Transcript Praktika 3 web - Ústav histologie a embryologie

Základy histochemie,
imunohistochemie a
elektronmikroskopické techniky.
Ústav histologie a embryologie
MUDr. Blanka Zajícová
Obecná histologie a obecná embryologie, kód B02241
Histochemie
Histochemická metoda – prokazuje chemickou látku či enzymovou
aktivitu vázanou na určitou strukturu na histologickém řezu
• Prokazované látky nesmějí difundovat z místa, kde se nacházejí.
• Produkt musí být nerozpustný, barevný (světelný mikroskop) nebo
elektrondenzní (elektronový mikroskop).
• Metoda by měla být specifická pro chemickou látku či skupinu.
• Procedura nesmí denaturovat nebo blokovat reaktivní skupiny.
Histochemie:
Stavební: průkaz chemických látek v buňkách a tkáních (průkaz lipidů,
polysacharidů, glykosaminoglykanů, fosfolipidů, železa, vápníku ad.)
Katalytická (enzymová): prokazuje aktuální štěpení substrátu enzymem
Průkaz nukleových kyselin
DNA – Feulgenova reakce
Hydrolýza DNA kys. chlorovodíkovou, odštěpení purinových bází od
monosacharidu, odhalení aldehydových skupin na deoxyribóze, jejich reakce se
Schiffovým činidlem, vznik nerozpustné červenofialové substance.
Jaderný chromatin se barví červenofialově (pozitivní reakce na DNA), jadérko
zůstane nezbarveno (RNA).
Vyšetření sex-chromatinu
RNA
Barví se bazickými barvivy:
toluidinovou modří, metylenovou modří
Nutnost kontrolního řezu inkubovaného v ribonukleáze.
Struktura, která po inkubaci ztratí svoji bazofilii, obsahuje RNA.
Průkaz lipidů
Nelze zalévat do parafínu,
nesmí přijít do styku
s organickými rozpouštědly
(benzen, xylen)!
Fixace: Bakerova tekutina,
zmrazení, event. se zalévá do
želatiny nebo celodalu.
Krájí se v kryostatu.
Barvení barvivy rozpustnými v
tucích: Sudan III, IV, olejová
červeň – barví červeně,
sudanová čerň – barví
modročerně až černě
Jádra se dobarvují
hematoxylinem nebo jádrovou
červení (kontrastně k tuku).
Montujeme do media
rozpustného ve vodě (glycerin,
glycerinová želatina).
Základní orientační metoda.
Průkaz lipidů olejovou červení,
kůra nadledviny
Průkaz fosfolipidů
Luxolová modř, jádrová červeň, mozek
Fosfolipidy – barvíme
luxolovou modří, používáme
ke znázornění myelinové
pochvy nervových vláken
Šedá hmota
Bílá hmota
(myelinizovaná nervová vlákna)
Mikrofotografie: doc. Vernerová
Průkaz polysacharidů – PAS reakce
PAS = zkratka složená z počátečních písmen názvů použitých reagencií
(Periodic Acid a Schiffovo reagens)
Princip reakce spočívá v oxidaci glykolových skupin cukru kyselinou jodistou
na aldehydové skupiny, ty reagují se Schiffovým činidlem za vzniku
červenofialové nerozpustné sraženiny.
PAS pozitivní: glykogen,
retikulární vlákna, hlen,
bazální membrány,
mezibuněčná hmota
hyalinní chrupavky
Bazální
membrána
Retikulární
vlákna
M. Jirkovská, Histologická technika, 2006
Hlen
PAS reakce, hematoxylin, žlučník
Průkaz glykogenu
PAS reakce s diastázovým (amylázovým) testem odliší glykogen od jiných
polysacharidů (diastáza = enzym štěpící glykogen)
Provedení: První řez se vzorkem je ponechán v destilované vodě, druhý řez
(kontrola) je inkubován s enzymem diastázou (amylázou), po vyprání je na
obou řezech provedena PAS reakce.
