mg2+, Na+, Ca2+ PO43- atd. specifickými elektrodami)
Možnost ovlivnění tvorby
sekundárních metabolitů
• Elicitory
– abiotické: např. Methyljasmonát (MeJA),
polyethylenglykol (PEG)
– Biotické: buněčné stěny bakterií
• Prekursory
• Adsorbenty
mikropropagace
Zařízení pro speciální kultivační režimy
(Inkubátory, třepačky, rolery,
bioreaktory)
Inkubovaná třepačka
• Amplituda
• otáčky (rpm)
Roller
• Pomalé šetrné otáčení
• 5-60 revolution per
•
hour (do 1 rpm)
jen pro buňky,
ulpívající na stěnách
nádoby
Kultivační láhev s míchadlem
• Pro suspenzní kultury
• 100-250 rpm
• 1-12 litrů (Techne,
Sigma)
bioreaktor
20l - Panax ginseng
za 8 týdnů 200x
Sung Ho Son, Korea
Bioreaktory firmy VitroSys Inc. Korea
- kapacita 20000litrů (20t) (celkem
160000litrů)
Ideální suspenzní kultury
• Vysoký stupeň separace buněk (+auxiny,
•
•
•
•
•
- vitamíny)
Homogenní morfologie buněk
Zřetelná jádra a hustá základní cytoplazma
buněk
Malý výskyt diferencovaných pletiv (tracheální
elementy)
Rychlý nástup zdvojení populace (24-72 hod)
Karyologická stabilita
Vznik
• Z kalusu
• Z homogenizovaných diferencovaných
pletiv
• Z protoplastů
Růstová křivka
•
•
•
•
•
•
Lag-fáze
Fáze zrychleného růstu
Exponenciální (logaritmická) fáze
Fáze zpomalujícího růstu
Stacionární fáze růstu
Fáze postupného odumírání
• Exponencionální růst kultury – z technologického hlediska
nejvýhodnější, časově omezený
• Jednorázová kultivace  vyčerpání živin, zpomalení růstu
• Kontinuální kultivace - prodloužení exponencionální fáze
ustálený stav

Inokulace/ rychlost růstu
• Minimálně 103 /ml buněk
• 1/10 suspenze v exponenciální fázi se doplní
•
čerstvým médiem
Koncentrace sacharidů prodlužuje periodu růstu
Sledování suspenzních kultur
• sledování změn pH
• spotřeba kyslíku
• Vodivost média
• Růst
• Životnost
• Genetická stabilita
• kontaminace
Sledování růstu
• hmotnost buněk (čerstvá a sušina)
• Množství buněk (ošetření pektinázou –
•
Bürkerova komůrka)
Podíl objemu buněk a média
– (pocket cell volume) 10 min při 100rpm
– (sedimented cell volume) 30 min
• Obsah proteinů nebo RNA (µM na počet buněk)
• Analýza obrazu
Počítání buněk
v suspenzi
• Bürkerovu počítací komůrku přikryjte krycím sklíčkem, jehož
•
•
•
•
okraje musí pevně přilnout k podkladu
Pipetou odeberte 10 µl suspenze buněk a kápněte ji ke
hranám krycího sklíčka po obou stranách (tedy 2 x 10 µl).
Vzorek nejprve prohlédněte pod malým zvětšením (objektiv
6x nebo 10x), s nímž vyhledejte mřížku s buňkami. Pak
spočtěte buňky pod 20x, popř. 45x zvětšujícím objektivem.
Ze zjištěného údaje vypočtěte buněčnou denzitu. Její
hodnotu (d) v počtu buněk na mililitr suspenze udává
vzorec:
d = p . 104 / n
kde p - celkový počet vyhodnocených buněk a n - počet
malých čtverečků mřížky, na nichž byly buňky počítány.
Studium životnosti (viability)
suspenzní kultury
• Mrtvé buňky – prostupnost membrány pro
PI, Evans Blue apod.
• Živé buňky – aktivita emzymů
– Esterázy (FDA)
– Respirační schopnost mitochondrií
(tetrazoliové soli)
Test viability
Tabák BY2
• FDA + PI
FDA
PI
Analýza obrazu
• Yasuomi Ibaraki (2006) Plant Tissue
Culture Engineering
Genetická stabilita
• Díky rychlému dělení obecně lepší než u
kalusových kultur
• V případě mikropropagace nutné
periodicky prověřovat
• V případě změn založit kulturu znovu ze
základní kultury
kontaminace
• Vzhledem k podmínkám umožňujícím
rychlé dělení buněk se rychle rozvíjejí i
případné kontaminace, nutno mít pod
kontrolou
Protoplastové kulury
Izolace a kultivace
• Z listového mezofylu, růstových vrcholů,
děloh, hypokotylů, kalusu nebo suspenzní
kultury
postup
•
•
•
•
•
•
Povrchová sterilizace explantátu
Narušení - odstranění spodní epidermis, přesátí
Inkubace v médiu s enzymy (pektinázy, celulázy)
Promytí promývacím médiem s osmoticky
aktivními látkami (glukóza, manitol, sorbitol,
sacharóza, xylóza)
Kultivace, regenerace buněčné stěny, indukce
dělení buněk
Tvorba kalusu a regenerace rostlin
2 měsíce
Čerstvě izolované
protoplasty
karafiátu
(Nakano a Mii,
1992)
30m
5 dní
1cm
Regenerované rostliny (D. chinensis)
E kalus odvozený ze zralého ZE
rýže ( Datta 1992)
Čerstvě izolované protoplasty
E suspenze
E suspenze
Konverze SE
Rýže z protoplastové kultury