Transcript Stáhnout
Viry a mobilní DNA Viry – kapitola 21 Mobilní DNA – kapitola 22 Viry • Buněční parazité kompletně závislí na hostitelské buňce • Neexistuje aparát pro translaci, replikaci a pro tvorbu ATP • Virová částice (virion) obsahuje DNA nebo RNA a je obalena proteinovým kabátem (kapsida) • Being alive (virus) vs. living cells • • • • • DNA – genetická informace RNA – poslíček Ribozomy – translace Proteiny – výroba ATP Membrány – strukturní integrita Morfologie viru • Kapsida (kapsidový protein – je kódován virem) • NK • Helikální vláknité viry • 5-10nm v průměru • Dlouhé až 1000nm • NK vázáná ze vnitř • Ikosaedrické viry • Dvacetistěn • Kapsida T1 - 60 molekul jednoho proteinu (2-5kb) • Kapsida T4 – 240 molekul (pojme přes 10kb) VIRION Morfologie viru • Komplexní struktura • Kolem kapsidy ještě obal z napadené buňky (viry savčích buněk) • Pučí z membrány, do které byl zabalen virový protein • Bakteriofág • • • • Ikosaedrická hlavička Šroubovitý bičík Vlákna basální destička Variabilita virového světa • Infikují bakteriální, rostlinné a živočišné buňky • Nejmenší virus má pouze 3 geny, nejkomplikovanější virus má 200300 genů • Nejčastější velikost genomu je 8-20kb (6-15 genů) • Mimiviruses • Isoheadrický, 0,75uM • 1,2Mbp genom, 900 genů • Pandoraviruses • Objeveny v roce 2013 • Genom 1.9 – 2.5 Mbp • 2556 genů Životní cyklus typického viru • Přichycení se viru na hostitelskou buňku • Vstup do buňky • Pouze NK • Celý nukleokapsid • Replikace virového genomu • Ranné geny • Pozdní geny • Výroba virových proteinů • Sbalení virových částic • Uvolnění virů do okolí (smrt hostitelské buňky) Životní cyklus typického viru • Ranné geny • jejich promotory připomínají promotory hostitelské buňky • kódují proteiny důležité pro replikace • Pozdní geny • u některých virů jsou tyto geny přepisovány virovou RNA polymerázou • kódují proteiny kapsidy Variabilita virového světa • DNA viry • Replikují se DNA polymerázou • ssDNA • dsDNA • RNA viry • Replikují se vlastní RNA dependentní RNA polymerázou, či reverzní transkriptázou • ssRNA • Plusový (pozitivní) řetězec • Záporný (negativní) řetězec • dsRNA • Lineární nebo cirkulární • Replikace pomocí otáčivé kružnice • u lineárních dojde k cirkularizaci DNA/RNA Variabilita virového světa RNA viry • Výhody • + RNA vlákno je ihned připraveno k translaci • k replikaci doachází v cytoplasmě (vyhnou se jádru plného různých enzymů na úpravu RNA) • Nevýhody • RNA polymerace pomocí RNA dependentní RNAP= RNA replikáza • nevyskytuje se v buňce a tím pádem se nemohou spoléhat na buněčný aparát • Chybějí ssRNA vazebné proteiny, helikáze atd • Syntéza minus vlákna, které musí být odstraněno při sbalování do kapsidy • Nemohou si dovolit příliš velké genomy – chyba RNAP je 1/10kb • Maximální velikost genomu je 20kb Replikační strategie RNA virů • • • • Vlastní RNA dependentní RNA polymeráza V cytoplasmě Obvykle kódují 3-8 proteinů Problémy: • Některé geny je třeba přeložit častěji než jiné • Polyproteinová strategie (autokatalytický sestřih vlastních proteinů) (picornaviry) • Ignorace stop kodónů a start kodónů • Subgenomová mRNA (alphaviry) • Virová mRNA je „přitažlivější“ pro