Transcript Dědičnost STR
Slide 1
Možnosti identifikace
osoby prostřednictvím
analýzy DNA
Slide 2
MALÉ REVIEW
SLOVNÍČEK:
Gen = funkční (exprimovaný) úsek DNA
Lokus = jakýkoli úsek či místo v DNA
Marker = znak DNA užívaný při testování
Alela = konkrétní varianta(forma) genu/lokusu/markeru
Polymorfismus = existence více alel v témže
genu/lokusu/markeru
Lidský genom
cca 3 miliardy nukleotidů (2x)
max 10% kódující (geny), 90% nekódující
max 30 tisíc genů
Slide 3
INDIVIDUALITA
V čem tkví genetická jedinečnost?
Nepolymorfní
gen/lokus/marker
Nízce polymorfní
gen/lokus/marker
Vysoce polymorfní
gen/lokus/marker
Slide 4
INDIVIDUALITA
V čem tkví genetická jedinečnost?
GENETICKÝ
PROFIL
Vysoce polymorfní lokus 1
Vysoce polymorfní lokus 2
Vysoce polymorfní lokus 3
Vysoce polymorfní lokus 4
Vysoce polymorfní lokus 5
Slide 5
INDIVIDUALITA
V čem tkví genetická jedinečnost?
1986
VNTR
2000
STR
201X
?
SNP
Slide 6
90% nekódující sekvence
10% kódující sekvence a spol.
méně než 50% jedinečné sekvence
přes 50% repetitivní sekvence
Slide 7
Nuclear genome
3000 Mb
65-80000 genes
30%
Genes and generelated sequences
Mitochondrial genome
16.6 kb
37 genes
70%
Extragenic
DNA
Unique or moderately repetitive
10%
90%
Coding
DNA
Pseudogenes
Noncoding
DNA
Gene
fragments
Introns,
untranslated
sequences, etc.
Two rRNA
genes
22 tRNA
genes
13 polypeptideencoding genes
80%
20%
Unique or
low copy
number
Moderate to
highly
repetitive
Tandemly
repeated
or clustered
repeats
Interspersed
repeats
Slide 8
ROSTE S:
• mutační rychlostí lokusu (HOT SPOTS)
• stářím lokusu
• evoluční výhodou variability (pozitivním selekčním
tlakem na nové mutace) (např. HLA)
KLESÁ S:
• účinností reparačních mechanismů (nDNA vs. mtDNA)
• negativním selekčním tlakem na nové mutace (GENY)
Slide 9
Slide 10
rozptýlené
LINE
SINE
krátký
motiv
dlouhý
motiv
VNTR
STR
tandemové
Slide 11
Rozptýlené repetitivní sekvence
Většina rozptýlených repetic má původ v transpozibilních elementech
DNA transpozony
• gen pro transpozázu + na obou koncích
invertovaná repetitivní sekvence (vzniká
útvar stopka-očko)
• mechanismus cut´n´paste (jako při
zrání imunoglobulinů a TLR)
• u lidí už neaktivní (mutace), ale…!!!
Retrotranspozony
• pro skákání používají buněčné RNA polymerázy
• mechanismus copy´n´paste
• u lidí aktivní, tvoří přes 45% genomu, aktivní je jen
každá cca 100 kopie (mutace)
• jsou buď autonomní (kódují potřebné proteiny), nebo
neautonomní (využívají proteinový aparát jiných
transpozónů)
Slide 12
LTR retrotranspozony – endogenní retroviry
• připomínají svým složením proviry skutečných retrovirů
• obsahují LTR (long terminal repeats, dlouhé terminální repetice) a geny gag, pol,
env a prt
• alespoň jeden z genů nezbytných pro sestavení infekčních virových částic je
mutován nebo chybí → mohou se pohybovat pouze uvnitř buněk
• životní cyklus podobný infekčním retrovirům jako je HIV
• lidský genom v současné době obsahuje pouze fosilie endogenních retrovirů – cca
8% genomu
• Intaktní endogenní retroviry dlouhé 7-9 kb, ale také mnoho zkrácených
• často lze najít pouze samostatné LTR
Slide 13
non-LTR retrotranspozony
LINE = long interspearsed nuclear elements
• autonomní retrotranspozóny
• cca 21% lidského genomu
• rozeznáváme různé rodiny – LINE1 (L1), LINE 2, LINE 3 …
• LINE1 jsou aktivní (17% genomu) – 500 000 kopií, z toho cca 100 stále schopno
transpozice
• aktivní element L1 je dlouhý cca 6 kb
• obsahuje ORF1 (?) a ORF2 (reverzní transkriptáza)
Slide 14
neautonomní retrotranspozony
SINE = short interspearsed nuclear elements
• typicky kratší než 500 bp
• nejpočetnější rodinou jsou Alu repetice
• Alu mohou být náhodně aktivní (11% genomu) – 1 000 000 kopií
• obsahují sekvenci 282 bp - patrně odvozena z RNA podjednotky SRP (7SL RNA)
• SRP = signal recognition particle - ribonukleoproteinový komplex - rozpoznává signální