Kontrolní řez PAS negativní, vzorek PAS pozitivní  je glykogen
Kontrolní řez PAS pozitivní, vzorek PAS pozitivní  jde o PAS pozitivní, ale
diastázorezistentní polysacharid
Řez bez diastázy
- vzorek
Řez s diastázou kontrola
PAS
+
+
jiný polysacharid,
diastázorezistentní
PAS
+
-
glykogen
PAS
-
-
polysacharid není
přítomen
PAS reakce (jádra dobarvena hematoxylinem) Průkaz glykogenu v hepatocytech
PAS+ glykokalyx enterocytů (šipka),
hlen pohárkových buněk (x)
x
x
(PAS reakce, hematoxylin)
trámčitý epitel - játra
Průkaz glykosaminoglykanů (GAG)
•
•
Barvení alciánovou modří
Metachromatická reakce (barvení toluidinovou modří)
Výskyt: hlen (epitel žlučníku, pohárkové buňky epitelu střeva, mucinózní buňky),
mezibuněčná hmota pojiv, granula heparinocytů
Alciánová modř, jádrová červeň
Průkaz kyselých mukopolysacharidů v hlenu epitelu žlučníku
Alciánová modř, jádrová červeň,
hyalinní chrupavka
Průkaz GAG
alciánová modř, jádrová červeň,
pohárkové buňky epitelu střeva
Katalytická histochemie
Enzymy – katalyzátory biochemických reakcí
Aktivita enzymů je závislá na řadě faktorů – teplota a pH.
Možnost použití aktivátorů, např. kationty hořčíku, manganu ad.
Zpracování tkáně co nejdříve po odběru, většina enzymů nesnese
fixaci.
Katalytická histochemie prokazuje aktivitu enzymu (štěpení substrátu
enzymem).
Princip - histochemická reakce:
enzym
substrát

reakční produkt
Další reakce vizualizuje reakční produkt: např. azokopulace,
tetrazoliová metoda, peroxidázová reakce, precipitace s kationty kovů
Nutnost kontrolních řezů – doložení specifity průkazu.
Azokopulační metoda
Průkaz aktivity alkalické fosfatázy
Ledvina
Ledvinová tělíska
Inkubační roztok:
substrát ( naftylfosfát), stabilizovaná
diazoniová sůl (Fast Red TR), pufr pH 9.
Princip metody:
Enzym štěpí substrát a uvolněný naftylový
zbytek se naváže na diazoniovou sůl za
vzniku nerozpustné barevné sraženiny
azobarviva.
Výsledek: přítomnost alkalické fosfatázy barevná hnědočervená sraženina (zbarvení
podle použité diazoniové soli).
Množství azobarviva je přímo úměrné aktivitě
enzymu a je lokalizováno v místě, kde byl
enzym.
Alkalická fosfatáza – žíhaný lem resorpčního epitelu
proximálních tubulů ledvin
Proximální tubuly
Průkaz kyselé fosfatázy (marker lyzosomů)
Gomoriho metoda:
1. fáze - inkubace řezů v tekutině s glycerofosfátem sodným a dusičnanem
olovnatým, fosfatáza vede k uvolnění fosfátových iontů. Ty reagují s dusičnanem
olovnatým za vzniku bezbarvého elektrondenzního precipitátu fosforečnanu
olovnatého.
2. fáze – roztok sirníku amonného – černá sraženina sirníku olovnatého
Průkaz dehydrogenáz
Inkubace nefixovaných řezů v roztoku substrátu – tetrazoliová sůl,
substrát je akceptor uvolněných vodíkových iontů, jejich navázáním
vzniká nerozpustná barevná sraženina formazanu.
Př.: lokalizace sukcinát dehydrogenázy v mitochondriích.
