Transcript FSC

Imunologická diagnostika
•
•
•
•
•
•
•
Anti-infekční imunita - bakteriální, virová, mykotická onemocnění
Sledování imunitní odpovědi (imunitní stav organizmu, imunopatologie)
Hypersensitivní reakce (alergie)
Imunodeficity
Autoimunitní onemocnění
Onkologická hemagologická onemocnění
Protinádorová imunita
Základní přístupy:
• Co nejvyšší stupeň automatizace: analyzátory – protilátky, antigeny
• Moderní sofistikované metody: průtoková cytometrie
• Funkční testy lymfocytů: obtížně automatizovatelné
Laboratorní diagnostika
v imunologii - hlavní metody
• Stanovení sérových komponent a protilátek imunochemické metody
• Diagnostika autoprotilátek - fluorescenční metody
• Typizace imunokompetentních buněk - průtoková
cytometrie
• Funkční testy imunokompetentních buněk - průtoková
cytometrie
Zastoupení jednotlivých metod
Cytometrie
6%
Funkční testy
1%
Specifické IgE
16%
Nefelometrie
41%
Fluorescence
11%
ELISA
25%
Rutinní laboratoř Ústavu imunologie FN Motol
Celkově
2011
2012
2013
Počet RČ
19 998
21 218
20 975
Celkový počet vyš.
255 638
250 766
240 129
Počet pacientů
36 641
36794
34 143
Počet vyš. za 1 den
700
729
668
Počet vyš. u 1 pac.
6,97
6 ,81
7,03
Precipitační imunochemické metody
• Reakce založené na měření množství imunitních komplexů
vytvořených interakcí specifických protilátek s antigenem.
• Koncentrace příslušného antigenu je úměrná rychlosti
tvorby nebo hustotě zákalu.
Detekce s využitím rozptylu světla
• Rozptyl světla je soubor jevů, které způsobují, že
disperzní soustava se při průchodu světla jeví zakalená.
• Při průchodu světla soustavou s disperzními částicemi
se světelné paprsky mohou od částic odrážet
• Stanovení bílkovin séra na analyzátorech –
turbidimetrie, nefelometrie
Turbidimetrie a nefelometrie
• Smísí-li se rozpustný antigen ve vhodném
poměru s odpovídající protilátkou, vytvoří se
precipitát. Kvantitativně byla tato reakce
popsána již v r. 1929 Heidelbergem a Kendallem
• Po průchodu světelného paprsku suspensí
imunitních komplexů dochází k poklesu jeho
intenzity v důsledku rozptylu, absorpce a
odrazu.
• Pokles intenzity paprsku je úměrný množství
imunitních komplexů v roztoku.
Turbidimetrie a nefelometrie
Turbidimetrie a nefelometrie
Turbidimetrie
• Optická metoda spočívající na měření procházejícího světla
zeslabeného rozptylem na částicích (zákalu)
• Stupeň zákalu – turbidita
• Sleduje se pokles intenzity záření procházejícího absorbující a
rozptylující vrstvou.