peptid, váže se na něj a přemístí komplex ribozom-mRNA-nascentní peptid ke kanálu
endoplazmatického retikula (ER), skrz nějž je nascetní peptid translokován do lumenu ER nebo
integrován v membráně ER
• Alu se tak může vázat na ribozom a díky svému "ocasu" bohatému na adenin také (pokud
ribozom zrovna zpracovává LINE-1 mRNA) na nascentní protein ORF2 a zneužít ORF2 k reverzní
transkripci a integraci vlastní RNA a nikoli LINE-1
Slide 15
Slide 16
funkce transpozónů
junk DNA, selfish DNA…
• ze širšího hlediska – důležitá role – zvyšuje plasticitu genomu
• vyřazení genu z provozu
• změna exprese genu
• transpozice jinak netranspozibilních elementů (svezou se)
• indukce delecí, inverzí
• geny odvozené z transpozónů
• podpora mezichromozomového nerovnoměrného crosing-overu nebo
intrachromozomové rekombinace
• uvažuje se o tom, že by transpozony mohly mít nějakou reálnou fyziologickou funkci,
např. proto, že jejich exprese je obecně zvýšena během stresové odpovědi
Slide 17
tandemově repetitivní sekvence
VYSOCE REPETITIVNÍ
NÍZCE REPETITIVNÍ
SINGLE COPY SEKVENCE
• rRNA, tRNA a
histonové geny
• α-satelity
• minisatelity = VNTR
• mikrosatelity = STR
Slide 18
α-satelitní DNA
• primární jednotka dlouhá 171 bp
• tvoří funkční jádro centromery
• některé proteiny kinetochory se váží na alfa
satelit v centromeře a tím zahajují sestavování
kinetochory
Slide 19
minisatelitní DNA = LTR (dlouhé tandemové)
• primární jednotka (motiv) dlouhá řádově desítky bazí – vzniká z mikrosatelitů
• více se vyskytují v subtelomerických oblastech chromozómů
• lze sem zařadit i cíleně vznikající TTAGGG repetice v oblasti telomer
Slide 20
VNTR – co to je?
• VNTR (Variable Number of
Tandem Repeats) označuje vlastně
obecně jev, na němž byly založeny
první identifikace, tj. existenci
variability počtu opakování motivu
v repetici
• tyto první testy prováděl
Alec Jeffreys
Slide 21
VNTR
• Jeffreys studoval gen pro myoglobin
• zjistil, že v jednom z intronů je repetitivní
sekvence
• rozhodl se ji studovat tak, že vytvoří specifickou
sondu, provede restrikci a vzniklou směs
fragmentů bude hybridizovat se sondou
• sonda však nenašla jen jedno, ale celou řadu
cílových míst – vznikl hybridizační vzor
• Jeffreys zjistil, že tento vzor je různý u různých
osob
• způsob, jak zobrazit jedinečnost genomu, byl
objeven
Slide 22
metoda se nazývá RFLPs
• DNA je inkubována s restriktázou
• Mnoho možností, které restriktázy užít
(i kombinace více restriktáz)
• DNA lze poté zviditelnit s použitím
specifické sondy – výsledný hybridizační
obraz je u různých osob různý (Restriction
Fragment Length Polymorphisms)
• Délkový i sekvenční polymorfismus!!!
Slide 23
RFLP: Elektroforéza
Slide 24
RFLP: Autoradiogram
Slide 25
Jak jedinečné tyto obrazce jsou?
Těžko říct…
• The probability of 2 people having exactly the
same DNA profile is between
1 in 5 million to
1 in 100 billion
(greater than the population of humans on earth)
• This number becomes even larger if you
consider more regions of DNA
• Thus, the odds that the DNA evidence from a
crime scene will match your DNA profile is
astronomically small (unless you have an evil
identical twin)
Slide 26
mikrosatelitní DNA = STR
• primární jednotka (motiv) dlouhá řádově jednotky bazí (do 10 bp)
• počet opakování motivu v jednom lokusu řádově jednotky až stovky
• nejčastější jsou dinukleotidové (CA)n
• po celém genomu, ve valné většině mimo geny, ale jsou výjimky
onemocnění z expanze trinukleotidových repetic
Huntingtonova chorea
• huntingtin - repetitivní sekvence (CAG)n v exonu
kóduje úsek bílkoviny tvořený zbytky glutaminu
• doména pro interakce s jinými proteiny
• normálně do 20 Glu, nad 30 Glu začíná problém
myotonická dystrofie
• DMPK - repetitivní sekvence (CTG)n v nepřekládané
3´části genu
• při expanzi je mRNA patogenní – sekvestrace
(odlučování) transkripčních faktorů
Slide 27
mají STR nějakou funkci?
• možná ano…!
