Histologická technika

Princip barvení, druhy barviv. Základní a speciální barvicí metody. Identifikace barvicích metod na preparátech.

Ústav histologie a embryologie MUDr. Blanka Zajícová Obecná histologie a obecná embryologie, kód B02241 8.10.2012

Barvení

Neobarvené řezy – nerozlišíme jednotlivé struktury, mají stejný index lomu (prohlížení jen s použitím speciálních optických zařízení – mikroskop s fázovým kontrastem) Běžná světelná mikroskopie - založena na použití velké palety barvicích metod Barviva jsou látky, které absorbují světlo určitých vlnových délek. To, co pak vnímáme jako barevný vjem, jsou neabsorbované vlnové délky.

Různé součásti buněk a tkání váží různá barviva – po obarvení se proto dají od sebe dobře odlišit Barvení nefixovaných tkání:

Vitální:

např. tuš, trypanová modř, lithiumkarmín, aplikace do krve či vaziva – vychytávání se sleduje na řezech. Fagocytární aktivita buněk.

Supravitální:

nervové bb.

např. Janusova zeleň – mitochondrie, methylenová modř –

Histologická barviva

1.

2.

Zásaditá (bazická),

také jádrová, barví bazofilní struktury (jaderný chromatin, ribosomy), př.:

hematoxylin, methylenová modř, toluidinová modř, thionin Kyselá (acidická),

také plasmatická, barví acidofilní struktury (cytoplasma, kolagenní vlákna), př.:

eosin, světlá zeleň, anilinová modř, oranž G, ponceau, kyselý fuchsin

Bazofilie je vlastnost struktur barvit se bazickými barvivy.

Acidofilie (eosinofilie, oxyfilie) je vlastnost struktur barvit se kyselými barvivy.

Barviva podle původu:

Přírodní:

hematoxylin, karmín, orcein, šafrán

Syntetická Aby bylo dosaženo standardní kvality, jsou dnes i přírodní barviva většinou připravována uměle.

Barvení

Barvení podle způsobu aplikace: Progresivní Regresivní Sukcedánní

– tkáň se barví pod kontrolou zraku do určité intenzity zbarvení, pak se proces přeruší – tkáň se přebarví, přebytečné barvivo se z tkáně odstraní příslušným roztokem pod kontrolou zraku (diferenciace) – barvení řezu postupně v několika barvicích roztocích

Simultánní

– barvení řezu roztokem různých barviv současně

In toto

– barvení celého bloku tkáně

Barvení podle výsledků barvení: Ortochromatické

– složky tkáně vykazují stejnou barvu jako užité barvivo

Metachromatické

– jednotlivé komponenty tkáně se obarví jedním barvivem v různě barevných tónech (např. při průkazu hlenu v buňkách produkujících hlen barvíme toluidinovou modří – hlen je ale červenofialový),

metachromatická barviva

jsou např.: toluidinová modř, thionin, methylenová modř

Difúzní

– barvicí roztok znázorní všechny složky tkáně ve stejném barevném tónu a ve stejné intenzitě

Elektivní

– barvicí roztok obarví pouze jednu ze složek buněk či tkání nebo ji výrazně vyzvedá

Přehledné barvicí metody

Obarví jádra a cytoplasmu rozdílným barevným tónem a zároveň obarví i mezibuněčnou hmotu pojivové tkáně.

Používá se

jádrové a jedno nebo více kyselých barviv

(použití více kyselých barviv umožní barevné rozlišení vaziva a svaloviny).

1. Hematoxylin – eosin

Základní barvicí metoda barvení parafínových řezů

2. Massonovy trichromy

Podle zbarvení vaziva:

a) žlutý b) zelený c) modrý 3. Weigert van Gieson 4. AZAN

nebarví.

Nutná je

Příprava hematoxylinu

Hematoxylin je nažloutlý krystalický prášek – jeho roztok sám o sobě

oxidace v hematein

(samovolně na vzduchu zraje měsíce, urychluje se přidáním oxidačních činidel – jodičnan sodný).

Hematein

má slabou afinitu ke tkáním, musí se použít mořidlo (soli Al, Fe) Barví

barevný lak hemateinu

Podle mořidla se rozeznávají

různé druhy hematoxylinů: Kamencové hematoxyliny

(Harrisův, Mayerův): např. HE, žlutý trichrom, dobarvení jader u speciálních metod

Železité hematoxyliny

Weigertův: zelený a modrý trichrom, Weigert van Gieson, Heidenhainův hematoxylin

Barvení hematoxylinem a eosinem, HE

1. Odparafínování, deparafinace

Xylen ve 2 lázních po 5´, alkohol v sestupné řadě (100%, 96%), voda

2. Barvení Hematoxylin Eosin

3-10 ´, voda,

regresivní barvení,

diferencování v kyselém alkoholu (70% alkohol s HCl), voda 0,1-0,5% roztok 1-3 ´, voda, diferencování v 80% alkoholu

3. Odvodnění

Dvě lázně alkoholu 96%, fenolxylen 20-25%, 3 ´

4. Projasnění

2 lázně xylenu po 5 min.

