Speciální světelná a elektronová mikroskopie

Dozvíte se něco o:

Speciální světelné mikroskopii   Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC)  Zástin a fázový kontrast Hoffmanův modulační kontrast   Fluorescenční mikroskopie Konfokální mikroskopie Elektronové mikroskopii   Řádkovací (skanovací) Prozařovací (transmisní)

Interference a ohyb (difrakce)

světla

Interference a ohyb (difrakce)

světla

Typy preparátů

 Amplitudové = zbarvené objekty absorbující světlo - rovnoměrně, jeví se jako tmavé - různě, jeví se jako barevné  Fázové = nebarevné objekty, lišící se indexem lomu a tloušťkou Jejich kontrast lze zvýšit - barvením preparátů - optickými metodami

Metody zvýšení kontrastu

 Zástin: clona zachycuje paprsky procházející přímo do objektivu, preparát je osvětlen z boku  Fázový kontrast: rozdíly v posunu fáze světla, které neumíme vnímat, převádí na rozdíly v jeho intenzitě

Fázový kontrast

Preparát č. 2: Entamoeba invadens (fázový kontrast)

Preparát č. 1: Tritrichomonas foetus (fázový kontrast)

Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC): zobrazuje optický reliéf, který je u biologických objektů zpravidla shodný s reálným prostorovým reliéfem

Metody zvýšení kontrastu

Hoffmanův modulační kontrast (HMC): podobný výsledek jako DIC, levnější, nevyžaduje polarizované světlo – proto jím lze pozorovat i objekty na dvojlomných podložkách (plastikové misky)

Preparát č. 4: Trypanoplasma borreli (DIC)

DIC (Nomarského kontrast)

Luminiscence

Chemiluminiscence luciferáza – luciferin Excitace zářením: fosforescence fluorescence

Fluorochromy

Přirozená luminisence chlorofyl

Fluorochromy

Přirozená luminisence chlorofyl Přímá vazba fluorochromu DAPI , ethidiumBr , propidium jodid

chlorofyl

Fluorochromy

Přirozená luminisence Přímá vazba fluorochromu DAPI , ethidiumBr , propidium jodid Nepřímá vazba fluorochromu pacific blue , alexa fluor 488 , FITC , TRITC , alexa fluor 635

Imunofluorescence

vazba primární protilátky s konjugovaným fluorochromem ( FITC apod.) vazba sekundární protilátky s konjugovaným fluorochromem ( FITC apod.) F vazba primární protilátky F F F F F

GFP

Fluorochromy

Vložení genu pro fluorochrom přímo do genomu GFP , RFP , YFP , CFP

Filtry: excitační a

bariérový

Filtry: excitační a

bariérový

Filtry:

excitační a

bariérový & dichroické zrcátko

Filtry:

excitační a

bariérový & dichroické zrcátko

Fluorescenční mikroskop

Co znamená „konfokální“?

Konfokální mikroskop Obraz je rekonstruován počítačem Zdrojem světla je laserový paprsek Je snímán jen obraz ze zaostřené roviny preparátu

Využití fluorescenční a konfokální mikroskopie

imunologie – lokalizace epitopů FITC , DAPI …

Imunolokalizace

Imunolokalizace

Imunolokalizace

FISH F luorescence I n S itu H ybridization

Využití fluorescenční a konfokální mikroskopie

Imunologie: lokalizace epitopů FITC , DAPI … Genomika: exprese a funkce genů GFP , RFP , YFP , CFP

Využití

GFP

Využití fluorescenční a konfokální mikroskopie

Imunologie: lokalizace epitopů FITC , DAPI … Genomika: exprese a funkce genů GFP , RFP , YFP , CFP Proteomika: sledování pohybů a interakcí proteinů PA-GFP, FRAP, FRET in situ

Barvení DAPI Trypanosoma cyprini Tritrichomonas foetus

Barvení DAPI •Po zaschnutí preparátu fixace chemikáliemi vychlazenými na -20 o C : methanol 5´ aceton 5´ Po oschnutí barvení - kápnout 1 kapku DAPI a přiklopit krycím sklem

Elektronová mikroskopie

     Proč elektrony?

Zvětšení elektronového mikroskopu Co lze pozorovat?

Jak připravit mikroskopický preparát?

Vady mikroskopu

Proč elektrony?