• mnoho indicií, žádné nezvratné důkazy…
• některé dinukleotidy asi spojeny s regulací genové exprese (jsou před promotorem)
• některé dinukleotidy asi fungují jako rekombinační hot-spoty
• některé ale asi opravdu k ničemu
Slide 28
klasifikace STR
dle délky motivu:
• mono- -AAAAAA• di-
-TATATA-
• tri-
-TACTAC-
• tetra-
-GAGCGAGC-
•…
dle stavby motivu:
• perfect
- CACACACACACACACACACA –
• imperfect
- CACACACACACTCACACACA –
• interrupted
- CACACACAGTTCCACACACA –
• composite
- CACACACACACTCTCTCTCT –
Slide 29
názvosloví STR
lokusy
• triviální FGA (located in the third intron of the human alpha fibrinogen gene)
vWA (von Willebrand Factor, 40th intron)
TH01 (intron 1 of human tyrosine hydroxylase gene)
TPOX (human thyroid peroxidase gene),
CSF1PO (human c-fms proto-oncogene for CSF-1 receptor gene)
SE33 (β-actin related pseudogene)
Penta D (21q22.3)
Penta E (15q26.2)
LPL (intron 6 of the lipoprotein lipase gene)
• polotriviální
Y-GATA-H4
• systematické
D21S11
DYS390
Slide 30
názvosloví STR
alely
• označují se číslem, které vyjadřuje počet opakování základního motivu
alela 7 v lokusu TH01:
[AATG]7
alela 9 v lokusu TH01:
[AATG]9
alela 9.3 v lokusu TH01:
[AATG]6ATG[AATG]3
• tzv. MIKROVARIANTA
• jedno označení může zahrnovat více sekvencí
alela 7
[AATG]6 [AAAG]
[AATG]4 [AAAG] [AATG]2
Slide 31
STR – jak vlastně vznikají nové alely?
• vysoká mutační rychlost: 10-2 to 10-6 nt / lokus / generace
• asi dva základní mechanismy – nerovnoměrný crossing over a chyba při replikaci
• tímto mechanismem vznikají i alely s „tečkou“ = neúplné (9.3)
Slide 32
+n
-n
Slide 33
7
7
8
7
7
7
6.2
8
8
7
8
8
9
9
9
9
9.3
9.3
10
10.3
9.3
10.3
Slide 34
kde najdeme v lidském genomu STR ?
Slide 35
Dědičnost STR – autozomální STR
• klasická mendelovská dědičnost
• homozygozita a heterozygozita
STR lokus, např. TH01
9/9
6 / 9.3
Slide 36
Dědičnost STR – autozomální STR
6
9
8
6/9
6 / 10
8/9
8 / 10
10
Slide 37
Dědičnost STR – X-STR
• nonmendelovská dědičnost
• homozygozita a heterozygozita u žen, hemizygozita u mužů
STR lokus
22 / 22
21 / 24
STR lokus
22
Slide 38
Dědičnost STR – X-STR
22
21
Y
XX
24
XY
22 / 21
22 / 24
Y / 21
Y / 24
Slide 39
Dědičnost STR – Y-STR
• nonmendelovská dědičnost
• jedna kopie lokusu u mužů
STR lokus není
STR lokus
22
Slide 40
Dědičnost STR – Y-STR
X
22
X
XX
XY
X/X
22 / X
Slide 41
SNADNO A RYCHLE
Slide 42
Analýza STR je založena na PCR
POMOCÍ SEKVENČNĚ SPECIFICKÉHO PÁRU PRIMERŮ AMPLIFIKUJI FRAGMENT
OBSAHUJÍCÍ DANOU REPETICI
Slide 43
Analýza STR je založena na PCR
konstantní sekvence
REPETICE
konstantní sekvence
160 – 204 bp
Fragment má délku podle počtu opakování motivu v repetici (např. 160 – 204 bp)
S celkovým rozpětím délek můžu šoupat podle toho kam umístím primery
240 – 284 bp
Slide 44
Při PCR nepoužijeme obyčejné primery, ale jeden v páru
je vždy fluorescenčně značený
Cca polovina vzniklých fragmentů bude mít tudíž
začleněnou fluorescenční barvičku
Slide 45
Barvičky mohou emitovat v různých oblastech spektra
chci od nich, aby:
• byly chemicky stabilní
• velmi dobře emitovaly
• byly fotostabilní (emitovaly bez problémů opakovaně)
Slide 46
Provedu elektroforézu a detekci fluorescenční barvičky
gelová elfo
Hitachi FMBIO II
kapilární elfo
Applied Biosystems 310, 3100
Slide 47
DNA samples are loaded onto
a polyacrylamide gel
Sample Separation
STR alleles separate during
electrophoresis through the
gel
Sample Detection (Post-Electrophoresis)
505 nm scan to detect
fluorescein-labels
585 nm scan to detect
TMR-labels
Slide 48
Argon ion
LASER (488
nm)
Size
Separation
Sample
Separation
ABI Prism
spectrograph
Fluorescence
Capillary
Color
Separation
CCD Panel (with virtual filters)
Sample Detection
Sample
Injection
Processing with GeneScan/Genotyper software
Mixture of dye-labeled
PCR products from
multiplex PCR reaction
Sample Interpretation
Slide 49
Kapilární elfo
Slide 50
Kapilární elfo
Slide 51
Kapilární elfo
Slide 52
Kapilární elfo
Slide 53
Slide 54
ISS = vnitřní standard = „vnitřní žebříček“
35
50
75 100
150
139 160
200
250
300
350
340
400
450
500
490
250bp
200bp
Y bp
160bp
150bp
139bp
X bp
100bp
A
B
Slide 55
různé ISS
GS500 ROX (Applied Biosystems)
ILS600 CXR (Promega)
LTI 50-500 ROX (Life Technologies)
Slide 56
Slide 57
allelic ladder = vnější standard = „vnější žebříček“
160 bp
200 bp
7 8 9 10 11 12 13
160 bp
7
8
9
10
11
12
13
=
=
=
=
=
=
=
170.12
174.23
178.15
182.27
186.24
190.21
194.22
bp
bp
bp
bp
bp
bp
bp
200 bp
A = 174.21 bp = 8
B = 186.19 bp = 11
A
B
Slide 58
alelický ladder konkrétního lokusu
interní ladder celé elektroforézy
Slide 59
off-ladder alely
?