• Největší citlivost turbidimetrických metod se dosahuje modrým
světlem (435-480 nm)
Nefelometrie
• Je měřeno světlo rozptýlené na precipitátu
• Úhel rozptylu je dán velikostí částic a vlnovou délkou
dopadajícího světla
• Měření kinetické, měření rychlosti změny rozptylu světla, která je
přímo úměrná rychlosti vzniku IK – Ag-Ab
• O řád citlivější než turbidimetrie (µg/ml)
Praktické aplikace
• IgA, IgG, IgM, IgD, podtřídy
• volné řetězce kappa, lambda
• reaktanty akutní fáze (CRP, haptoglobin,
orosomukoid, ceruloplasmin, alfa 1 antitrypsin, alfa
2 makroglobulin)
• koagulační faktory, složky komplementu
• Léky (např. antibiotika)
• Finanční nákladnost – cca 100.-Kč/vzorek
• Příklady analyzátorů – Beckman, Olympus
Neprecipitační imunochemické metody
používané v imunologické laboratorní diagnostice
Základní princip = rekce antigen-protilátka
označení Ag nebo Ab značkou
•
•
•
•
Enzym
Fluorochrom
Luminofor
Radioaktivní zářič
Citlivost kvantitativního stanovení
antigenu/protilátky:
precipitace - 30 mg/ml
aglutinace - 1 mg/ml
Neprecipitační imunochemické metody:
RIA, FIA, LIA, EIA - 1 pg/ml
Rozdělení metod podle použitého značení
•
•
•
•
Radioaktivní
Enzymatické
Fluorescenční
Luminiscenční
Enzymová Immunoassay (EIA)
• Označení antigenu nebo protilátky enzymem
• Nejpoužívanější:
křenová peroxidáza (HRP)
alkalická fosfatáza (AP)
• Chromogenní substráty - barevný produkt kolorimetrická detekce - spektrofotometrie
• HRP: tetramethylbenzidin (TMB) nebo
o- fenylendiamin
• AP: 4-nitrofenylfosfát
Heterogenní enzymová assay – ELISA
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)
• Dnes nejběžnější typ imunoanalýzy
v imunologických laboratořích
• Antigen nebo protilátka jsou imobilizovány na
pevný povrch – plastové mikrotitrační destičky
• Stanovení koncentrace antigenů nebo
protilátek
• přímá úměra mezi koncentrací analytu a
aktivitou enzymu
Sandvich ELISA
• Standardní ELISA na zjištění koncentrace antigenu
• navázání protilátky na pevnou fázi (polystyrén)
• přidání vzorku a inkubace – dochází ke vzniku vazby antigenprotilátka
• odmytí nenavázaného antigenu
• přidání druhé protilátky, vážící stejný antigen, na které je
kovalentně navázán enzym
• inkubace a odmytí nadbytečné protilátky s enzymem
• přidání substrátu a průběh enzymem katalyzované reakce –
barevný produkt
Capture ELISA
• Modifikace na detekci protilátek ve vzorku
• v 1. kroku navázán na pevnou fázi antigen
• druhá protilátka je namířena proti hledané
protilátce (např. anti-Human IgG)
Výsledky imunoanalýzy
• kvalitativní
• Jediný kalibrační bod („cutoff“
bod)
• Výsledky jsou buď ‘pozitivní’
nebo ‘negativní’; (tj. nad nebo
pod hodnotou cutoff)
• kvantitativní
• Vztah mezi naměřenou
hodnotou a koncentrací
zkoumané látky určen z
kalibrační křivky (obvykle 5 – 6
bodů)
Využití ELISA metod
• Imunologický výzkum
• humánní i veterinární diagnostika
Příklady :
• HIV-1 and HIV-2 (přítomnost anti-HIV protilátek)
• hepatitis C, B (přítomnost Ab i Ag)
• hormony (HCG, LH, TSH, T3 atd)
• stanovení protilátek po očkování (tetanus, dětské
nemoci)
• cytokiny (interleukiny, TNF, EPO,atd.)
• alergeny
• autoprotilátky (RF, ENA, ANA)
• toxiny
• drogy
LIA (CLIA) ChemiLumminiscence Immuno
Assay
• Chemiluminiscence se liší od ostatních luminiscenčních
jevů tím, že excitace fotonů je vyvolána chemickou
reakcí, která proběhne buď po přidání syntetizovaného
činidla, nebo se k aktivaci činidel využívá oxidace na
anodě (elektrochemiluminiscence)
• luminiscenční značka – chemiluminofor
luminol, izoluminol (aktivace přidáním H2O2)
luciferáza - luciferin
citlivost je vyšší než u RIA
(záblesky světla - detekce světla)
FLUORESCENČNÍ METODY
• Reakce Ag-Ab, detekce antigenů
• Protilátka je označená fluorochromem
• Možnost použití více protilátek s různými
fluorochromy
• Detekce fluorescenčním mikroskopem (tkáně)
• Detekce průtokovou cytometrií (suspenze
buněk)
Metody detekce autoprotilátek
Fluorescenční
mikroskopické metody
(nepřímá fluorescence)
ANA, AMA, SMA, ScMA, GPC,
LKM, ANCA, EMA, AECA,
dsDNA, GBM
ELISA - vyšetření např.