Rozlišovací schopnost vzdálenost dvou bodů, jež jsme schopni vnímat samostatně ok o asi 0,25mm U mikroskopu odpovídá polovině vlnové délky použitého záření = cca. 0,2 µm Světelný mikroskop: 1000 x víc než oko

Zvětšení elektronového mikroskopu Rozlišovací schopnost Rozlišovací schopnost oka: asi 0,25mm Vlnová délka příslušející urychlenému elektronu (60kV) je přibližně 0,005nm => rozlišovací schopnost 0,0025nm 0,25/2,5.10

-7 = 100 000 000 x víc než oko

Prakticky 350 000 – 500 000 x

víc než oko Špičkové přístroje až

800 000 – 1 000 000 x

Typy elektronových mikroskopů

   TEM SEM ( ESEM, LVSEM, AQUASEM) Další typy elektronových mikroskopů (STEM)

TEM T ransmisní e lektronový m ikroskop      Pracovni vakuum v mikroskopu - cca 10 -4 Pa Zdrojem záření je elektronové dělo (žhavené wolframové vlákno, LaB 6 , autoemisní tryska) Čočky jsou elektromagnetické Obraz nelze pozorovat přímo, projektován na:   fluorescenční stínítko fotografickou desku  prostřednictví SSC kamery na monitor Potenciální rozdíl napětí katoda x anoda je cca 60 – 200 kV u vysokovoltové el. mikroskopie 200 – 1000kV

Příprava preparátu

Fixace usmrcení tkáně, konzervace koagulací bílkovin Postfixace Odvodnění – postupné šetrné nahrazení vody ve vzorku organickým rozpouštědlem Zalití do umělé pryskyřice – řezání vzorku Řezání – strukturální podpora pro tenké řezy, maximálně do 100nm Kontrastování – struktury vzorku adsorpce atomů těžkých kovů na urč.  Mrazové preparáty - složitá identifikace obrázků   Mrazové lámání Mrazové leptání

SEM S kenovací e lektronový m ikroskop     Pracovní vakuum 10 -2 Pa Zdrojem záření je elektronové dělo (žhavené wolframové vlákno, LaB 6 , autoemisní tryska ) Čočky fokusují paprsek do co nejmenšího stopy Primární paprsek elektronů řádkuje plochu na preparátu a při interakci as hmotou preparátu se uvolňují z preparátu sekundární elektrony   Zvětšení = řádkovaná plocha/velikost obrazovky (běžně 10 000 - 20 000 x )  Obraz je tvořen bod po bodu a projektován na obrazovku Potenciální rozdíl napětí katoda x anoda je do 50kV

Preparáty

   Až několik cm velké Dokonale vysušené objekty, při maximálním zachování povrchových struktur Povrch je pokoven tenkou souvislou vrstvou

Informace převážně z

Vesmíru Kontrast a fáze:  Jaromír Plášek, Josef Reischig: Kontrast v optické mikroskopii. 1995/11, str. 638  Jaromír Plášek: Prostorové zobrazení preparátů. 2000/3, str. 137 Fluorescenční a konfokální mikroskopie: • Jaromír Plášek: Konfokální mikroskop. 1995/9, str. 508 • Jiří Beneš, Milan Hadravský, Alan Boyde, Mojmír Petráň: Optické mikroskopy s velmi vysokým rozlišením. 1997/11, str. 616-622   Jaromír Plášek: Prostorové zobrazení preparátů. 2000/3, str. 137 Jaromír Plášek: Proměny světelné mikroskopie ve 20. století. 2004/3, str. 146-153     Lucie Kubínová: Konfokální a dvoufotonová mikroskopie. 2004/3, příloha Mikroskopie dnes Mikroskopie dnes str. M4 Mojmír Petráň: Mikroskop s dvojitým řádkováním. 2004/3, příloha str. M6 Jan Bendnár, David Staněk, Jan Malínský, Karel Koberna, Ivan Raška: Dnešní mikroskopie v biomedicíně. 1983/10, str. 581-585 Jaromír Plášek: Víc než pouhý mikroskop. 2004/10, str. 586 Lucie Kubínová: Pohledy do trojrozměrného mikrosvěta: konfokální a dvoufotonová mikroskopie, Živa 6, 2006, str. 245

Informace z

Vesmíru Elektronová mikroskopie:    Luděk Frank: Kam směřuje elektronová mikroskopie? 2004/3, příloha Mikroskopie dnes str. M2 Armin Delong: Padesát let elektronové mikroskopie a elektronového mikroskopu v Brně. 2004/3, příloha biologii. 2004/3, příloha Mikroskopie dnes Jana Nebesářová a Pavel Honzák: Současná elektronová mikroskopie v Mikroskopie dnes str. M9 str. M7 Speciální mikroskopie „bez čoček“, krok k nanotechnologiím: • Jan Valenta: Spektroskopie jednotlivých molekul v blízkém optickém poli. 1995/4, str. 236  Pavel Svoboda: Fuellerenový hrot… 1996/12, str. 708   Pavel Janda, Jan Weber: Mikroskopie rastrovací sondou. 1998/7, str. 381 Jan Valenta: Jediná molekula jako lampička osvětlující vzorek. 2000/11, str. 606