Transcript Principles of Flow Cytometry

Průtoková cytometrie
• Princip průtokové cytometrie
• Použití více fluorescenčních barev teorie kompenzace
• Možnosti analýzy dat
• Některé aplikace průtokové cytometrie
Imunologické laboratorní metody
12.4.2010
Průtokový cytometr = „Automatický
mikroskop“
Průtoková cytometrie je technologie, která
umožňuje simultánní měření několika
charakteristik na úrovni jedné buňky
Detekce
& Počítání
Buňky prochází před
objektivem mikroskopu a je
automaticky změřena jejich
fluorescence.
Odpad
Vzorek
Nevýhody oproti
mikroskopii: nevíme, kde je
v buňce signál lokalizován
Složky průtokového cytometru
Fluidika: vzorek – buněčná suspenze.
Nasátí vzorku do přístroje. Průtok vzorku přístrojem. Vytvoření
proudu buněk pro měření. Sortování. Regulace rychlosti
měření.
Optika: Zdroj excitačního záření. Optické zařízení pro sběr
emitovaného záření a odraženého světla. Zdroje světla (lasery,
detektory, filtry)
Elektronika: Převod optického signálu na elektronický signál.
Digitalizace pro počítačovou analýzu.
Analýza dat: Zobrazení dat & analýza
identifikace populací
kvantifikace intenzity značení
kvantifikace zastoupení buněk v dané populaci
Schéma fluidiky
vzorek
Unášecí
tekutina
Odpad
Vakuum
Tlak
unáš. tek.
Tlak
Vzorku
(Variabilní)
(Stálý)
Natlakování
Princip průtokové cytometrie
Jádro průtokového cytometru: Flow cell - kyveta
Nasátí buněk
Quartz
nozzle
Fluorescenční signály
Laserový paprsek
Velikost otvoru v nozzle = 50 to 400 µm
- na některých přístrojích lze měnit
Hydrodynamická fokusace v kyvetě
Dobré rozlišení
Horší rozlišení
Vzorek
Vzorek
Unášecí tekutina
Unášecí tekutina
Nízký tlak
vzorku,úzký
proud vzorku
Vhodné pro
DNA analýzu
nízký
Vysoký tlak
vzorku, široký
proud vzorku.
Nevhodné pro
DNA analýzu
vysoký
Rozptyl světla buňkou:
Forward Scatter (FSC)
Čím větší buňka, tím větší rozptyl
světla
FSC závisí na velikosti buňky
Laserový paprsek
FSC
Detektor
Rozptyl světla buňkou:
Side Scatter (SSC)
Laserový paprsek
FSC
Detektor
Intenzita SSC je proporcionální
množství cytosolických struktur v
buňce (granula, buněčné inkluze,
atd.)
SSC závisí na granularitě buňky
Sběrné čočky
SSC
Detektor
Rozdělení krevních buněk dle FSC a SSC
Granulocyty
SSC
Lymfocyty
Monocyty
Erytrocyty
debris,
Mrtvé buňky
FSC
Detekce fluorescence, značení protilátkami
Intenzita fluorescence
FITC
FITC
FITC
Počet buněk
FITC
FITC
FITC
101
102
103
Relativní intenzita fluorescence
104
Fluorescenční kanály
• Fluorochromy (buňce vlastní nebo navázané, např. pomocí
protilátek) na buňkách absorbují část světla a excitují se
• Emise světla o nižší energii, tj. o delší vlnové délce než byla
excitační.
• Emitované fotony prochází přes sběrné čočky a jsou pomocí
soustavy filtrů a zrcadel rozděleny do kanálů dle svojí vlnové
délky
Stokesův posun
Lasery
Light amplification by stimulated emission of radiation
• Zdroj monochromatického světla (jediná vlnová délka)
• Zdroj koherentního vlnění = vlnění o stejné frekvenci,
stejného směru kmitání a stejné fáze (nebo se stejným
fázovým rozdílem).
• Stabilní zdroj záření
Lasery v průtokovém cytometru:
Dvoulaserové průtokové cytometry
argon laser - modrý (488 nm)
helium-neon diode laser - červený (633 nm).
Třílaserové průtokové cytometry
violet laser - fialový (407 nm) nebo UV laser (350 nm)
Detekce Fluorescence
Laser Beam
FSC
Detector
Emitovaná fluorescence je pomocí
sestavy filtrů a čoček rozdělena podle
vlnové délky do kanálů.
Na koncových detektorech je v
každém z nich vyhodnocena intenzita
fluorescence.
Collection
Lens
Fluorescence
Detector A, B, C, etc…
Intenzita fluorescence
FITC
FITC
Number of Events
FITC
FITC
FITC
FITC
101
102
103
Relative fluorescence intensity
104
Long Pass Filtry (LP)
Transmittance
• Propouští všechny vlnové délky vyšší než
specifikovaná vlnová délka
• Example: 500LP bude propouštět všechny
vlnové délky větší než 500nm
400nm
500nm
600nm
700nm
Short Pass Filtry (SP)
Transmittance
• Propouští všechny vlnové délky kratší než
specifikovaná vlnová délka
• Příklad: 600SP bude propouštět všechny
vlnové délky kratší než 500nm.
400nm
500nm
600nm
700nm
Pásmové filtry
• Propouší specifické rozmezí vlnových délek
• Příklad: 550/20BP Filter bude propouštět
vlnové délky mezi 540nm a 560nm (550/20 =
Transmittance
550+/-10, ne 550+/-20)
400nm
500nm
600nm
700nm
Dichroické filtry
• Mohou být long pass (LP) nebo short pass (SP)
• Filtr je umístěn v úhlu 45°
• Část světla je odražena v úhlu 90º k příchozímu
paprsku, část světla je propuštena.
Detector 1
Detector 2
Dichroic
Filter
Jednoduché schéma optiky přístroje
Počet kanálů:
2 lasery – obvykle 4 kanály
3 lasery – až 11 kanálů
PE
APC
PC5
FITC
Vícebarevná průtoková cytometrie
FACS Aria
Vícebarevná průtoková cytometrie
Pacific blue
FITC
PE
APC
PC5
PC7
Elektronika

