Transcript transpozice
Transpozibilní elementy
Transpozóny
= mobilní genetické elementy
úseky DNA schopné přenosu na jiné (další) místo genomu (transpozice) U Prokaryot i všech dosud analyzovaných Eukaryot (s výjimkou parazita
Plasmodium falciparum
) u rostlin tisíce rodin (až 80% genomu) živočichové 3-45%, houby 2-20%
Způsoby množení / přenosu
• „CUT and PASTE“
– vyštěpení a přenos transpozónu do jiného místa genomu – pouze přeskočení, bez pomnožení
• „COPY and PASTE“
– – opakované kopírování, kopie se vkládá do nového místa původní element zůstává, počet kopií ~ počtu kopírování • • • kopírování přes RNA intermediát a tvorbu cDNA přímé vložení kopírované DNA „ COPY, (COPY) n and (PASTE) n ???
Základní typy TE dle transpozice
Rolling circle replication ???
Lisch 2013, Nature Rev. Genet.
Ne všechny transpozóny kódují potřebné enzymatické aktivity
•
Autonom ní elementy
– kódují gen, jehož produkt zajistí přenos/replikaci •
Neautonom ní elementy
– odvozené od autonomních – ztratily geny potřebné pro přenos, ale mohou být mobilizovány jinými (příbuznými) autonomními elementy – mají sekvence potřebné k mobilizaci (!)
Klasifikace transpozónů
1.
Třídy:
• • Dle toho, zda je či není intermediátem při replikaci RNA
DNA transpozóny Retrotranspozóny
2.
3.
4.
Podtřídy: Řády: Nadčeledi:
Dle mechanismu replikace (u DNA transpozómů) Dle základních strukturních rysů Dle sekvenční příbuznosti
Nature Rev. Genet
. 2008
Třída II: DNA transpozóny
DNA transpozóny -
podtřída I
: zpravidla kódují
transpozázu
, na okrajích jsou
invertované repetice
(pozn.: houbový řád Crypton nemá transpozázu, ale rekombinázu) složitý proces
transpozice
– vazba IR, štěpení (transpozáza), štěpení cílové sekvence, syntéza DNA, ligace zdvojení krátké sekvence (2-8 bp) v místě začlenění =
footprint
opětovném vyštěpení po
Množení DNA transpozónů?
Přesuny a množení DNA transpozónů
Mechanismus aktivace při replikaci? Hemimetylovaný stav?
+ opravy zlomu po vyštěpení TE podle homologního úseku (tedy možnost rekonstrukce původní sekvencei s TE)
DNA transpozóny
-
podtřída I
vyšší pravděpodobnost začlenění v blízkosti původní inserce -
klastrování
většinou několik až několik set kopií v genomu
př.:
Ac, Spm, Mu (kukuřice), Tam (Antirrhinum), TphI (petunie), TagI (Arabidopsis), Stowaway, Tourist > 10 000 kopií, každých 30kbp (u kukuřice, inserce do TA bohatých sekvencí) - MULE (Mutator like elements) u rýže – mobilizováno přes 1000 genových fragmentů – 5 % je exprimováno! –
evoluce nových genů
Pack MULE (fragmenty více různých genů) mutované neautonomní formy Ac/ Ds (Ds1, Ds2) , Spm/ dSpm
DNA transpozóny
podtřída II
: řád: Helitron –
jednovláknový zlom, vytěsnění vlákna, vložení - Rep/helikase-like, replication protein A-like u kukuřice
4 až 10 tis. mobilizovaných gen.úseků
řád: Mavericks - zřejmě vyštěpena ssDNA (poté mimochromozomální replikace a integrace)
Třída I: Retrotranspozóny
Retrotranspozóny
replikace přes RNA intermediát (četné potomstvo!) - velikost 1 13kbp, až milióny kopií (až 40-80% genomu) často v heterochromatinových oblastech, v euchromatinu především mezi geny zřejmě důsledek selekčního tlaku
Řád: LTR
– nejvýznamnější TE u rostlin
podobné
retrovirům
- LTR (long terminal repeat) promotor, terminátor, přímá repetice krátké zdvojení cílové sekvence nucleocapsidový protein (!), proteáza, RT, RNáza H, integráza
LTR retrotranspozóny - replikace
replikace analogická retrovirům - LTR (U3, R, U5) - PBS (primer binding site): tRNA primer přeskoky mezi templáty (přímý repeat - R)
Příklady retrotranspozónů s LTR
Ty1- copia group BARE 1, ječmen, 12,1 kbp, >50 000 kopií, transkript v listech a kalusu Opie –1, kukuřice, 8,7 kbp, >30 000 kopií, kořeny, listy, integrace do LTR PREM 2, kukuřice, 9,5 kbp, >10 000 kopií, mikrospory Tnt1, tabák, 5,3 kbp, >100, protoplasty, kořeny,
aktivace po poranění, ataku patogenu, integrace do euchromatinu
Ty3 – gypsy group potenciální předci živočišných retrovirů, někdy i
env-like sekvence
Athila, A.t., 10,5 kbp, > 10000, paracentromerické oblasti Athila-1-1, A.t., 12 kbp, 730, env-like sekvence Cinful 1, kukuřice, 8,6 kbp, 20000, listy, env-like sek.