?
13
10
11
10.3
Slide 60
Výsledek analýzy jednoho lokusu
heterozygot 16/17
homozygot 16/16
Slide 61
analýza více lokusů najednou = multiplex PCR
amplifikuji několik STR více páry primerů najednou
(jak prosté, že?)
ale ve skutečnosti je to peklo:
• primery se nesmí lepit = nesmí být komplementární
• primery musí mít stejnou anelační teplotu
• primery musí mít stejné pracovní prostředí
• amplifikace všech lokusů musí být stejně účinná
jak ale pak při elektroforéze poznám, který fragment patří do
kterého lokusu???
Slide 62
rozlišení fragmentů I. = pomocí dye
Slide 63
rozlišení fragmentů II. = pomocí délkových rozsahů
160 – 204 bp
240 – 284 bp
160 – 204 bp
240 – 284 bp
Slide 64
rozlišení fragmentů III. = pomocí modifikátorů mobility
Lokus A
160 – 204 bp
Lokus B
190 – 254 bp
215 – 279 bp
Výhoda – nemusím složitě vylaďovat multiplexy s novými primery
Slide 65
Komerční kity - Identifiler
D8S1179
D7S820
CSF1PO
D21S11
D3S1358
TH01
D13S317
D16S539
D2S1338
D19S433
VWA
TPOX
D18S51
FGA
AMEL
D5S818
Slide 66
Komerční kity - PowerPlex® 16
D3S1358
D5S818
AMEL
VWA
TH01
D21S11
D13S317
D7S820
D8S1179
Penta E
D18S51
D16S539
TPOX
Penta D
CSF1PO
FGA
Slide 67
Některé nemilé jevy I.
stuttering
D8S1179
D21S11
D18S51
Allele
Stutter Product
6.3%
6.2%
5.4%
Slide 68
Některé nemilé jevy I.
stuttering
Sklouznutí polymerázy
1
2
3
5
5’
GATA
GATA
GATA
GATA
3’
CTAT
CTAT
CTAT
CTAT
CTAT
1
2
3
5
6
C
T A
T
4
Lokus je tím náchylnější, čím kratší je motiv
Dinukleotidy mají stuttery a stuttery stutterů
Tetranukleotidy mají stuttery do 15%
Pentanukleotidy prakticky nestutterují
5’
Slide 69
Některé nemilé jevy II.
imbalance heterozygota až alelický drop-out
Slide 70
Některé nemilé jevy III.
Splitting = „upadání adenosinu“ = deadenylace
Forward
Primer
Polymerase extension
5’
3’
3’
5’
Reverse
Primer
Polymerase extension
5’
5’
5’
(-A form)
5’
(+A form)
+A
-A +A
Shoulder peak
Split peak
-A
A
A
-A
+A
Slide 71
Některé nemilé jevy IV.
Interlokusová imbalance
AMEL
D19
D3
TH01
D8
AMEL
D3
D19
D8
VWA
VWA
D21
FGA
D16
D18
D2
D21
TH01
D16
FGA
D18
D2
Slide 72
Některé nemilé jevy V.
mizerná kapilára
Slide 73
Některé nemilé jevy VI.
mutace v místě pro primer
vyvážené heterozygotní
alely
6 8
nevyvážené
heterozygotní alely
6
8
bez mutace
mutace ve středu
vazebného místa
primeru
*
8
mutace na 3’-konci
vazebného místa
primeru
(dropout)
*
alela 6 dropoutuje
Slide 74
tři píky
D21S11
nejčastěji TPOX a D21S11
Možnosti identifikace
osoby prostřednictvím
analýzy DNA
Slide 2
MALÉ REVIEW
SLOVNÍČEK:
Gen = funkční (exprimovaný) úsek DNA
Lokus = jakýkoli úsek či místo v DNA
Marker = znak DNA užívaný při testování
Alela = konkrétní varianta(forma) genu/lokusu/markeru
Polymorfismus = existence více alel v témže
genu/lokusu/markeru
Lidský genom
cca 3 miliardy nukleotidů (2x)
max 10% kódující (geny), 90% nekódující
max 30 tisíc genů
Slide 3
INDIVIDUALITA
V čem tkví genetická jedinečnost?