Detektory PMT (photomultiplier tube): elektrony
dopadají na fotokatodu

Lze měnit napětí na PMT – lze nastavit citlivost
detektoru

Konverze optického signálu do elektronických signálů
(změny v napětí - pulsy)

Amplifikace signálu a digitalizace (Analog to Digital
Converters = ADC ).

Analýza výšky Height (H), šířky Width (W) a plochy
Area (A) pulsu

Softwarová analýza dat – LIST MODE FILE: pro
každou buňku hodnoty všech parametrů
Vznik pulsu napětí na PMT
t
1.
Laser
Voltage
t
2.
Laser
Voltage
t
3.
Laser
Voltage
Výška pulsu (H)
Napětí
Výška, šířka a plocha pulsu
Plochy pulsu (A)
0
40
Šířka pulsu (W)
čas (µs)
Práh (Threshold)
Hodnota treshold definuje minální intenzitu signálu v daném kanálu,
která je zaznamenáno. Nižší signály nejsou zobrazeny ani
zaznamenány.
Kompenzace
• Fluorochromy typicky emitují světlo v širokém
spektru vlnových délek (100nm nebo víc)
• V závislosti na uspořádání filtrů, detektory mohou
zachytit fluorescenci od jiných fluorochromů,
které jsou detekovány v jiných kanálech kanálů
(tzv. přesvit, překryv spekter)
• Přesvit je třeba „kompenzovat“, tak aby detektor
zaznamenal signál pouze 1 fluorochromu
Excitační a emisní spektra
fluorochromů (modrý laser)
•Stejná excitace různá emise
•Překryv spekter
(overlap)
Překryv spekter (spektral overlap)
FITC Fluorescein Isothiocyanate
PE
Phycoerytrin
Kompenzace
Jednobarevné značení
CD8 FITC
FL2-%FL1=0%
Jde pouze o výpočet, úpravu dat, tak aby byla
analyzovatelná
Závisí na:
• nastavení přístroje (PMT napětí na
detektorech)
• vlastnostech dané šarže fluorochromu
FL2-%FL1=12%
Kompenzace pomocí softwaru
•
•
•
•
Je potřeba připravit jednobarevně značené
kontrolní vzorky
Software vypočítá hodnoty kompenzací
Snadné, přesné a rychlé
Umožňuje to mnohobarevnou analýzu
Kompenzační matrix
Možné na cytometrech nové generace
FL1
FL1
Comp
FL2
Comp
27.35
FL3
Comp
0
FL2
FL3
3.96
0
5.15
11.18
Mnohobarevná cytometrie
• Výhody
• Šetří čas a vzorky
• (1) 6barevná zkumavka = (15) 2barevných zkumavek
• Exponenciální nárůst informace
• Data z (1) 6barevné zkumvky » (15) 2barevných zkumavek
• Identifikace nových/málo zastoupených populací (<0.05%)
• interní kontroly ve vzorku
• Problémy
• Musí se pečlivě zvolit kombinace protilátek a fluorochromů
• Ne všechny reagencie jsou dostupné ve všech barvách
• Vyšší možnost vzniku chyb
• Je potřeba zvolit správné kontroly
Analýza a interpretace dat
• Data v LIST MODE FILE – pomocí speciálního
softwaru grafické zobrazení
• Různé typy grafů
• Statistiky
• Názvy běžných programů (CellQuest, DiVA, Flowjo,
WinMDI, FCS Express)
Histogramy – zobrazení 1 parametru
Četnost (count)
LIST MODE FILE
Event
#
Param 1
FSC
Param2
SSC
Param
3
FITC
Param
4