Retrotranspozóny bez LTR
LINE (long interspersed nuclear elements) SINE (short interspersed nuclear elements)
LINE APE – endonuclease, RH – RNase H
LINE fylogeneticky zřejmě nejstarší, předchůdci transpozónů s LTR - 5 ´oblast – promotor; 3´oblast - terminátor Cin4, kukuřice, 1-6,8kbp, 50-100, různě zkrácené formy SINE využívají aparát (RT) jiných transpozónů odvozeny od produktů RNA polymerázy III (tRNA, 7SLRNA, (rRNA)) - < 500 nt
Regulace aktivity transpozónů
regulace vlastními mechanismy i hostitelem (individuálně) většinou neaktivní –
metylace (siRNA + RdDM, CMT2/3 + KYP)
jedna z možných příčin vzniku metylace DNA „heterochromatinizace“ nutná i pro zachování integrity genomu ( brání hybridizaci mezi kopiemi TE na různých místech genomu) aktivace může být vývojově ovlivněná větší ochrana „zárodečné linie“ oproti diferencovaným somatickým buňkám? – u rostlin ne zcela odlišené!
nárůst metylace
Spm
a
Mu
v průběhu vývoje listů, demetylace v časných fázích vývoje aktivace v centrální buňce zárodečného vaku a veget. jádře pylu aktivace může být ovlivněna vnějšími podmínkami: Tam1 u hledíku (1000x při 15°C) - Reme1 u melounu – aktivace UV zářením Tnt1 u tabáku po poranění či infekci (do euchromatinu)
Význam transpozónů
navozování mutací = zvyšování variability
-
modulace exprese
(aktivace, represe, vývojová, stresová)
tvorba nových genů evoluce genomů
u rostlin na TE chybí geny, které přímo zvyšují fitness (rezistence apod.) zvýšení fitness náhodně navozenou mutací (př. při aktivaci stresovými podmínkami) – velmi nízká pravděpodobnost …
velký význam při domestikaci (šlechtění) rostlin!
Mutace působené transpozóny
~ místo začlenění (různé preference: GC, AT, transkrib.,…) ~ charakter nesených regulačních sekvencí Cis/Promotor 5 ´UTR exon intron exon 3´UTR terminátor modulace exprese (časově i místně) – promotor, enhancery změny ve stabilitě transkriptu a postranskripčních úpravách (sestřih) UTR, introny, terminátor změna sekvence výsledného proteinu (vč. footprintů), předčasná terminace translace, vznik chimerických genů,… exony, introny
Regulace genové exprese transpozóny
př. réva: inaktivace exprese TF VvmybA1 (regulace antokyanových genů) přítomností retrotranspozónu z rodiny Gypsy (Kobayashi et al. 2004, Science)
Regulace genové exprese transpozóny
př. kukuřice – inaktivace genu
CCT
(odpověď na délku fotoperiody) inzercí CACTA like elementu (DNA TE) do promotorové oblasti – rozšíření pěstování do mírného pásma (kvetení za dlouhého dne) (Yang et al. 2013, PNAS) př. blok větvení (TE enhancer OE inhibitoru) př. pomeranč Ruby – myb TF (regulace antokyanových genů) aktivovaný inzercí TF (Butelli et al. 2012, Plant Cell)
PROČ byly TE tak významné v domestikaci?