5. Zamontování

Zamontování do montovacího média, sušení

Montovací média

• Požadavky: bezbarvé, vysoký index lomu, nesmí odbarvovat, musí mít konzervační účinek

rozpustná ve vodě:

glycerínová želatina glycerin, •

nerozpustná ve vodě

: kanadský balzám, epoxidová pryskyřice - Entelan Pomocí montovacího média obarvený řez zamontujeme pod krycí sklo.

Hematoxylin-eosin (HE)

jádra vazivo sval

Hematoxylin

barví bazofilní součásti buňky- jádro, ribosomy, GER

Eosin

barví acidofilní struktury buňky – hlavně proteiny (cytoplasma, mitochondrie, hladké ER)

Výsledek barvení: jádra

– modrá, modročerná, červená,

kolagenní vlákna

růžová

cytoplasma

růžová,

svalovina

svalovina vazivo

HE, močový měchýř

epitel vazivo cévy sval

Massonovy trichromy Žlutý Massonův trichrom (ŽT):

Barviva: Harrisův hematoxylin, eosin, šafrán Výsledek barvení:

jádra tmavě modrá, cytoplasma světle růžová, kolagenní vlákna žlutá, svalovina červená, erytrocyty červené

Modrý Massonův trichrom (MT):

Barviva: hematoxylin (Weigertův), kyselý fuchsin-ponceau, anilínová modř Výsledek barvení:

jádra tmavě hnědá, cytoplasma světle růžová, kolagenní vlákna modrá, svalovina červená

Zelený Massonův trichrom (ZT):

Barviva: hematoxylin (Weigertův), ponceau–kyselý fuchsin–světlá zeleň, oranž G Výsledek barvení:

jádra tmavě hnědá, cytoplasma okrová, kolagenní vlákna zelená, svalovina červená, erytrocyty oranžové

epitel

Massonův žlutý trichrom, jícen

kolag. vazivo svalovina žlázky Mikrofotografie: prof. Martínek Kolagenní vlákna se barví žlutě.

svalovina

Massonův modrý trichrom, fundus žaludku

epitel kolag. vazivo céva Kolagenní vlákna se barví modře.

epitel

Massonův zelený trichrom, larynx

svalovina kolag. vazivo žlázky Kolagenní vlákna se barví zeleně.

Weigert van Gieson

Hrot jazyka svalovina

Barviva: Weigertův železitý hematoxylin, pikrofuchsin Výsledek bavení:

jádra hnědočerně, fuchsin barví kolagenní vlákna červeně, kyselina pikrová cytoplasmu, svalovinu a erytrocyty žlutě Dřeň ledviny vazivo

Foto: doc. Z. Jirsová Mikrofotografie: K ühnel, Pocket Atlas, 2003

Barviva: azokarmín, anilínová modř, oranž G Výsledek barvení:

Jádra karmínově červená, cytoplasma světle fialová, kolagenní vlákna blankytně modrá, svalovina červená, erytrocyty oranžovočervené

AZAN, slinná žláza

vazivo jádra

AZAN

svalovina jádra kolag. vazivo

• • • • • •

Speciální barvicí metody - příklady

Cílené metody, které znázorní pouze určitý typ buněk nebo buněčný či tkáňový detail

Cytologické metody

: Heidenhainovo barvení Barvení elastických vláken (

elastinu

): orcein, aldehyd-fuchsin, resorcin-fuchsin Průkaz

retikulárních vláken

: impregnace stříbrem, PAS reakce

Histochemické metody Neurohistologické

metody: – Barevné: • průkaz Nisslovy substance (Nisslova metoda) • Průkaz myelinu: Weigertova metoda, luxolová modř – Impregnační: • Znázornění neurofibril • Znázornění gliových buněk

Heidenhainův železitý hematoxylin, HH

Mitochondrie, HH Kosterní sval, HH

Membr. elastica externa

Barvení na elastiku, artérie

Membrana elastica interna Elastická vlákna v medii

Trámce hepatocytů

Retikulární vlákna, impregnace, játra

Portobiliární prostor Retikulární vlákna