Nepolymorfní
gen/lokus/marker
Nízce polymorfní
gen/lokus/marker
Vysoce polymorfní
gen/lokus/marker
Slide 4
INDIVIDUALITA
V čem tkví genetická jedinečnost?
GENETICKÝ
PROFIL
Vysoce polymorfní lokus 1
Vysoce polymorfní lokus 2
Vysoce polymorfní lokus 3
Vysoce polymorfní lokus 4
Vysoce polymorfní lokus 5
Slide 5
INDIVIDUALITA
V čem tkví genetická jedinečnost?
1986
VNTR
2000
STR
201X
?
SNP
Slide 6
90% nekódující sekvence
10% kódující sekvence a spol.
méně než 50% jedinečné sekvence
přes 50% repetitivní sekvence
Slide 7
Nuclear genome
3000 Mb
65-80000 genes
30%
Genes and generelated sequences
Mitochondrial genome
16.6 kb
37 genes
70%
Extragenic
DNA
Unique or moderately repetitive
10%
90%
Coding
DNA
Pseudogenes
Noncoding
DNA
Gene
fragments
Introns,
untranslated
sequences, etc.
Two rRNA
genes
22 tRNA
genes
13 polypeptideencoding genes
80%
20%
Unique or
low copy
number
Moderate to
highly
repetitive
Tandemly
repeated
or clustered
repeats
Interspersed
repeats
Slide 8
ROSTE S:
• mutační rychlostí lokusu (HOT SPOTS)
• stářím lokusu
• evoluční výhodou variability (pozitivním selekčním
tlakem na nové mutace) (např. HLA)
KLESÁ S:
• účinností reparačních mechanismů (nDNA vs. mtDNA)
• negativním selekčním tlakem na nové mutace (GENY)
Slide 9
Slide 10
rozptýlené
LINE
SINE
krátký
motiv
dlouhý
motiv
VNTR
STR
tandemové
Slide 11
Rozptýlené repetitivní sekvence
Většina rozptýlených repetic má původ v transpozibilních elementech
DNA transpozony
• gen pro transpozázu + na obou koncích
invertovaná repetitivní sekvence (vzniká
útvar stopka-očko)
• mechanismus cut´n´paste (jako při
zrání imunoglobulinů a TLR)
• u lidí už neaktivní (mutace), ale…!!!
Retrotranspozony
• pro skákání používají buněčné RNA polymerázy
• mechanismus copy´n´paste
• u lidí aktivní, tvoří přes 45% genomu, aktivní je jen
každá cca 100 kopie (mutace)
• jsou buď autonomní (kódují potřebné proteiny), nebo
neautonomní (využívají proteinový aparát jiných
transpozónů)
Slide 12
LTR retrotranspozony – endogenní retroviry
• připomínají svým složením proviry skutečných retrovirů
• obsahují LTR (long terminal repeats, dlouhé terminální repetice) a geny gag, pol,
env a prt
• alespoň jeden z genů nezbytných pro sestavení infekčních virových částic je
mutován nebo chybí → mohou se pohybovat pouze uvnitř buněk
• životní cyklus podobný infekčním retrovirům jako je HIV
• lidský genom v současné době obsahuje pouze fosilie endogenních retrovirů – cca
8% genomu
• Intaktní endogenní retroviry dlouhé 7-9 kb, ale také mnoho zkrácených
• často lze najít pouze samostatné LTR
Slide 13
non-LTR retrotranspozony
LINE = long interspearsed nuclear elements
• autonomní retrotranspozóny
• cca 21% lidského genomu
• rozeznáváme různé rodiny – LINE1 (L1), LINE 2, LINE 3 …
• LINE1 jsou aktivní (17% genomu) – 500 000 kopií, z toho cca 100 stále schopno
transpozice
• aktivní element L1 je dlouhý cca 6 kb
• obsahuje ORF1 (?) a ORF2 (reverzní transkriptáza)
Slide 14
neautonomní retrotranspozony
SINE = short interspearsed nuclear elements
• typicky kratší než 500 bp
• nejpočetnější rodinou jsou Alu repetice
• Alu mohou být náhodně aktivní (11% genomu) – 1 000 000 kopií
• obsahují sekvenci 282 bp - patrně odvozena z RNA podjednotky SRP (7SL RNA)
• SRP = signal recognition particle - ribonukleoproteinový komplex - rozpoznává signální
peptid, váže se na něj a přemístí komplex ribozom-mRNA-nascentní peptid ke kanálu
endoplazmatického retikula (ER), skrz nějž je nascetní peptid translokován do lumenu ER nebo
integrován v membráně ER
• Alu se tak může vázat na ribozom a díky svému "ocasu" bohatému na adenin také (pokud
