Transcript Stáhnout

Molekulární biologie
3.
Transkripce
u prokaryot a eukaryot
(kapitola 11)
(regulace transkripce – zvláštní přednáška příště)
Transkripce – proces, při kterém je informace z DNA převedena do RNA. DNA pouze
uchovává informaci, ale kromě toho sama není zdrojem funkcí nutných pro život
buňky. Slouží jako tempát pro výrobu RNA (mRNA i nekódující RNA) a proteinů.
RNA
• messenger RNA (mRNA) - kóduje informaci pro výrobu proteinů
• nekódující RNA – plní funkci sama o sobě, nekóduje proteiny (tRNA,rRNA,snRNA…)
vlákna jsou od sebe dočasně oddělena (denaturují)
antisense vlákno
(templátové, nekódující)
vyrobeno nové vlákno
RNA
sense vlákno
(netemplátové, kódující)
• RNA vlákno je komplementární
k antisense vláknu DNA
• RNA stejná jako sense vlákno
DNA, ale z ribonukleotidů a místo
T jsou U
• syntéza vždy ve směru 5’ - 3’
(3’OH ribozy s 5’fosfátem
sousedního nukletodu)
• pouze jedno vlákno se přepisuje
(transkribuje) do RNA
Pouze malý počet genů je v daný moment transkribováno, většina podléhá přísně časové
a tkánově specifické regulaci podle aktuálních potřeb buňky.
Houskeeping geny (konstitutivní) – geny nutné pro základní buněčné procesy, exprimovány
téměř pořád
Pouze jedno vlákno je transkribováno pro daný gen, ale někdy může být druhé vlákno
užito jako templát pro jiný gen ležící v opačné orientaci a překrývající se s prvním!
cistron – část DNA nebo RNA kódující jeden protein či jednu nekódující RNA
operon – u prokaryot, několik genů v těsné blízkosti přepisující se do jedné
společné mRNA, která pak ale kóduje více proteinů a je tedy polycistronní.
Většinou geny s podobnou funkcí (pro stejnou metabolickou dráhu).
EUKARYOTA
PROKARYOTA
OPERON
transkripce
translace
MONOCISTRONNÍ RNA
POLYCISTRONNÍ RNA
RNA
úpravy
Na eukaryotní RNA probíhá
po transkripci mnoho úprav,
než je ji možno přepsat do
proteinu!
export z jádra
Figure 6-21 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Struktura genu
ORF
Ne celá mRNA
kóduje protein!
promotor – část DNA před genem, na kterou se váže RNA polymeráza a další proteiny
umožňující začátek transkripce
5’UTR (5’untranslated region) – oblast mRNA na jejím 5’konci, která není translatována
3’UTR (3’untranslated region) – oblast mRNA na jejím 3’konci, která není translatována,
za stop kodonem
ORF (open reading frame) – otevřený čtecí rámec, souvislý sled bazí DNA(RNA) kódujcí protein
TRANSKRIPCE U PROKARYOT
Proces samotné syntézy RNA je vpodstatě totožný u prokaryot a eukaryot, ale
liší se regulační mechanismy.
Jak RNA polymeráza rozpozná správné místo na DNA,
kde začít transkripci?
jednovláknová mRNA
komplex RNA polymerázy
dvojvláknová DNA
RNA polymeráza
Samotné ‘core’ RNA
polymerázového komplexu je
schopné syntézy RNA, ale není
schopné rozpoznat a vázat DNA
-35
-10
+1
Molekulární interakce se ‘sigma () faktorem’ umožní RNA
polymeráze vázat DNA na specifických úsecích DNA
nazývaných promotory
Figure 6-11 (part 1 of 7) Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Rozpoznání promotoru
-35
-10
holoenzym RNA polymerázy
= core ze 4 podjednotek + sigma
podjednotka (= 5 celkem)
-10 a -35 sekvence
(vzhledem k počátku transkripce)
sekvence rozeznávané sigma
podjednotkou, umožňují vazbu
core, rozpletení DNA a počátek
transkripce. Sigma faktor se na
DNA nemůže vázat sám, ale vždy
v komplexu se zbytkem
polymerázy.
-10 a -35 sekvence
E.coli
‘konsensus‘ sekvence
-35
-10
úsek bohatý na TA, snadněji
se rozvolní (taje)
Síla promotoru je dána podobností -10 a -35 sekvence ke konsensu (čím podobnější,
tím častější nasedání polymerázy a tím silnější promotor)
Promotorové sekvence se liší mezi jednotlivými geny i mezi jednotlivými druhy prokaryot.
