Transcript Explantátové kultury 2

IN VITRO
Zpracovatel: Jiří Horák
IN VITRO

In vitro se dá z latiny přeložit jako ve
skle. Pojem pěstování "in vitro" se
používá v medicíně či biologii a v
příbuzných oborech pro organismy
pěstované v umělých podmínkách ve
zkumavkách či jiném laboratorním
skle (např. Petriho miskách), ne však
na živé tkáni.
Základní členění
orgánové kultury
pletivové kultury
buněčné kultury
Orgánové kultury

- kultury geneticky stabilní
- technologicky nejméně komplikované
 - nedochází k chromozomovým změnám
 - nejčastěji používán apikální
meristémy,které mají vysoce stabilní
struktury
 - jež zaručují diploidní charakter reprodukce
a genetickou stabilitu .



- nejčastěji používány pro většinu našich
hospodářsky významných listnatých druhů
- (u druhů rodu Quercus, Fagus, Populus,
Betula, Tilia, Fraxinus, Ulmus, Acers,
Alnus, Carpinus, Salix, Prunus, Robinia,
Juglans).

- Koeficient množení je při použití této
metody velký


- Nejsnadněji se množí a značných koeficientů množení
lze dosáhnout při odebrání explantátů z juvenilních
rostlin (semenáčků), nebo z juvenilních částí stromů
- Rozmnožování konifer pomocí orgánových kultur je
obtížnější než u listnatých stromů zejména z důvodů
jejich odchylné morfologické stavby (malého počtu
axilárních pupenů). Rozmnožování juvenilních rostlin
konifer lze dosáhnout jednak stimulací růstu axilárních
pupenů, jednak indukcí adventivních pupenů na
kotyledonech, mladých jehlicích a izolovaných pupenech,
které jsou pěstovány na živných médiích obsahujících
cytokinin .
Pletivové kultury

- kalusové

- embriogenní
Kalusové kultury
- nejstarší in vitro metoda u rostlin a les.dřevin
- prvně takto vypěstovaná kultura mrkve ve Fr.- 1930
- dnes se s těmito kulturami pracuje omezeně
- nevhodné, že zde probíhají nekontrolovatelné mutace
Embriogenní kultury =
tzv.somatická embryogeneze
vznik v 80.letech
indukuje se tvorba somatických embryi
- vzniká zvláštní kalus s vnitřní diferenciací
pletiv
výborně propracováno zejména Nový Zéland,
USA, Kanada
Nepřímá somatická
embriogeneze
Proces, při kterém vzniká embrio z jiné
buňky než je oplozené vajíčko.
Somatická embria často vznikají spíše
než z jedné izolované buňky na
povrchu explantátu
Etapy: 1.) z diferenciovaného pletiva
matečné rostliny odebereme
embriogenní kalus
2.) na médiu se indikují
somatická embria
3.) přenos som. embrií na další
médium, kde vyklíčí a dál se vyvíjejí
Buněčné kultury
Buněčné kultury-jsou využívány
zejména v genovém ing.
provádí se v tekutých živných médií
oproti předešlým
princip: v in vitro podmínkách,
získáme nediferenc. pletiva,pomocí
bioregulačních látek se zpomaluje
rozpad pletiv.
Obecný princip:
mikropropagace
Jaký je sled činností?
1.) získání sterilní kultury
opláchnutí vodou
povrchová desinfekce činidly
opláchnutí desinfekce z povrchu vzorků
ořezání poškozených pletiv
segmentace vzorku
2.) zmnožení kultury
Výběr vhodné metody a zmnožení explantátu na
připraveném médiu
3.) zakořeňování - IN VITRO často ne zcela
funkční kořeny
- IN VIVO
4.) převod rostliny do podmínek IN ViTRVO
postupná aklimatizace klonů na vnější
podmínky
hlavně faktor vzdušné vlhkosti a přechod na
autotrfní výživu
Podmínky:

1) Výživa –
jsou to chem. Def .živná média

složení: nosič,výživné látky

Nosič: přírodní(Agar),synthetický

Výživné látky: makro,mikrobiogenní prvky,Anorg látky(N).Org


l.(cukry kyseliny,bioregulační látky Auxiny,
stimulátory-
Práškové stimulátory:
Výhodou pudrů je jednoduchost jejich požití. Umožňují rychlou
aplikaci
Kapalné stimulátory:
Auxiny jsou dobře rozpustné v organických
rozpouštědlech (aceton, isopropanol, ethanol).





2) Fyzikální podmínky
-
Teplo - optimum 20-25,
-existují dvě výjimky –chladný režim´=genetická
banka(10-15),Termoterapie= krátkodobé
vystavení na 40 stupňů při ozdravování
Vlhko - téměř 100%,uzavřené nádoby
Světlo - v temnu se indukuje kalus, na světle
probíhají všechny ostatní fáze stand.osvětlení 16
hod.
Výhody explantátových kultur:





na malém prostoru se produkuje velký
počet rostlin
rychlé (možnost ovlivnit podmínky)
Produkce klonů jejichž množení tradičními
metodami probíhá pomalu nebo vůbec
celoroční produkce rostlin
zkrácení šlechtitelského cyklu
Nevýhody explantátových
kultur:




relativně drahé vybavení laboratoří
pracnost
drahý provoz laboratoře
náročná aklimatizace rostlin na polní
podmínky

Mikropropagace - ve školkařství

Mikropropagace je dnes ve školkařství
standardní metodou množení. Využívá
skutečnosti, že za jedno vegetační období lze z
mikrořízků velikosti 1-2 cm dopěstovat silnou
rostlinu v kontejneru P9 se 2-3 výhony schopnou
přezimování v našich podmínkách. Výhodou
mikrosadby je její velmi nízká cena a malé
prostorové nároky ze začátku vegetace (jaro),
kdy mnoho školkařských podniků bojuje s
nedostatkem místa v temperovaných sklenících.
Odpadá také nutnost neekonomického zimování
matečných rostlin, které je energeticky a
prostorově vysoce náročné.
SOUČASNÝ STAV V ČR


V ČR existují výzkumné laboratoře, které se zabývají
mnoha aspekty explantátových kultur lesních dřevin in
vitro. Jeden ze zakladatelů problematiky explantátových
kultur lesních dřevin ve světovém měřítku a zakladatel
této problematiky v bývalém Československu a konkrétně
laboratoře ve VÚLHM Jíloviště-Strnady Prof. Ing. Vladimír
Chalupa, DrSc
Jediným pracovištěm v ČR, které se zabývá pěstováním
sadbového materiálu na bázi explantátových kultur in
vitro pro lesnickou praxi, je v současné době Laboratoř
biotechnologií Olešná Jihočeských lesů České Budějovice,
a. s., vedená Ing. Evou Prenerovou
Příklad: iniciace prýtu na
kaktusových kulturách
Na bazální části listu se tvoří kalus
Ten je odříznut a pasážován na čerstvé médium a roste a
roste. V průběhu čtyř měsíců dospěl do velikosti 50x30x20
mm
Po další pasáži je již na povrchu kalusu patrná
diferenciace buněk
Rozřezání části kalusu a přenesení na čerstvé médium.
Tvorba prýtů je už pak velmi rychlá.
Kdo mi pomáhal:



Kováč, J.: Explantátové kultury rostlin –nakladatelství University
Palackého v Olomouci 1995
Novák, Fr.: Explantátové kultury a jejich využití ve šlechtění
rostlin- Academia Praha 1990
Chalupa, Vl.: Zachování genových zdrojů ušlechtilých listnáčů a
jejich rozmnožování metodami in vitro, ON-LINE: silvarium.cz
konec