ribozom zrovna zpracovává LINE-1 mRNA) na nascentní protein ORF2 a zneužít ORF2 k reverzní
transkripci a integraci vlastní RNA a nikoli LINE-1
Slide 15
Slide 16
funkce transpozónů
junk DNA, selfish DNA…
• ze širšího hlediska – důležitá role – zvyšuje plasticitu genomu
• vyřazení genu z provozu
• změna exprese genu
• transpozice jinak netranspozibilních elementů (svezou se)
• indukce delecí, inverzí
• geny odvozené z transpozónů
• podpora mezichromozomového nerovnoměrného crosing-overu nebo
intrachromozomové rekombinace
• uvažuje se o tom, že by transpozony mohly mít nějakou reálnou fyziologickou funkci,
např. proto, že jejich exprese je obecně zvýšena během stresové odpovědi
Slide 17
tandemově repetitivní sekvence
VYSOCE REPETITIVNÍ
NÍZCE REPETITIVNÍ
SINGLE COPY SEKVENCE
• rRNA, tRNA a
histonové geny
• α-satelity
• minisatelity = VNTR
• mikrosatelity = STR
Slide 18
α-satelitní DNA
• primární jednotka dlouhá 171 bp
• tvoří funkční jádro centromery
• některé proteiny kinetochory se váží na alfa
satelit v centromeře a tím zahajují sestavování
kinetochory
Slide 19
minisatelitní DNA = LTR (dlouhé tandemové)
• primární jednotka (motiv) dlouhá řádově desítky bazí – vzniká z mikrosatelitů
• více se vyskytují v subtelomerických oblastech chromozómů
• lze sem zařadit i cíleně vznikající TTAGGG repetice v oblasti telomer
Slide 20
VNTR – co to je?
• VNTR (Variable Number of
Tandem Repeats) označuje vlastně
obecně jev, na němž byly založeny
první identifikace, tj. existenci
variability počtu opakování motivu
v repetici
• tyto první testy prováděl
Alec Jeffreys
Slide 21
VNTR
• Jeffreys studoval gen pro myoglobin
• zjistil, že v jednom z intronů je repetitivní
sekvence
• rozhodl se ji studovat tak, že vytvoří specifickou
sondu, provede restrikci a vzniklou směs
fragmentů bude hybridizovat se sondou
• sonda však nenašla jen jedno, ale celou řadu
cílových míst – vznikl hybridizační vzor
• Jeffreys zjistil, že tento vzor je různý u různých
osob
• způsob, jak zobrazit jedinečnost genomu, byl
objeven
Slide 22
metoda se nazývá RFLPs
• DNA je inkubována s restriktázou
• Mnoho možností, které restriktázy užít
(i kombinace více restriktáz)
• DNA lze poté zviditelnit s použitím
specifické sondy – výsledný hybridizační
obraz je u různých osob různý (Restriction
Fragment Length Polymorphisms)
• Délkový i sekvenční polymorfismus!!!
Slide 23
RFLP: Elektroforéza
Slide 24
RFLP: Autoradiogram
Slide 25
Jak jedinečné tyto obrazce jsou?
Těžko říct…
• The probability of 2 people having exactly the
same DNA profile is between
1 in 5 million to
1 in 100 billion
(greater than the population of humans on earth)
• This number becomes even larger if you
consider more regions of DNA
• Thus, the odds that the DNA evidence from a
crime scene will match your DNA profile is
astronomically small (unless you have an evil
identical twin)
Slide 26
mikrosatelitní DNA = STR
• primární jednotka (motiv) dlouhá řádově jednotky bazí (do 10 bp)
• počet opakování motivu v jednom lokusu řádově jednotky až stovky
• nejčastější jsou dinukleotidové (CA)n
• po celém genomu, ve valné většině mimo geny, ale jsou výjimky
onemocnění z expanze trinukleotidových repetic
Huntingtonova chorea
• huntingtin - repetitivní sekvence (CAG)n v exonu
kóduje úsek bílkoviny tvořený zbytky glutaminu
• doména pro interakce s jinými proteiny
• normálně do 20 Glu, nad 30 Glu začíná problém
myotonická dystrofie
• DMPK - repetitivní sekvence (CTG)n v nepřekládané
3´části genu
• při expanzi je mRNA patogenní – sekvestrace
(odlučování) transkripčních faktorů
Slide 27
mají STR nějakou funkci?
• možná ano…!
