Transpozibilní elementy

Transpozóny

= mobilní genetické elementy

úseky DNA schopné přenosu na jiné (další) místo genomu (transpozice) U Prokaryot i všech dosud analyzovaných Eukaryot (s výjimkou parazita

Plasmodium falciparum

) u rostlin tisíce rodin (až 80% genomu) živočichové 3-45%, houby 2-20%

Způsoby množení / přenosu

• „CUT and PASTE“

– vyštěpení a přenos transpozónu do jiného místa genomu – pouze přeskočení, bez pomnožení

• „COPY and PASTE“

– – opakované kopírování, kopie se vkládá do nového místa původní element zůstává, počet kopií ~ počtu kopírování • • • kopírování přes RNA intermediát a tvorbu cDNA přímé vložení kopírované DNA „ COPY, (COPY) n and (PASTE) n ???

Základní typy TE dle transpozice

Rolling circle replication ???

Lisch 2013, Nature Rev. Genet.

Ne všechny transpozóny kódují potřebné enzymatické aktivity

•

Autonom ní elementy

– kódují gen, jehož produkt zajistí přenos/replikaci •

Neautonom ní elementy

– odvozené od autonomních – ztratily geny potřebné pro přenos, ale mohou být mobilizovány jinými (příbuznými) autonomními elementy – mají sekvence potřebné k mobilizaci (!)

Klasifikace transpozónů

1.

Třídy:

• • Dle toho, zda je či není intermediátem při replikaci RNA

DNA transpozóny Retrotranspozóny

2.

3.

4.

Podtřídy: Řády: Nadčeledi:

Dle mechanismu replikace (u DNA transpozómů) Dle základních strukturních rysů Dle sekvenční příbuznosti

Nature Rev. Genet

. 2008

Třída II: DNA transpozóny

DNA transpozóny -

podtřída I

: zpravidla kódují

transpozázu

, na okrajích jsou

invertované repetice

(pozn.: houbový řád Crypton nemá transpozázu, ale rekombinázu) složitý proces

transpozice

– vazba IR, štěpení (transpozáza), štěpení cílové sekvence, syntéza DNA, ligace zdvojení krátké sekvence (2-8 bp) v místě začlenění =

footprint

opětovném vyštěpení po

Množení DNA transpozónů?

Přesuny a množení DNA transpozónů

Mechanismus aktivace při replikaci? Hemimetylovaný stav?

+ opravy zlomu po vyštěpení TE podle homologního úseku (tedy možnost rekonstrukce původní sekvencei s TE)

DNA transpozóny

-

podtřída I

vyšší pravděpodobnost začlenění v blízkosti původní inserce -

klastrování

většinou několik až několik set kopií v genomu

př.:

Ac, Spm, Mu (kukuřice), Tam (Antirrhinum), TphI (petunie), TagI (Arabidopsis), Stowaway, Tourist > 10 000 kopií, každých 30kbp (u kukuřice, inserce do TA bohatých sekvencí) - MULE (Mutator like elements) u rýže – mobilizováno přes 1000 genových fragmentů – 5 % je exprimováno! –

evoluce nových genů

Pack MULE (fragmenty více různých genů) mutované neautonomní formy Ac/ Ds (Ds1, Ds2) , Spm/ dSpm

DNA transpozóny

podtřída II

: řád: Helitron –

jednovláknový zlom, vytěsnění vlákna, vložení - Rep/helikase-like, replication protein A-like u kukuřice

4 až 10 tis. mobilizovaných gen.úseků

řád: Mavericks - zřejmě vyštěpena ssDNA (poté mimochromozomální replikace a integrace)

Třída I: Retrotranspozóny

Retrotranspozóny

replikace přes RNA intermediát (četné potomstvo!) - velikost 1 13kbp, až milióny kopií (až 40-80% genomu) často v heterochromatinových oblastech, v euchromatinu především mezi geny zřejmě důsledek selekčního tlaku

Řád: LTR

– nejvýznamnější TE u rostlin

podobné

retrovirům

- LTR (long terminal repeat) promotor, terminátor, přímá repetice krátké zdvojení cílové sekvence nucleocapsidový protein (!), proteáza, RT, RNáza H, integráza