ribozom než vlastní mRNA • Plus RNA musí mít čepičku již od bývalého hostitele • Minus RNA – dojde k replikaci ( k segmentaci) a k přidání čepičky (virová RNAP – 2000AA, polyfunkční) • Replikace virové RNA • RNAP • Fungují současně jako helikázy a SSB RNA viry baktérií • Nejmenší genomy vůbec • Pouze 3 geny (4 proteiny) • Kapsidový protein • RNA replikáza • Lytické proteiny (A1,A2), který lyzuje bakteriální stěnu • Příklad: • Bakteriofág Qβ, infikuje E. coli • ssRNA (+), 4700bp Pozitivní ss RNA viry • Picornaviry • Obrna, nachlazení, hepatitida A, kulhavka a slintavka • 12 genů • RNA (+) vlákno je využíváno k translaci (bezčepičková translace) • Má 3‘ poly A konec • 5‘ konec je chráněn proteinem Vpg nahrazující čepičku (nutný pro replikaci), pro translaci je důležitá sekvence 150 – 600bp poté • Viry kódují proteázu štěpící CBP faktor-vyřadí tím všechny buněčné mRNA • Je vytvářen polyprotein, který je následně naštípán na 10 – 20 proteinů • Repilkační cyklus alphaviru - ss (+) RNA virus • • • Průnik do buňky endocytózou Virový genom je vpuštěn do cytoplasmy 1 nestrukturální polyprotein (nsPs) je přepsán • nsP1 – syntéza negativního vlákna • nsP2 – RNA helikáza, proteináza – zastavuje transkripci hostitele • nsP3 – replikáza • nsP4 – RNAP • • Syntéza celého minus vlákna • templát pro syntézu subgenomické RNA polyprotein C-pE2-6K-E1 • templát pro syntézu • genomické RNA Sbalení virové částice a vypučení ven Biology and pathogenesis of chikungunya virus Olivier Schwartz & Matthew L. Albert Negativní ss RNA viry • Evolučně velmi mladá skupina virů • Velmi virulentní • Vzteklina, spalničky, příušnice, chřipka, Ebola etc. • Vnější membrána je odvozena od membrány hostitelské buňky • Musí si přinést svou RNP komplexy • Genomová RNA má na svých koncích vždy invertované repetice 15 -20bp dlouhé • N-P-M-G-L geny (na + řetězci) • Protein N • povrch kapsidy • Anti-terminační účinky • Až 100x více než proteinu G Messenger RNA Cap Methylation in Vesicular Stomatitis Virus, a Prototype of Non‐Segmented Negative‐Sense RNA Virus Jianrong Li1, 2, 3 and Yu Zhang1 dsRNA viry • dsRNA viry • • • • Poměrně vzácné Asi 12 kusů dsRNA, každý kóduje jeden protein Rotaviry Replikační komplexy jsou uvnitř kapsidy DNA viry • Replikují se v jádře buňce a využívají běžných buněčných mechanismů pro replikaci a transkripci • Musí se vyrovnat se striktní kontrolou buněčného cyklu • Virus bývá schopen produktivní infekce jen za nepříznivých okolností a v omezeném spektru tkání • Většinou je infekce latentní Transformace buněk – oslabení kontroly buněčného cyklu směřující k neomezenému množení Začlenění DNA viru do genomické DNA dsDNA viry • dsDNA viry baktérií • typický baktériofág • T4, lambda, P1, Mu • dsDNA viry vyšších organismů • Papaoviry (polyoma a papiloma) • Nejmenší dsDNA viry (5kb) • T-antigen • Protein ovlivňující buněčný cyklus (vyvazuje p53 protein, vstup do S fáze) • Při dostatečném množství iniciuje replikace virového genomu • Latentní infekce vedou ke vzniku nádorů • Herpesvirus • • • • Opar, sexuálně přenosný herpes, plané neštovice, mononukleózu Největší jaderné DNA viry (150 – 230kb) Obrovský arsenál vlastních proteinů