• mnoho indicií, žádné nezvratné důkazy…
• některé dinukleotidy asi spojeny s regulací genové exprese (jsou před promotorem)
• některé dinukleotidy asi fungují jako rekombinační hot-spoty
• některé ale asi opravdu k ničemu
Slide 28
klasifikace STR
dle délky motivu:
• mono- -AAAAAA• di-
-TATATA-
• tri-
-TACTAC-
• tetra-
-GAGCGAGC-
•…
dle stavby motivu:
• perfect
- CACACACACACACACACACA –
• imperfect
- CACACACACACTCACACACA –
• interrupted
- CACACACAGTTCCACACACA –
• composite
- CACACACACACTCTCTCTCT –
Slide 29
názvosloví STR
lokusy
• triviální FGA (located in the third intron of the human alpha fibrinogen gene)
vWA (von Willebrand Factor, 40th intron)
TH01 (intron 1 of human tyrosine hydroxylase gene)
TPOX (human thyroid peroxidase gene),
CSF1PO (human c-fms proto-oncogene for CSF-1 receptor gene)
SE33 (β-actin related pseudogene)
Penta D (21q22.3)
Penta E (15q26.2)
LPL (intron 6 of the lipoprotein lipase gene)
• polotriviální
Y-GATA-H4
• systematické
D21S11
DYS390
Slide 30
názvosloví STR
alely
• označují se číslem, které vyjadřuje počet opakování základního motivu
alela 7 v lokusu TH01:
[AATG]7
alela 9 v lokusu TH01:
[AATG]9
alela 9.3 v lokusu TH01:
[AATG]6ATG[AATG]3
• tzv. MIKROVARIANTA
• jedno označení může zahrnovat více sekvencí
alela 7
[AATG]6 [AAAG]
[AATG]4 [AAAG] [AATG]2
Slide 31
STR – jak vlastně vznikají nové alely?
• vysoká mutační rychlost: 10-2 to 10-6 nt / lokus / generace
• asi dva základní mechanismy – nerovnoměrný crossing over a chyba při replikaci
• tímto mechanismem vznikají i alely s „tečkou“ = neúplné (9.3)
Slide 32
+n
-n
Slide 33
7
7
8
7
7
7
6.2
8
8
7
8
8
9
9
9
9
9.3
9.3
10
10.3
9.3
10.3
Slide 34
kde najdeme v lidském genomu STR ?
Slide 35
Dědičnost STR – autozomální STR
• klasická mendelovská dědičnost
• homozygozita a heterozygozita
STR lokus, např. TH01
9/9
6 / 9.3
Slide 36
Dědičnost STR – autozomální STR
6
9
8
6/9
6 / 10
8/9
8 / 10
10
Slide 37
Dědičnost STR – X-STR
• nonmendelovská dědičnost
• homozygozita a heterozygozita u žen, hemizygozita u mužů
STR lokus
22 / 22
21 / 24
STR lokus
22
Slide 38
Dědičnost STR – X-STR
22
21
Y
XX
24
XY
22 / 21
22 / 24
Y / 21
Y / 24
Slide 39
Dědičnost STR – Y-STR
• nonmendelovská dědičnost
• jedna kopie lokusu u mužů
STR lokus není
STR lokus
22
Slide 40
Dědičnost STR – Y-STR
X
22
X
XX
XY
X/X
22 / X
Slide 41
SNADNO A RYCHLE
Slide 42
Analýza STR je založena na PCR
POMOCÍ SEKVENČNĚ SPECIFICKÉHO PÁRU PRIMERŮ AMPLIFIKUJI FRAGMENT
OBSAHUJÍCÍ DANOU REPETICI
Slide 43
Analýza STR je založena na PCR
konstantní sekvence
REPETICE
konstantní sekvence
160 – 204 bp
Fragment má délku podle počtu opakování motivu v repetici (např. 160 – 204 bp)
S celkovým rozpětím délek můžu šoupat podle toho kam umístím primery
240 – 284 bp
Slide 44
Při PCR nepoužijeme obyčejné primery, ale jeden v páru
je vždy fluorescenčně značený
Cca polovina vzniklých fragmentů bude mít tudíž
začleněnou fluorescenční barvičku
Slide 45
Barvičky mohou emitovat v různých oblastech spektra
chci od nich, aby:
• byly chemicky stabilní
• velmi dobře emitovaly
• byly fotostabilní (emitovaly bez problémů opakovaně)
Slide 46
Provedu elektroforézu a detekci fluorescenční barvičky
gelová elfo
Hitachi FMBIO II
kapilární elfo
Applied Biosystems 310, 3100
Slide 47
DNA samples are loaded onto
a polyacrylamide gel
Sample Separation
STR alleles separate during
electrophoresis through the
gel
Sample Detection (Post-Electrophoresis)
505 nm scan to detect
fluorescein-labels
585 nm scan to detect
TMR-labels
Slide 48
Argon ion
LASER (488
nm)
Size
Separation
Sample
Separation
ABI Prism
spectrograph
Fluorescence
Capillary
Color
Separation
CCD Panel (with virtual filters)
Sample Detection
Sample
Injection
Processing with GeneScan/Genotyper software
Mixture of dye-labeled
PCR products from
multiplex PCR reaction
Sample Interpretation
Slide 49
Kapilární elfo
Slide 50
Kapilární elfo
Slide 51
Kapilární elfo
Slide 52
Kapilární elfo
Slide 53
Slide 54
ISS = vnitřní standard = „vnitřní žebříček“
35
50
75 100
150
139 160
200
250
300
350
340
400
450
500
490
250bp
200bp
Y bp
160bp
150bp
139bp
X bp
100bp
A
B
Slide 55
různé ISS
GS500 ROX (Applied Biosystems)
ILS600 CXR (Promega)
LTI 50-500 ROX (Life Technologies)
Slide 56
Slide 57
allelic ladder = vnější standard = „vnější žebříček“
160 bp
200 bp
7 8 9 10 11 12 13
160 bp
7
8
9
10
11
12
13
=
=
=
=
=
=
=
170.12
174.23
178.15
182.27
186.24
190.21
194.22
bp
bp
bp
bp
bp
bp
bp
200 bp
A = 174.21 bp = 8
B = 186.19 bp = 11
A
B
Slide 58
alelický ladder konkrétního lokusu
interní ladder celé elektroforézy
Slide 59
off-ladder alely
?