Průběh transkripce
trankripční
bublina
žlábek uvnitř polymerázy
pojme 16bp DNA (u eukaryot 25)
antisense vlákno
rostoucí
řetězec mRNA
RNA
polymeráza
sense vlákno
směr syntézy
• Po navázání sigma faktoru se vytvoří transkripční bublina na -10 oblasti (TA rich),
díky tomu otevření DNA a umožnění syntézy prvních 8-9 párů bazí mRNA.
Bublina pokračuje spolu s polymerázou po celé délce genu.
• První transkribovaná báze je většinou A obklopená dvěma pyrimidiny (CAT
sekvence), někdy G. Není potřeba primer jako u DNA replikace.
• iniciační fáze: RNA polymeráza se naváže a zůstává sedět na promotoru až do
syntézy prvních 8-9 bazí RNA
• elongační fáze: sigma faktor odpadne, core polymerázy se uvolní z promotoru a
syntetizuje zbytek mRNA rychlostí 40 nukleotidů za sekundu
(replikace 1000 bp/s, translace 15 AA/s)
• kontrola správnosti inkorporovaných bazí je malá.
• okamžité pokrytí mRNA ribozomy, mRNA před translací nepodléhá dalším úpravám
• gyráza přidává negativní superotáčky před polymerázou, topoizomeráza I odebírá
negativní superotáčky za polymerázou
• terminační fáze: ukončení transkripce odpojením RNA od polymerázy na specifických
místech
Jak RNA polymeráza rozpozná správné místo,
kde skončit transkripci?
jednovláknová mRNA
komplex RNA polymerázy
dvojvláknová DNA
TERMINACE TRANSKRIPCE
terminátor - invertovaná
repetice, za ní několik A,
tvorba vlásenky
•
mRNA na svém 3’konci vytvoří vlásenku, což způsobí zastavení polymerázy (asi 60 sekund)
•
slabé vazby mezi úsekem UUU v mRNA a AAA v DNA způsobí samovolné odpojení mRNA
•
odpadne i polymeráza
Terminace – Rho independentní (intrinsic termination)
– Rho dependentní
Rho faktor
• ATP dependentní helikáza, odděluje
řetězce DNA
• hexamer 6 stejných podjednotek
• cestuje od začátku spolu s polymerázou
• na mRNA se váže 50-90 nukleotidů před
terminátorem poté, co RNA polymeráza
nasyntetizuje jeho vazebné místo (G-rich,
C-poor)
Transkripční cyklus u prokaryot - video
http://booksite.academicpress.com/Clark/molecular2/anim11_initiation_transcription_bacteria.php
http://highered.mcgraw-hill.com/sites/0072556781/student_view0/chapter12/animation_quiz_1.html
Jak buňka ví, které geny zapnout?
Kontitutivní geny – zajišťují základní buněčné funkce, nutné pořád. Mají -10 a -35
sekvence blízké konsensu, sigma faktor a polymeráza nasedají samovolně, i když s
různou frekvencí podle síly promotoru.
Geny nutné pouze za určitých podmínek (inducibilní)
1. Rozpoznávány specifickými sigma faktory
Například sigma32 se váže pouze na geny tepelného šoku (nejsou rozpoznávány
normálním sigma faktorem, jiná rozpoznávací sekvence ), umožňuje bakterii přežití
vysokých teplot. Za normálních podmínek je sigma32 inaktivován vazbou na jiný
protein, po odeznění tepelného šoku se opět inaktivuje.
2. Sekvence -10 a -35 je tak málo podobná konsensu, že sigma podjednotka úsek
sama nerozezná a je potřeba aktivační protein (různé pro různé skupiny genů)
Aktivační protein (aktivátor) – váže se na sekvenci v promotoru a usnadňuje nasednutí
sigma faktoru, obdoba transkripčních faktorů u eukaryot.
Proč se aktivační proteiny na
DNA nevážou pořád?
Aktivační proteiny a represory mění svou konformaci
po vazbě signálních molekul
vazebné místo pro
signální molekulu
signální molekula
(například některá z živin nutných
pro růst buňky)
forma neschopná
vazby DNA
DNA vazebné místo
forma schopná
vazby DNA
alosterická změna
DNA vazebné místo
Regulační proteiny často vážou invertované repetice na DNA
‘head-to-head’ orientace
Díky 3D struktuře DNA jsou vazebná místa na stejné straně helixu.