ENA- screen, ENA-typizace,
kardiolipin, RF, gliadin,
transglutamináza, ANCA
Průtoková cytometrie
• Princip průtokové cytometrie
• Použití více fluorescenčních barev teorie kompenzace
• Možnosti analýzy dat
• Některé aplikace průtokové
cytometrie
Průtokový cytometr = „Automatický mikroskop“
• Průtoková cytometrie je
technologie, která umožňuje
simultánní měření několika
charakteristik na úrovni jedné
buňky
Detekce
& Počítání
Buňky prochází před
objektivem mikroskopu a je
automaticky změřena jejich
fluorescence
Odpad
Vzorek
Nevýhoda oproti
mikroskopii: nevíme, kde je
v buňce signál lokalizován
Části průtokového cytometru
Fluidika: vzorek – buněčná suspenze.
Nasátí vzorku do přístroje. Průtok vzorku přístrojem. Vytvoření
proudu buněk pro měření. Sortování. Regulace rychlosti
měření.
Optika: Zdroj excitačního záření. Optické zařízení pro sběr
emitovaného záření a odraženého světla. Zdroje světla (lasery,
detektory, filtry)
Elektronika: Převod optického signálu na elektronický signál.
Digitalizace pro počítačovou analýzu.
Analýza dat: Zobrazení dat & analýza
identifikace populací
kvantifikace intenzity značení
kvantifikace zastoupení buněk v dané populaci
Schéma fluidiky
vzorek
Tlak
Vzorku
Tlak
unáš. tek.
Unášecí
tekutina
Odpad
Vakuum
(Variabilní)
(Stálý)
Natlakování
Hydrodynamická fokusace
- Buňky v tenkém paprsku protínají
laserový svazek a vzniká pulz.
- Proud buněk
(sample stream) je
unášen obalem
hnací kapaliny
(sheath fluid)
- Zajišťuje se tak
zúžení vzorkového
proudu do tenkého
paprsku, buňky se
řadí jednotlivě za
sebou.
Princip průtokové cytometrie
Jádro průtokového cytometru: Flow cell - kyveta
Nasátí buněk
Quartz
nozzle
Fluorescenční signály
Laserový paprsek
Velikost otvoru v nozzle = 50 to 400 µm
- na některých přístrojích lze měnit
Rozptyl světla buňkou:
Forward Scatter (FSC)
Čím větší buňka, tím větší rozptyl světla
FSC závisí na velikosti
buňky
Laserový paprsek
FSC
Detektor
Rozptyl světla buňkou: Side Scatter (SSC)
Laserový paprsek
FSC
Detektor
Intenzita SSC je proporcionální množství
cytosolických struktur v buňce (granula,
buněčné inkluze, atd.)
SSC závisí na granularitě buňky
Sběrné čočky
SSC
Detektor
Rozdělení krevních buněk dle FSC a SSC
Granulocyty
SSC
Lymfocyty
Monocyty
Erytrocyty
debris,
Mrtvé buňky
FSC
Detekce fluorescence, značení
protilátkami
Typizace buněk – CD znaky
• molekuly na povrchu krevních buněk
• fenotypizace leukocytů
• Číslovány podle mezinárodní CD
nomenklatury od r. 1982
• CD = cluster of differentiation
• Dnes známo 363 antigenů
Detekce Fluorescence
Laser Beam
FSC
Detector
Emitovaná fluorescence je pomocí
sestavy filtrů a čoček rozdělena
podle vlnové délky do kanálů.
Na koncových detektorech je v
každém z nich vyhodnocena
intenzita fluorescence.
Collection
Lens
Fluorescence
Detector A, B, C,
etc…
Základní konstrukce cytometru.
- Pro každou částici je zachycen a dále
zpracován pulz rozptylu i fluorescencí
ve všech sledovaných kanálech.
- Buňky v suspenzi s
navázanou
protilátkou(ami)
prochází svazkem(y)
laseru(ů) jedna po
druhé.
- Měří se rozptyl
světla v kolmém
(SSC) a
rovnoběžném (FSC)
směru.
- Dále
fluorescence v
kolmém směru.