LTR retrotranspozóny - replikace

replikace analogická retrovirům - LTR (U3, R, U5) - PBS (primer binding site): tRNA primer přeskoky mezi templáty (přímý repeat - R)

Příklady retrotranspozónů s LTR

Ty1- copia group BARE 1, ječmen, 12,1 kbp, >50 000 kopií, transkript v listech a kalusu Opie –1, kukuřice, 8,7 kbp, >30 000 kopií, kořeny, listy, integrace do LTR PREM 2, kukuřice, 9,5 kbp, >10 000 kopií, mikrospory Tnt1, tabák, 5,3 kbp, >100, protoplasty, kořeny,

aktivace po poranění, ataku patogenu, integrace do euchromatinu

Ty3 – gypsy group potenciální předci živočišných retrovirů, někdy i

env-like sekvence

Athila, A.t., 10,5 kbp, > 10000, paracentromerické oblasti Athila-1-1, A.t., 12 kbp, 730, env-like sekvence Cinful 1, kukuřice, 8,6 kbp, 20000, listy, env-like sek.

Retrotranspozóny bez LTR

LINE (long interspersed nuclear elements) SINE (short interspersed nuclear elements)

LINE APE – endonuclease, RH – RNase H

LINE fylogeneticky zřejmě nejstarší, předchůdci transpozónů s LTR - 5 ´oblast – promotor; 3´oblast - terminátor Cin4, kukuřice, 1-6,8kbp, 50-100, různě zkrácené formy SINE využívají aparát (RT) jiných transpozónů odvozeny od produktů RNA polymerázy III (tRNA, 7SLRNA, (rRNA)) - < 500 nt

Regulace aktivity transpozónů

regulace vlastními mechanismy i hostitelem (individuálně) většinou neaktivní –

metylace (siRNA + RdDM, CMT2/3 + KYP)

jedna z možných příčin vzniku metylace DNA „heterochromatinizace“ nutná i pro zachování integrity genomu ( brání hybridizaci mezi kopiemi TE na různých místech genomu) aktivace může být vývojově ovlivněná větší ochrana „zárodečné linie“ oproti diferencovaným somatickým buňkám? – u rostlin ne zcela odlišené!

nárůst metylace

Spm

a

Mu

v průběhu vývoje listů, demetylace v časných fázích vývoje aktivace v centrální buňce zárodečného vaku a veget. jádře pylu aktivace může být ovlivněna vnějšími podmínkami: Tam1 u hledíku (1000x při 15°C) - Reme1 u melounu – aktivace UV zářením Tnt1 u tabáku po poranění či infekci (do euchromatinu)

Význam transpozónů

navozování mutací = zvyšování variability

-

modulace exprese

(aktivace, represe, vývojová, stresová)

tvorba nových genů evoluce genomů

u rostlin na TE chybí geny, které přímo zvyšují fitness (rezistence apod.) zvýšení fitness náhodně navozenou mutací (př. při aktivaci stresovými podmínkami) – velmi nízká pravděpodobnost …

velký význam při domestikaci (šlechtění) rostlin!

Mutace působené transpozóny

~ místo začlenění (různé preference: GC, AT, transkrib.,…) ~ charakter nesených regulačních sekvencí Cis/Promotor 5 ´UTR exon intron exon 3´UTR terminátor modulace exprese (časově i místně) – promotor, enhancery změny ve stabilitě transkriptu a postranskripčních úpravách (sestřih) UTR, introny, terminátor změna sekvence výsledného proteinu (vč. footprintů), předčasná terminace translace, vznik chimerických genů,… exony, introny

Regulace genové exprese transpozóny

př. réva: inaktivace exprese TF VvmybA1 (regulace antokyanových genů) přítomností retrotranspozónu z rodiny Gypsy (Kobayashi et al. 2004, Science)

Regulace genové exprese transpozóny

př. kukuřice – inaktivace genu

CCT

(odpověď na délku fotoperiody) inzercí CACTA like elementu (DNA TE) do promotorové oblasti – rozšíření pěstování do mírného pásma (kvetení za dlouhého dne) (Yang et al. 2013, PNAS) př. blok větvení (TE enhancer  OE inhibitoru) př. pomeranč Ruby – myb TF (regulace antokyanových genů) aktivovaný inzercí TF (Butelli et al. 2012, Plant Cell)