?
13
10
11
10.3
Slide 60
Výsledek analýzy jednoho lokusu
heterozygot 16/17
homozygot 16/16
Slide 61
analýza více lokusů najednou = multiplex PCR
amplifikuji několik STR více páry primerů najednou
(jak prosté, že?)
ale ve skutečnosti je to peklo:
• primery se nesmí lepit = nesmí být komplementární
• primery musí mít stejnou anelační teplotu
• primery musí mít stejné pracovní prostředí
• amplifikace všech lokusů musí být stejně účinná
jak ale pak při elektroforéze poznám, který fragment patří do
kterého lokusu???
Slide 62
rozlišení fragmentů I. = pomocí dye
Slide 63
rozlišení fragmentů II. = pomocí délkových rozsahů
160 – 204 bp
240 – 284 bp
160 – 204 bp
240 – 284 bp
Slide 64
rozlišení fragmentů III. = pomocí modifikátorů mobility
Lokus A
160 – 204 bp
Lokus B
190 – 254 bp
215 – 279 bp
Výhoda – nemusím složitě vylaďovat multiplexy s novými primery
Slide 65
Komerční kity - Identifiler
D8S1179
D7S820
CSF1PO
D21S11
D3S1358
TH01
D13S317
D16S539
D2S1338
D19S433
VWA
TPOX
D18S51
FGA
AMEL
D5S818
Slide 66
Komerční kity - PowerPlex® 16
D3S1358
D5S818
AMEL
VWA
TH01
D21S11
D13S317
D7S820
D8S1179
Penta E
D18S51
D16S539
TPOX
Penta D
CSF1PO
FGA
Slide 67
Některé nemilé jevy I.
stuttering
D8S1179
D21S11
D18S51
Allele
Stutter Product
6.3%
6.2%
5.4%
Slide 68
Některé nemilé jevy I.
stuttering
Sklouznutí polymerázy
1
2
3
5
5’
GATA
GATA
GATA
GATA
3’
CTAT
CTAT
CTAT
CTAT
CTAT
1
2
3
5
6
C
T A
T
4
Lokus je tím náchylnější, čím kratší je motiv
Dinukleotidy mají stuttery a stuttery stutterů
Tetranukleotidy mají stuttery do 15%
Pentanukleotidy prakticky nestutterují
5’
Slide 69
Některé nemilé jevy II.
imbalance heterozygota až alelický drop-out
Slide 70
Některé nemilé jevy III.
Splitting = „upadání adenosinu“ = deadenylace
Forward
Primer
Polymerase extension
5’
3’
3’
5’
Reverse
Primer
Polymerase extension
5’
5’
5’
(-A form)
5’
(+A form)
+A
-A +A
Shoulder peak
Split peak
-A
A
A
-A
+A
Slide 71
Některé nemilé jevy IV.
Interlokusová imbalance
AMEL
D19
D3
TH01
D8
AMEL
D3
D19
D8
VWA
VWA
D21
FGA
D16
D18
D2
D21
TH01
D16
FGA
D18
D2
Slide 72
Některé nemilé jevy V.
mizerná kapilára
Slide 73
Některé nemilé jevy VI.
mutace v místě pro primer
vyvážené heterozygotní
alely
6 8
nevyvážené
heterozygotní alely
6
8
bez mutace
mutace ve středu
vazebného místa
primeru
*
8
mutace na 3’-konci
vazebného místa
primeru
(dropout)
*
alela 6 dropoutuje
Slide 74
tři píky
D21S11
nejčastěji TPOX a D21S11