Průkaz peroxidázy
Řezy se inkubují v roztoku obsahujícím peroxid vodíku a DAB
(diaminoazobenzidin).
DAB je v přítomnosti peroxidázy oxidován na černý elektrondenzní precipitát.
Využití techniky DAB: klinika – diagnostika leukémií,
značení v imunohistochemii
Imunohistochemie
Imunocytochemické metody jsou vysoce specifické a používají se k průkazu
určitých bílkovin a některých dalších makromolekul.
Založené na imunitní reakci organismu proti cizorodým látkám (antigenům),
organismus reaguje tvorbou specifických protilátek, které se vážou na antigen:
komplex antigen x protilátka
Protilátky – imunoglobuliny, tvořené plazmatickými buňkami (IgA, IgD, IgE, IgG,
IgM)
Polyklonální (z imunizovaného organismu, produkt několika klonů B lymfocytů plazmocytů) – vysoká senzitivita, nízká specificita.
Monoklonální protilátky (produkt jednoho klonu B lymfocytů) – mimořádně
specifické
Metody značení protilátek
•
Enzymy – konvenční histochemie (např. peroxidáza – vizualizace DAB)
•
Korpuskulární, částice koloidního zlata, ferritin (elektronová mikroskopie)
•
Fluorochromy (fluorescenční mikroskop), akridinová oranž, rhodamin, FITC,
TRITC, DAPI
•
Biotin (avidin-biotin komplex) - ABC
Imunohistochemické metody
Přímá metoda je jednovrstevná, tj. aplikuje
se primární protilátka (proti hledanému
antigenu) s navázanou značkou – primární
protilátka značená přímo.
Protilátka
Nutná dostatečná koncentrace antigenu
ve tkáni.
Pro světelnou mikroskopii není dost citlivá,
vyhovuje elektronové mikroskopii.
Antigen
Nepřímá metoda – dvojstupňová (sendvičová technika)
Na antigen se naváže neznačená primární protilátka a na její Fc fragment se
naváže sekundární protilátka – značená.
Primární protilátka
Sekundární značená protilátka
Nepřímá trojstupňová metoda: zesílení signálu streptavidin-biotin, avidin-biotin
Ross, Pawlina, Histology, 2006
Imunofluorescenční technika
Imunoperoxidázová technika
Průkaz gap junctions v semenoplodném epitelu při
použití protilátek proti connexinu 43
Průkaz B buněk Langerhansových ostrůvků pomocí
protiátek proti inzulinu
Mikrofotografie: prof. Martínek
Mikrofotografie: doc. Vernerová
Imunofluorescenční
technika
marker endotelových buněk CD34 v choriových
klcích (placenta) - Alexa Fluor 532 (červená) a
DAPI (modrá jádra)
Imunoperoxidázová
technika
marker endotelových buněk CD34 v choriových
klcích (placenta) - peroxidázová reakce
Snímky: doc. Kučera
Elektronová mikroskopie
Odběr: čerstvá tkáň, vzorek cca 1 mm
Fixace: často tzv. dvojitá fixace
aldehydové roztoky (formaldehyd,
glutaraldehyd), kakodylátový pufr,
např. Karnovského roztok
1-2% osmium tetroxid (korekce pH i
osmolality) - kontrastování
Zalévání
umělé pryskyřice: epoxidové,
metakrylátové, polyesterové
želatinové kapsle
Krájení
polotenké řezy, orientace, barvení
toluidinovou modří
ultratenké řezy: ultramikrotom 40-60nm
zachycení na síťky (měděné, niklové,
zlaté) povlečené nosnou blanou
(formvar), zpevněné nanesením
uhlíkové vrstvy
Kontrastování, uranylacetát, citronan
olovnatý
Transmisní elektronový mikroskop
Mescher, Junqueira´s Basic Histology
Elektronová mikroskopie
TEM,
ultrastruktura
makrofágu
Mescher, Junqueira´s Basic Histology