PROČ byly TE tak významné v domestikaci?

umělý výběr skokové změny vlastností

Význam v evoluci genů

inserční mutageneze (předčasná terminace), footprinty možná účast v multiplikaci genů přímo či zprostředkovaně přes homologní rekombinaci výhodné mít genové rodiny s různou regulací, popř. záložní kopie genů tvorba bezintronových kopií genů (reverzní transkripcí) mohou se podílet na tvorbě zcela nových genů – např. fúzí přenášených fragmentů stávajících genů (helitrons, MULE) geny, původně transpozónového původu byly mnoha eukaryotickými organismy „domestikovány“ pro nové funkce (př. telomerázy, syncitin, ….)

Vliv TE na celkovou architekturu genomu -

tvoří většinu repetitivní DNA v genomech rostlin ( heterochromatin ) až 80 % genomu mohou způsobovat chromozomální přestavby

Změny na úrovni genomu •

Chromozómové přestavby

(zlomy, inverze, delece, duplikace, translokace) změny vazbových skupin, speciace (sterilita hybridů)

•

Zvětšování genomu

(„genomic obesity“)

příčiny

vlastní transpozice (nové inserce) x

homologní rekombinace

(repetitivní sekvence) základní mechanismus bránící zvětšování genomu ( u 2n druhů bavlníku až 3 násobné rozdíly ve velikosti genomu díky aktivní rekombinaci; Hawkins 2009 PNAS )

Transpozónová mutageneze

především u

Arabidopsis

DNA transpozóny z kukuřice: Ac/Ds, Spm/dSpm – nízká frekvence dvoukomponentní systém

R Ds

rostlina s neautonomním elementem v genu rezistence

Gen pro transpozázu

(indukovatelná exprese)

R Ds

Selekce rezistentních rostlin = s transpozicí neautonomního elementu V další generaci selekce rostlin bez transpozázy

Modifikace

vyštěpením aktivovaná exprese represoru transkripce genu pro transpozázu

Transpozónová mutageneze

možnost určení místa začlenění (např. TAIL PCR) častá mutageneze přilehlých oblastí (20 % v 1Mb okolí) reintrodukcí transpozázy je někdy možné mutaci revertovat

Objevení transpozónů

Barbara McClintock (1902-1992) Nobelova cena za Fyziologii and Medic ínu 1983 za objevení (poznání podstaty) mobilních genetických elementů kukuřice 1940-1950

Objevení transpozónů

(B. McClintock) studium chromozomálních zlomů u kukuřice zvýšený výskyt zlomů v určité oblasti (= marker nazvaný „dissociation“

Ds)

poloha markeru ale nebyla po křížení s některými liniemi stabilní, a přesouvala se na jiná místa (= linie nesoucí „activator“

Ac

)

u jedné linie způsobil přesun Ds markeru ztrátu purpurového zbarvení obilek světlá barva obilek (c) způsobená inzercí Ds elementu však nebyla při křížení s liniemi nesoucími Ac stabilním znakem objevovaly se obilky s purpurovými skvrnami -

triploidní endosperm

• •

c/c/c C/c/c nebo C/C/c nebo C/C/C = světlé obilky = purpurové zbarvení

Transpozice a zbarvení obilek

• pokud dojde k reverzi c na C, začne se v buňce tvořit červený pigment a vytvoří se skvrna na světlém pozadí, čím dříve ve vývoji obilky dojde k reverzi, tím je skvrna větší • B. McClintock vyvodila, že “c” alela vznikla začleněním neautonomního transpozónu “Ds” do “C” alely (Ds = dissociation) • reverze c na C je způsobena transpozicí Ds elementu z c alely, která je zprostředkována autonomním transpozonem “Ac” (Ac = activator)

PROČ tak vysoká frekvence transpozice?

Barbara McClintock (1902-1992) 1951: formulovala základní koncept epigenetiky

"[T]he progeny of two (such) sister cells are not alike with respect to the types of gene alteration that will occur. Differential mitoses also produce the alterations that allow particular genes to be reactive. Other genes, although present, may remain inactive.

This inactivity or suppression is considered to occur because the genes are ‘covered' by other nongenic chromatin materials.

Gene activity may be possible only when a physical change in this covering material allows the reactive components of the gene to be ‘exposed' and thus capable of functioning.

"