PE
Param
5
APC
1
100
500
10
650
4
2
110
505
700
700
6
3
90
480
720
670
10
4
95
490
15
720
15
0………10………100………1000…….10000
Intenzita signálu
Dot ploty – zobrazení 2 parametrů
Periferní krev –
populace dle
velikosti a
granularity
SSC
FSC
30%
60%
Periferní krev –
populace
lymfocytů dle CD4
a CD8
Gatování
Gate je definován jako oblast
Data mohou být zobrazena
pouze pro definovaný subset
buněk
Populace krevních
dendritických buněk
Vytvoření statistik pro
buňky,které nás zajímají:
• procento pozitivních
buněk
• Hodnota fluorescence
(relativní hodnota)
Hlavní aplikace na průtokovém
cytometru:
• DNA a RNA analýza
• Analýza životnosti (zastoupení apopt. buněk)
• Fenotypizace (zastoupení populací, testování
aktivace buněk)
• Funkce buněk (Ca2+influx)
• Imunologické funkce ( ox. reakce, cytotoxické
funkce)
• Sorting a buněčná izolace
Stanovení zastoupení základních
buněčných populací
Periferní krev
CD4+ Th lymfocyty
CD8+ Tc (cytotoxické) lymfocyty
CD16+CD56+ NK buňky
CD19+ B lymfocyty
Analýza životnosti, apoptózy
Apoptóza
– fosfatidylserin na vnější straně membrány
– vazba Annexinu V
Mrtvé buňky
- Průnik barvy do jádra
(PI nebo DAPI)
Events
Analýza
buněčného
cyklu
G1
S phase
G1
1
DNA obsah na průtokovém cytometru
M
G0/1
G2
2
1
S
G2/M
DNA obsah
Rozložení do fází buněčného cyklu
Značení konců DNA dUTP
Apoptóza –
fragmentace DNA
Na volné konce DNA se
enzymaticky naváže
[Fluoresceindeoxyuridine
triphosphate (dUTP)]
Apoptotické buňky (DNA
je fragmentována
Green Fluorescence
Živé buňky (DNA
není fragmentována
Detekce v kanálu FITC
Green Fluorescence
Oxidační reakce
Např. Testování funkce makrofágů
Oxidací vzniká fluorescenční produkt, který je detekován cytometricky.
•
•
•
•
Superoxide
Hydrogen Peroxide
Glutathione levels
Nitric Oxide
Hydroethidine
Dichlorofluorescein
Monobromobimane
Dichlorofluorescein
Influx calcia
Stimulace – nespecifická, specifická (receptory)
Fluorescence barvičky pouze, pokud váže vápník (Indo-1, Rho-2)
Flow Cytometry
Image Cytometry
Ratio: intensity of 460nm / 405nm signals
1000
0.8
0.7
800
0.6
600
0.5
400
0.4
0.3
200
0.2
0
Stimulation
0
36
72
108
144
Time (Seconds)
0.1
180
0
0
Time
50 (seconds)
100
150
200
Testování fagocytózy
• Pohlcují dendritické buňky (DC) apoptotické nádorové buňky ?
• Červeně označené nád. buňky, DC označené protilátkou HLA-DR
FITC (zelená)
4 hod
Control 0°C
71.2
73.3
2.12
10
104
103
102
0
5
45.7
73.3
27.5
10
<B-530/30-A>: HLA-DR FITC
5
<B-530/30-A>: HLA-DR FITC
<B-530/30-A>: HLA-DR FITC
10
24 hod
104
103
102
0
2.73
0
24
10
2
3
10
10
<B-610/20-A>: DiI
4
10
5
5
29.7
74.5
44.6
3.24
22.4
104
103
102
0
2.01
0
24.8
10
2
3
10
10
<B-610/20-A>: DiI
4
10
5
0
10
2
3
10
10
<B-610/20-A>: DiI
4
10
5