Intenzita fluorescence
FITC
FITC
Number of Events
FITC
FITC
FITC
FITC
101
102
103
Relative fluorescence intensity
104
Vícebarevná průtoková cytometrie
FACS Aria
Vícebarevná průtoková cytometrie
Pacific blue
FITC
PE
APC
PC5
PC7
Excitační a emisní spektra
fluorochromů (modrý laser)
•Stejná excitace různá emis
•Překryv spekter
(overlap)
Mnohobarevná cytometrie
• Výhody
• Šetří čas a vzorky
• (1) 6barevná zkumavka = (15) 2barevných zkumavek
• Exponenciální nárůst informace
• Data z (1) 6barevné zkumvky » (15) 2barevných zkumavek
• Identifikace nových/málo zastoupených populací (<0.05%)
• interní kontroly ve vzorku
• Problémy
• Musí se pečlivě zvolit kombinace protilátek a fluorochromů
• Ne všechny reagencie jsou dostupné ve všech barvách
• Vyšší možnost vzniku chyb
• Je potřeba zvolit správné kontroly
Analýza a interpretace dat
• Data v LIST MODE FILE – pomocí speciálního softwaru
grafické zobrazení
• Různé typy grafů
• Statistiky
• Názvy běžných programů (CellQuest, DiVA, Flowjo,
WinMDI, FCS Express)
Histogram – zobrazení jednoho parametru
Četnost (count)
LIST MODE FILE
Event
#
Param 1
FSC
Param2
SSC
Param
3
FITC
Param
4
PE
Param
5
APC
1
100
500
10
650
4
2
110
505
700
700
6
3
90
480
720
670
10
4
95
490
15
720
15
0………10………100………1000…….10000
Intenzita signálu
Dot plot – zobrazení dvou parametrů
Periferní krev –
populace dle velikosti
a granularity
SSC
FSC
30%
60%
Periferní krev –
populace lymfocytů dle
CD4 a CD8
Gatování
Gate je definován jako oblast
Data mohou být zobrazena
pouze pro definovaný subset
buněk
Populace krevních
dendritických buněk
Vytvoření statistik pro
buňky,které nás zajímají:
• procento pozitivních
buněk
• Hodnota fluorescence
(relativní hodnota)
Hlavní aplikace na průtokovém
cytometru:
• Fenotypizace (zastoupení populací, testování
aktivace buněk)
• Analýza životnosti (zastoupení apopt. buněk)
• Analýza proliferace (CFSE)
• Imunologické funkce ( ox. reakce, cytotoxické
funkce)
• DNA a RNA analýza
• Sorting a buněčná izolace
Stanovení zastoupení základních
buněčných populací
Periferní krev
CD4+ Th lymfocyty
CD8+ Tc (cytotoxické) lymfocyty
CD16+CD56+ NK buňky
CD19+ B lymfocyty
Analýza životnosti, apoptózy
Apoptóza
– fosfatidylserin na vnější straně membrány
– vazba Annexinu V
Mrtvé buňky
- Průnik barvy do jádra
(PI nebo DAPI)
Oxidační reakce
Např. Testování funkce makrofágů
Oxidací vzniká fluorescenční produkt, který je detekován cytometricky.
•
•
•
•
Superoxide
Hydrogen Peroxide
Glutathione levels
Nitric Oxide
Hydroethidine
Dichlorofluorescein
Monobromobimane
Dichlorofluorescein
Testování fagocytózy
• Pohlcují dendritické buňky (DC) apoptotické nádorové buňky ?
• Červeně označené nád. buňky, DC označené protilátkou HLA-DR FITC
(zelená)
Control 0°C
71.2
73.3
2.12
10
104
103
102
0
5
24 hod
45.7
73.3
27.5
10
<B-530/30-A>: HLA-DR FITC
5
<B-530/30-A>: HLA-DR FITC
<B-530/30-A>: HLA-DR FITC
10
4 hod
104
103
102
0
2.73
0
24
10
2
3
10
10
<B-610/20-A>: DiI
4
10
5
5
29.7
74.5
44.6
3.24
22.4
104
103
102
0
2.01
0
24.8
10
2
3
10
10
<B-610/20-A>: DiI
4
10
5
0
10
2
3
10
10
<B-610/20-A>: DiI
4
10
5