Maltóza působí jako induktor
MalT protein
• aktivuje expresi genů
zpracovávajících maltózu
• pokud není maltóza v buňce
přítomna, MalT se není schopen
vázat na DNA a transkripce genů se
nekoná
• maltóza působí jako induktor, váže se
na MalT a způsobí jeho konformační
změnu. Odkryje se DNA vazebná
doména, MalT se může vázat na DNA a
spustí transkripci genů zpracovávající
maltózu
• podobné mechanismy u ostatních
živin
Represory negativně regulují transkripci
Lac I protein
• blokuje expresi genů
zpracovávajících laktózu
operátor
promotor
induktor
promotor
• váže se na operátor,
sekvenci překrývající se s
promotorem, čímž brání
vazbě RNA polymerázy
• laktóza způsobí alosterickou
konformační změnu Lac I
vedoucí k odpojení od DNA,
induktor
transkripce může začít
Transkripce rRNA a tRNA
rrnB operon
• 90% veškeré RNA v bakteriální buňce představuje rRNA: 16S, 23S a 5S rRNA
jsou syntetizovány na stejném primárním transkriptu, v intronech navíc některé
tRNA (ostatní tRNA samostatně nebo spolu s jinými geny). Vyštěpení RNAsami.
• jediný ‘sestřih’ probíhá u rRNA a tRNA, ne u mRNA
Kaczanowska M , and Rydén-Aulin M Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2007;71:477-494
TRANSKRIPCE U EUKARYOT
Eukaryota mají 10x více genů než prokaryota, navíc je DNA uzavřená v jádře
mnohem složitější regulace exprese
• transkripce probíhá v jádře, ne v cytoplazmě
• 3 RNA polymerázy, k tomu zvláštní RNA polymeráza v mitochondriích a chloroplastech
RNA polymeráza I
RNA polymeráza III
ribozomální RNA (5.8S, 18S, 28S),
½ až ¾ celkové RNA v buňce!
geny pro tRNA, 5S ribozomální RNA, některé snRNA
mRNA
3%
tRNA
hnRNA
rRNA
většinou konstitutivní exprese, ribozomy a tRNA nutná stále
RNA polymeráza II
geny kódující proteiny, snoRNA, miRNA, siRNA, snRNA
• potřebuje obecné (TFI, TFII, TFIII) a specifické transkripční faktory
• iniciační komplex se sestavuje až na promotoru (prokaryota maji sigma faktor
asociovaný už před vazbou na DNA)
Transkripce rRNA pomocí PolI probíhá v genových klastrech
netranskribované
oblasti
5.8
S
•
•
•
•
5.8
S
5.8
S
Klastry (shluky) mnoha tandemových repetic rRNA genů na pěti rozdílných chromozomech
RNA polymeráza I transkribuje 45S RNA, která je dále štěpena na 18S, 5.8 a 28S
5S je transkribována Pol III a musí být dopravena do jadérka
ribozomání proteiny trankribovány Pol II a také musejí být dopraveny do jadérka
Většina rRNA se transkribuje a upravuje v jadérku
fibrilární centrum
obsahující RNA PolI
a nově transkribované
rRNA
granulární oblast
obsahující
rRNA+ribozomální
proteiny
‘vánoční stromeček’
Regulační oblasti genů
přepisovaných
RNA polymerázou I
UBF1 – upstream binding factor I
Váže se na ‘core promotor’ a
‘upstream control element’,
obojí GC bohaté a téměř
totožné
SL1 komplex
obsahuje 4 proteiny včetně TBP
(TATA binding protein)
Rozvolní DNA, umožní navázání
RNA Pol I za pomoci TIF1A a
dalších transkripčních faktorů
Regulační oblasti genů
přepisovaných RNA
polymerázou III
• promoto uvnitř genu
• TFIIIC nebo TFIIIA se váže 50bp
downstream, rozvolní
chromatin
• umožní vazbu TFIIIB
komplexu obsahující TBP a
následně PolIII
SL1 a TFIIIB – podobná úloha jako sigma faktory u prokaryot, správné umístění polymerázy.
Regulační oblasti genů přepisovaných RNA polymerázou II
specifické
transkripční
faktory (tkáňově
nebo vývojově)
obecné (bazální) transkripční faktory
(TFIID,A,B,F,E,H,J)
některé specifické TF
ENHANCER
PROMOTOR
(nebo silencer)
Sekvence upstream nebo downstream od promotoru vážou specifické TF. Kombinace
vazebných míst pro různé TF je zodpovědná za obrovskou rozmanitost exprese
jednotlivých genů, rozdílnou expresi genů v závislosti na typu tkáně, signálům z vnějšku atd.