Latentní herpesviry DNA viry • dsDNA viry vyšších organismů • Poxvirus • Velmi komplexní (150 – 200 genů) • viditelné pod světelným mikroskopem (0,4 -0,2 uM) • K replikace dochází v cytoplasmě buňky (jako jediný DNA virus) • V kapsidě má svou RNAP, 2-3 transkripční faktory, 3 enzymy pro syntézu a metylaci čepičky, DNA topoisomerazu, DNAP • dsDNA viry rostlin • Poměrně vzácné • CMV virus – cauliflower mosaic virus Bakteriální virus - bakteriofág • Objeveny v roce 1917 • Phage – řecké slovo pro „ jíst“ • Využívány hojně v molekulární biologii • Bakteriofág - nejvíce studovaný organismus • Pouze DNA/RNA vstupuje do buňky • 1952 – pokus s bakteriofágem ukazující, že DNA je nositelem genetické informace • Fágové – nejpočetnější skupina živé formy • • • • 1030 baktérií, každá má 10 fágů 1031 fágů Mořská voda – 50x106 virů na 1 ml Ničí 40% baktérií denně – koloběh uhlíku Životní cyklus bakteriofága • Navázání se na buňku • Vstup do buňky • Vstupuje pouze DNA/RNA • • • • Replikace virového genomu Výroba virových proteinů Sbalení nových virových částic Uvolnění z buňky Expresní strategie dsDNA fágů • 95% všech fágů je ds DNA • Proces infekce: • Časná fáze • Slabá transkripce časných genů bakteriální RNAP • Transkripční geny • Geny interferující s restričkním systémem baktérií • Proteiny zabraňující superinfekci • Střední fáze • Transkripce hlavních fágových replikačních proteinů • Pozdní fáze • Intesivní replikace fágové DNA • Silná exprese kapsidových proteinů Lytický vs latentní cyklus LYSIS LYSOGENIC cro je ON/ cI je OFF cro je OFF/ cI je ON Exprese fágových genů je ON Exprese fágových genů je OFF 20-40 minut 10 – 100 fágů Plak 4-10mm Virus integrovaný do genomu – provirus, prophage Integrace do genomu může být přes definovaná místa ( attachment site), nebo náhodná Louis Pasteur ( 1822 – 1895) Zakladatel moderni lékařské mikrobiologie pasterizace/sterilizace podpora teorie, že za nemocí stojí choroboplodné zárodky První vakcinace za použití laboratorně oslabeného organismu (viru, či bakterie) Vakcína proti anthrax a vzteklině Eradikace neštovice Edward Jenner (1749 – 1823) Virus Variola major, V. minor Vaccinace=vacca=kráva 20. století – 300-500 milion lidí umírá 26.10. 1977 – poslední případ 9.12. 1979 - eradikace 1986 – konec očkování 2 vzorky stále na světě (CDC, Atlanta a State Research Center for Virogology, Koltsovo, Russia) Nebezpečí použití jako biologické zbraně Vítězství nad obrnou Jonas Salk (1914 – 1955) virolog Vakcína proti dětské obrně Obrna patřila mezi nejobávanější nemoci poválečných let 1952 – 58 000 případů obrny 1954 – klinické testy, nejrozsáhlejší vůbec (1 800 000 dětí se účastnilo testů) 12.4.1955 - vakcína funguje 1962 – orální vakcína (Albert Sabin) Mobilní elementy - transpozony • Mobilní DNA – dochází k přesunu DNA v rámci jádra (přesun na různé chromozómy • Skákající geny, mobilní elementy, kontrolující elementy atd. • proces je nazýván transpozice • Transpozony nejsou nikdy samostatně • Transpozony • DNA • RNA - Retroposony • Způsoby transpozice • Konzervativní (cut and paste) • Replikativní (copy and paste) DNA transpozon • Inverzní repetice na svých koncích • 9-40 bází • ORF 1kb – transponáza • Frekvence transpozice je 1/1000 až 1/10000 na 1 transpozon na buňku • Cílová sekvence – rozpoznávána transponázou • 3-9bp • Transponózy nesou geny pro resistenci na antibiotika, virulentní geny, metabolické geny 750 nt – 15,000 nt Cut and paste transpozice • Konzervativní (nereplikativní) Cut and copy transpozice • Replikativní (nekonzervativní) • Více komplexní transpozice • Resolváza rozeznáva interní místo (cílovou sekvenci) • Částečně palindromická sekvence 30-40bp • Dochází k replikaci transponózu Cut and copy transpozice transponáza transponáza resolváza Bakteriální transpozony • 1. transpozóny, u nichž byla definována molekulární podstata • Nejjednodušší transpozóny • Inserční sekvence – IS • IS1, IS2 atd. • 750 – 1500 bp dlouhé, repetitivní konce jsou 10 – 40bp • Pouze cut-paste transpozice • Transponóza je exprimována pouze, když dojde k posunu o jednu bázi – ne moc běžné • Jinak exprese regulačního proteinu A – transkripční reulátor • Neregulovaná transpozice by vedla ke zničení chromozómu Regulace transpozice Tn10 • • • • Bakteriální transpozón Kompozitní transpozón nesoucí gen pro resistenci na tetracyklin Transpozice nereplikativním způsobem Transpozice je silně regulována • Antisense RNA (transript z Pout se překrývá s Pin) • Mutace transponázy v IS1 OL • Transpozice je inhibován dam methylací (GATC sekvence promotoru transponázy, k transpozici docházi v pouze momentě replikace, kdy DNA není methylována) Transponáza zmutovaná 1-10% aktivity Transponáza plně funkční Bakteriofág Mu • Virus vs transpozón • Genom 38kb • Po infekci se integruje do genomu pomocí nereplikativní transpozice • Promotory replikačních genů jsou zareprimovány represorem • Fág je stabilní a nepřesouvá se • Vhodný podnět (SOS reakce) – ranný promotor se odblokuje, nastane silná replikativní transpozice, přemístí si až 100x • Odblokuje se i pozdní promotor – syntéza kapsidových proteinů Transposony vyšších organismů • Barbara McClintock (Nobelova cena v roc 1983) • Experimenty s kukuřicí (maize) • Ac/Ds rodina transpozonů • Ac – aktivátor • Ds - disociátor • • • • Repetitivní konce 11 bazí Cílová sekvence – 8bp Ac element je 4500bp, plně funkční Ds element je defektni Ac element Další typy DNA transpozónů • P elements – Drosophilla melanogaster • Objeveny Margaret Kidwell při studui hybdridní dysgeneze • M kmen – v laboratoři od 1905 • P kmen – v přírodě • Křížením M kmene (samice) a P kmene (samce) – sterilní potmostvo • V M kmenech v somatických buňkách se translatuje represor • P elementy jsou využívány v genetice • Vypínání genů • Taggovaní genů • Příprava mutantů Další typy DNA transpozónů • Tc1/Mariner like transpons – všude, nejběžbější typ transpozónu • Sleeping beauty transpozon (usnul před 10-15 milióny let) • Transpozóny obratlovců jsou většinou zmutované a nefunkční • Zrekonruován původní transpozón – velmi aktivní • „virulence“ transpozónů klesá v průběhu evoluce RNA transpozóny - retroposony • Původní RNA transkripty, která se reverzní transkripcí změnily na DNA a integrovaly se zpět do chromozómů • Po transkripci své DNA jsou schopni transpozice – kódují si vlastní reverzní transkriptázu (RT) • Retroposon je transpozon, který je mobilizovaný ve formě RNA, která musí být přepsána do cDNA • Transponová RNA je v jádře volná a tudíž umožňuje transpozici do vzdálených míst • • • • Musí kódovat transponázu Musí kódovat RT Případně proteiny chránící před všudepřítomnými Rnázami Proteiny, které umí zabalit RNA a chránit ji • Virová (LTR) nadrodina • LTR – long terminal repeats • Nevirová (non LTR) nadrodina • U rostlin a živočichů představují až 50% genomu LTR retroposony • Objeveny Geery Finkem v 80. letech • Kvasinkový systém, mutace v His4 genu (1500 různých, dvě revertují) • Ty elementy kvasinky • Ty1, Ty2, Ty3, Ty4 a Ty5 • Jejich transkripty představují as 5% veškeré mRNA v buňce • ~6.3 kb, 330 dlouhé LTR • Frekvence transpozice 10-7 az 10-8 • Velmi podobné retrovirům, jen nemají (ztratili, nebo ještě nezískali) ORF pro env • Copia elementy D. melanogaster • ~5000bp, 276 dlouhé LTR • 20 – 60 kopií na buňku • Frekvence transpozice 10-3 az 10-4 LTR retroposony LTR retroposony Retroviry • Vir obsahuje ssRNA (pozitivní) • Především u ptáků a savců • V hostitelské buňce může být integrován do DNA • Reverzní transkriptáza • Nejpůvodnější a nejprimitivbější • Je velmi pomalá a chybující, bez korektury • Templát je okamžitě degradován (Rnase H aktivita) • Některé retroviry jsou původci rakovinných změn v lidském těle Replikační cyklus retroviru Nikdy nedochází k translace retrovirové RNA Virus si přináší reverzní transkriptázu Integrázu tRNA Reverzní transkriptáza integráza Genom retroviru • Gag – kapsidové proteiny • Matrixový • Kapsidový • Nukleokapsidový – váže virovou RNA • Pol – enzymy • Proteáza • Reverzní transkriptáza • integráza • Env – obalové proteiny • povrchový protein • Transmembránový protein Unikátní U5 sekvence + PBS sekvence Silný promotor v U3 oblasti Pouze jeden – retrovirus kombinuje strategii subgenomových mRNA s polyproteinovou Non LTR retroposony • Nevirové • Sestřihové pseudogeny • Úseký, odpovídající cDNA kopii transkriptu RNA (někeré mají dokonce poly A/T) • Nejsou funkční • nejsou hojné (pouze 0,5% genomu člověka) • LINES – long interspersed nuclear sequences • SINES – short interspersed nuclear sequences LINES • • • • Genomové cDNA kopie transkriptů RNAP II a III Jsou velmi hojné, velmi příbuzné K transpozici L1 dojde u 10 z 250 lidí (pouze v zárodečné linii) 2 ORF • RNA vazebný protein • RT s nukleázou SINES • • • • • Nejznámější tzv. Alu sekvence (200bp) cDNA kopie transkriptů RNAP III (připomínají sekvence 7SL RNA) Až milióny kopií v genomu 10% genomu Tvoří významnou část repetitivní DNA jsou náhodně roztroušené Význam transpozónů v lidském genomu C-paradox • Chybí korelace mezi velikostí genomu a biologickou komplexností ssDNA viry baktérií • Bakteriofág X174 • 5386 bp, 11 genů • 5 genů se překrývá • Gen D a gen E • Gen D důležitý pro sbalení kapsidy • Gen E rozrušuje bakteriální stěnu a umožňuje uvolnění viru z buňky • Bakteriofág M13 • Dlouhé filamentum • Infikuje pouze F baktérie • M13 virus nezabíjí baktérie, používá se na přípravu ssDNA Replikace retrovirů RNA DNA Strong stop minus DNA PBS sekvence Spárování Dlouhý usek pyrimidinů, který není schopna RT rozštípat