umělý výběr skokové změny vlastností
Význam v evoluci genů
inserční mutageneze (předčasná terminace), footprinty možná účast v multiplikaci genů přímo či zprostředkovaně přes homologní rekombinaci výhodné mít genové rodiny s různou regulací, popř. záložní kopie genů tvorba bezintronových kopií genů (reverzní transkripcí) mohou se podílet na tvorbě zcela nových genů – např. fúzí přenášených fragmentů stávajících genů (helitrons, MULE) geny, původně transpozónového původu byly mnoha eukaryotickými organismy „domestikovány“ pro nové funkce (př. telomerázy, syncitin, ….)
Vliv TE na celkovou architekturu genomu -
tvoří většinu repetitivní DNA v genomech rostlin ( heterochromatin ) až 80 % genomu mohou způsobovat chromozomální přestavby
Změny na úrovni genomu •
Chromozómové přestavby
(zlomy, inverze, delece, duplikace, translokace) změny vazbových skupin, speciace (sterilita hybridů)
•
Zvětšování genomu
(„genomic obesity“)
příčiny
vlastní transpozice (nové inserce) x
homologní rekombinace
(repetitivní sekvence) základní mechanismus bránící zvětšování genomu ( u 2n druhů bavlníku až 3 násobné rozdíly ve velikosti genomu díky aktivní rekombinaci; Hawkins 2009 PNAS )
Transpozónová mutageneze
především u
Arabidopsis
DNA transpozóny z kukuřice: Ac/Ds, Spm/dSpm – nízká frekvence dvoukomponentní systém
R Ds
rostlina s neautonomním elementem v genu rezistence
Gen pro transpozázu
(indukovatelná exprese)
R Ds
Selekce rezistentních rostlin = s transpozicí neautonomního elementu V další generaci selekce rostlin bez transpozázy
Modifikace
vyštěpením aktivovaná exprese represoru transkripce genu pro transpozázu
Transpozónová mutageneze
možnost určení místa začlenění (např. TAIL PCR) častá mutageneze přilehlých oblastí (20 % v 1Mb okolí) reintrodukcí transpozázy je někdy možné mutaci revertovat
Objevení transpozónů
Barbara McClintock (1902-1992) Nobelova cena za Fyziologii and Medic ínu 1983 za objevení (poznání podstaty) mobilních genetických elementů kukuřice 1940-1950
Objevení transpozónů
(B. McClintock) studium chromozomálních zlomů u kukuřice zvýšený výskyt zlomů v určité oblasti (= marker nazvaný „dissociation“
Ds)
poloha markeru ale nebyla po křížení s některými liniemi stabilní, a přesouvala se na jiná místa (= linie nesoucí „activator“
Ac
)
u jedné linie způsobil přesun Ds markeru ztrátu purpurového zbarvení obilek světlá barva obilek (c) způsobená inzercí Ds elementu však nebyla při křížení s liniemi nesoucími Ac stabilním znakem objevovaly se obilky s purpurovými skvrnami -
triploidní endosperm
• •
c/c/c C/c/c nebo C/C/c nebo C/C/C = světlé obilky = purpurové zbarvení
Transpozice a zbarvení obilek
• pokud dojde k reverzi c na C, začne se v buňce tvořit červený pigment a vytvoří se skvrna na světlém pozadí, čím dříve ve vývoji obilky dojde k reverzi, tím je skvrna větší • B. McClintock vyvodila, že “c” alela vznikla začleněním neautonomního transpozónu “Ds” do “C” alely (Ds = dissociation) • reverze c na C je způsobena transpozicí Ds elementu z c alely, která je zprostředkována autonomním transpozonem “Ac” (Ac = activator)
PROČ tak vysoká frekvence transpozice?
Barbara McClintock (1902-1992) 1951: formulovala základní koncept epigenetiky
"[T]he progeny of two (such) sister cells are not alike with respect to the types of gene alteration that will occur. Differential mitoses also produce the alterations that allow particular genes to be reactive. Other genes, although present, may remain inactive.
This inactivity or suppression is considered to occur because the genes are ‘covered' by other nongenic chromatin materials.
Gene activity may be possible only when a physical change in this covering material allows the reactive components of the gene to be ‘exposed' and thus capable of functioning.
"