PROMOTOR
Iniciátor – sekvence DNA těsně před počátkem transkripce
– první transkribovaná báze A jako u prokaryot
TATA box - 25bp upstream, rozpoznáván TBP proteinem (TATA binding protein), TA
bohata oblast uprostřed GC bohate oblasti
Upstream elementy
• polymeráza může začít transkripci pouze za přítomnosti TATA boxu a iniciátoru, ale
to je málo účinný proces
• upstream elementy zvyšují účinnost transkripce po vazbě transkripčních faktorů
GC box – GGGCGG, váže SP1 transkripční faktor
CAAT box – GGCCAATCT, váže CTF/NF1
oktamer element – ATTTGCAT, váže Oct1
RNA polymeráza II
10-14 podjednotek
karboxy terminální doména
asi 50 repetic 7 aminokyselin
(Tyr Ser Pro Thr Ser Pro Ser)
fosforylace na Ser a Thr umožňuje
elongaci polymerázy
clamp doména
Otevřená umožňuje vazbu DNA, pak se
uzavře a obejme DNA, umožňuje její
procesivitu (elongaci bez odpadnutí Pol)
PRŮBĚH TRANSKRIPCE RNA POLYMERÁZOU II
Iniciace
TFIID obsahující TBP se váže na TATA box
Stejně jako u PolI a PolIII je vždy promotor rozeznáván
napřed DNA vázajícím proteinem, který teprve
umožní vazbu samotné polymerázy.
TFIIA, TFIIB
polymeráza + TFIIH
Polymeráza schopná syntézy, ale nemůže se
odpoutat do promotoru – ‘připravená polymeráza’
(poised polymerase). Mnoho genů je takto
zastaveno po velmi dlouhou dobu, připraveny k
rychlému použití.
Uvolnění polymerázy a elongace
TFIIF, TFIIE, TFIIJ
TFIIH (CDK7) fosforyluje
Ser5 v CTD doméně PolII
Polymeráza se odpoutá a pokračuje
elongací, všechny TFII odpadnou kromě
TFIIH
NELF (negative elongation factor)
DSIF (DRB-sensitivity inducing factor)
PTEF-B
Vážou se na PolII a zastaví transkripci
po krátkém úseku elongace –
‘pauzující polymeráza’ (paused
polymerase), pokud nejsou
fosforylovány spolu s CTD (Ser2), a to
pomocí některých specifických
transkripčních faktorů rekrutujících
P-TEFB (positive transcription
elongation factor B)
K efektivní elongaci je tedy nutné
fosforylovat CTD, NELF a DSIF.
Několikeré jištění, aby transkripce
běžela pouze tehdy, když je to
potřeba.
Fosforylovaná CTD na sebe váže další faktory modifikující chromatin a usnadňující elongaci
RNA polymeráza má 10-12 podjednotek, z toho 3 společné s PolI a PolIII. TFII faktory
často obsahují také několik podjednotek, celý iniciační komplex obsahuje mnoho
různých proteinů.
Specifické transkripční faktory váží upstream control elementy promotoru a zároveň TFIID
nebo TFIIB a TFIIA (nikdy ne přímo polymerázu). Tím napomáhají sestavení iniciačního
komplexu a zvyšují frekvenci iniciace a elongace transkripce.
ENHANCERY (a SILENCERY)
• sekvence upstream nebo downstream od promotoru (tedy i uvnitř genů), často velmi daleko
• fungují v jakékoliv orientaci (‘5-3’nebo 3’-5’)
• obsahují shluky vazebných míst pro různé specifické transkripční faktory (aktivátory
nebo represory)
• specifické transkripční faktory s sebou přinášejí proteiny pozitivně nebo negativně
modifikující strukturu chromatinu a průběh transkripce (koaktivátory a korepresory)
• zesilují nebo zeslabují transkripci díky kontaktu s transkripčním aparátem (často přes tzv.
mediátorový komplex)
• ohyb DNA a vytvoření smyčky (looping)
mediátor
proteiny
remodelující
chromatin
proteiny
modifikující
histony
Iniciace transkripce u eukaryot - video
http://booksite.academicpress.com/Clark/molecular2/anim11_initiation_transcription_eukaryotes.php
http://bcs.whfreeman.com/thelifewire/content/chp14/1402002.html
Terminace transkripce u Eukaryot
PolII
PolII přepíše vysoce konzervovanou
AAUAAA sekvenci na 3’ konci genu
Na AAUAAA sekvenci se váže
proteinový komplex obsahující
endonukleázu a také
polyadenylázu
RNA je štěpena 10-30 nukleotidů
za AAUAAA, RNA polymeráza
odpadne. Polyadenyláza
syntetizuje poly-A ocas.
Terminace transkripce u Eukaryot
prokaryota
PolII
PolI - několik A na 3’konci genu, za
nimi Sal box sekvence rozpoznávaná
terminačním faktorem. Uvolnění RNA
po jejím štěpení.
PolI
PolIII - podobný prokaryotické
PolIII
terminaci, v RNA je GC bohatá část
a za ní 4xU, někdy bez vlásenky. K
terminaci dochází tedy samovolně,
není potřeba dalších proteinů.
Transkripční továrny (transcription factories)
Current Opinion in Genetics & Development 2010, 20:127–133
Metody studia promotorů
a DNA-proteinových interakcí
(str. 591-597, kapitola 17)
Deleční analýza promotorů
Kde jsou v promotoru lokalizované regulační elementy?
Klonování promotorových úseků před reportérový gen a měření transkripce podle síly
exprese reportérového genu.
studovaný gen
reportérový gen
hybridní gen
neboli genová
fůze
gen pro luciferázu,
b-galaktosidázu atd.,
jehož produkt lze
snadno kvantifikovat
Deleční analýza promotorů
Vážou dané úseky DNA proteny?
DNAse footprint, gel shift assay,
ChIP…
Elektroforéza nukleových kyselin
Separace DNA nebo RNA molekul v agarózovém gelu na základě jejich rozdílné velikosti.
agarózový gel
Koncentrace agarózy
horizontální
elektroforéza
polyamidakrylový gel
vertikální
elektroforéza
In vitro testy:
DNAseI footprint
Váže daný úsek DNA protein(y)?
Inkubace značené DNA próby s nukleárním extraktem a její
štěpení DNAsouI. Úseky DNA pokryté proteinem nebudou
přístupné štěpení.
Vinckevicius A , and Chakravarti D J Mol Endocrinol 2012;49:R113-R123
koncetrace
proteinového
extraktu
In vitro testy:
Gel shift assay
a
(Gel retardation assay)
Váže se daný protein na určitý úsek DNA?
Stanovení migrace gelem. Volná DNA gelem migruje rychleji než DNA s navázaným proteinem.
Vinckevicius A , and Chakravarti D J Mol Endocrinol 2012;49:R113-R123
DNA afinitní chromatografie
Který protein se váže na danou DNA sekvenci?
DNA vazebné
proteiny z kroku 1
buněčný lyzát
Izolace všech DNA
vazebných proteinů
kolonka s
navázanou DNA
různých
sekvencích
odmytí
proteinů,
které nevážou
DNA
eluce proteinů
vázajících DNA
kolonka s DNA
pouze se sekvencí
odmytí proteinů,
které nevážou
eluce proteinů
vázajících DNA
Izolace proteinů
vážících specifickou
DNA sekvenci
Selekce oligonuklotidů
Jakou sekvenci váže daný protein?
In vivo testy:
Chromatinová precipitace
Váže se daný protein na DNA přímo
v jádře dané buňky?
Kroslinkování všech proteinů v
jádře k jejich DNA vazebným
místům, lýze buňky, fragmentace
DNA. Immunoprecipitace DNAproteinových komplexů za
pomoci specifické protilátky
rozeznávající daný protein.
Odmytí nenavázaných komplexů.
Dekroslinkování a analýza
izolované DNA.
In vivo testy:
ChIA-pet
(chromatin interaction analysis
paired end-tag sequencing)
Jaká je 3D struktura DNAproteinováho komplexu v jádře
dané buňky?
1. ChIP, izolace DNA-proteinových
komplexů.
2. Ligovaní dvou typů linkerů na
konce fragmentů a jejich spojení
ligací. Koncentrace DNAsy taková,
aby se preferenčně ligovaly úseky
v ramci jednotlivého komplexu.
Vyštěpení ligovaných konců a
jejich sekvenování. Lze vidět,
které části DNA se v dané chvíli
nacházely blízko daného
proteinu.
Conceptual questions