Transcript 1633_1633_Praktika 2 web - Ústav histologie a embryologie
Histologická technika
Princip barvení, druhy barviv. Základní a speciální barvicí metody. Identifikace barvicích metod na preparátech.
Ústav histologie a embryologie MUDr. Blanka Zajícová Obecná histologie a obecná embryologie, kód B02241 8.10.2012
Barvení
Neobarvené řezy – nerozlišíme jednotlivé struktury, mají stejný index lomu (prohlížení jen s použitím speciálních optických zařízení – mikroskop s fázovým kontrastem) Běžná světelná mikroskopie - založena na použití velké palety barvicích metod Barviva jsou látky, které absorbují světlo určitých vlnových délek. To, co pak vnímáme jako barevný vjem, jsou neabsorbované vlnové délky.
Různé součásti buněk a tkání váží různá barviva – po obarvení se proto dají od sebe dobře odlišit Barvení nefixovaných tkání:
Vitální:
např. tuš, trypanová modř, lithiumkarmín, aplikace do krve či vaziva – vychytávání se sleduje na řezech. Fagocytární aktivita buněk.
Supravitální:
nervové bb.
např. Janusova zeleň – mitochondrie, methylenová modř –
Histologická barviva
1.
2.
Zásaditá (bazická),
také jádrová, barví bazofilní struktury (jaderný chromatin, ribosomy), př.:
hematoxylin, methylenová modř, toluidinová modř, thionin Kyselá (acidická),
také plasmatická, barví acidofilní struktury (cytoplasma, kolagenní vlákna), př.:
eosin, světlá zeleň, anilinová modř, oranž G, ponceau, kyselý fuchsin
Bazofilie je vlastnost struktur barvit se bazickými barvivy.
Acidofilie (eosinofilie, oxyfilie) je vlastnost struktur barvit se kyselými barvivy.
Barviva podle původu:
Přírodní:
hematoxylin, karmín, orcein, šafrán
Syntetická Aby bylo dosaženo standardní kvality, jsou dnes i přírodní barviva většinou připravována uměle.
Barvení
Barvení podle způsobu aplikace: Progresivní Regresivní Sukcedánní
– tkáň se barví pod kontrolou zraku do určité intenzity zbarvení, pak se proces přeruší – tkáň se přebarví, přebytečné barvivo se z tkáně odstraní příslušným roztokem pod kontrolou zraku (diferenciace) – barvení řezu postupně v několika barvicích roztocích
Simultánní
– barvení řezu roztokem různých barviv současně
In toto
– barvení celého bloku tkáně
Barvení podle výsledků barvení: Ortochromatické
– složky tkáně vykazují stejnou barvu jako užité barvivo
Metachromatické
– jednotlivé komponenty tkáně se obarví jedním barvivem v různě barevných tónech (např. při průkazu hlenu v buňkách produkujících hlen barvíme toluidinovou modří – hlen je ale červenofialový),
metachromatická barviva
jsou např.: toluidinová modř, thionin, methylenová modř
Difúzní
– barvicí roztok znázorní všechny složky tkáně ve stejném barevném tónu a ve stejné intenzitě
Elektivní
– barvicí roztok obarví pouze jednu ze složek buněk či tkání nebo ji výrazně vyzvedá
Přehledné barvicí metody
Obarví jádra a cytoplasmu rozdílným barevným tónem a zároveň obarví i mezibuněčnou hmotu pojivové tkáně.
Používá se
jádrové a jedno nebo více kyselých barviv
(použití více kyselých barviv umožní barevné rozlišení vaziva a svaloviny).
1. Hematoxylin – eosin
Základní barvicí metoda barvení parafínových řezů
2. Massonovy trichromy
Podle zbarvení vaziva:
a) žlutý b) zelený c) modrý 3. Weigert van Gieson 4. AZAN
nebarví.
Nutná je
Příprava hematoxylinu
Hematoxylin je nažloutlý krystalický prášek – jeho roztok sám o sobě
oxidace v hematein
(samovolně na vzduchu zraje měsíce, urychluje se přidáním oxidačních činidel – jodičnan sodný).
Hematein
má slabou afinitu ke tkáním, musí se použít mořidlo (soli Al, Fe) Barví
barevný lak hemateinu
Podle mořidla se rozeznávají
různé druhy hematoxylinů: Kamencové hematoxyliny
(Harrisův, Mayerův): např. HE, žlutý trichrom, dobarvení jader u speciálních metod
Železité hematoxyliny
Weigertův: zelený a modrý trichrom, Weigert van Gieson, Heidenhainův hematoxylin
Barvení hematoxylinem a eosinem, HE
1. Odparafínování, deparafinace
Xylen ve 2 lázních po 5´, alkohol v sestupné řadě (100%, 96%), voda
2. Barvení Hematoxylin Eosin
3-10 ´, voda,
regresivní barvení,
diferencování v kyselém alkoholu (70% alkohol s HCl), voda 0,1-0,5% roztok 1-3 ´, voda, diferencování v 80% alkoholu
3. Odvodnění
Dvě lázně alkoholu 96%, fenolxylen 20-25%, 3 ´
4. Projasnění
2 lázně xylenu po 5 min.
5. Zamontování
Zamontování do montovacího média, sušení
Montovací média
• Požadavky: bezbarvé, vysoký index lomu, nesmí odbarvovat, musí mít konzervační účinek
rozpustná ve vodě:
glycerínová želatina glycerin, •
nerozpustná ve vodě
: kanadský balzám, epoxidová pryskyřice - Entelan Pomocí montovacího média obarvený řez zamontujeme pod krycí sklo.
Hematoxylin-eosin (HE)
jádra vazivo sval
Hematoxylin
barví bazofilní součásti buňky- jádro, ribosomy, GER
Eosin
barví acidofilní struktury buňky – hlavně proteiny (cytoplasma, mitochondrie, hladké ER)
Výsledek barvení: jádra
– modrá, modročerná, červená,
kolagenní vlákna
růžová
cytoplasma
růžová,
svalovina
svalovina vazivo
HE, močový měchýř
epitel vazivo cévy sval
Massonovy trichromy Žlutý Massonův trichrom (ŽT):
Barviva: Harrisův hematoxylin, eosin, šafrán Výsledek barvení:
jádra tmavě modrá, cytoplasma světle růžová, kolagenní vlákna žlutá, svalovina červená, erytrocyty červené
Modrý Massonův trichrom (MT):
Barviva: hematoxylin (Weigertův), kyselý fuchsin-ponceau, anilínová modř Výsledek barvení:
jádra tmavě hnědá, cytoplasma světle růžová, kolagenní vlákna modrá, svalovina červená
Zelený Massonův trichrom (ZT):
Barviva: hematoxylin (Weigertův), ponceau–kyselý fuchsin–světlá zeleň, oranž G Výsledek barvení:
jádra tmavě hnědá, cytoplasma okrová, kolagenní vlákna zelená, svalovina červená, erytrocyty oranžové
epitel
Massonův žlutý trichrom, jícen
kolag. vazivo svalovina žlázky Mikrofotografie: prof. Martínek Kolagenní vlákna se barví žlutě.
svalovina
Massonův modrý trichrom, fundus žaludku
epitel kolag. vazivo céva Kolagenní vlákna se barví modře.
epitel
Massonův zelený trichrom, larynx
svalovina kolag. vazivo žlázky Kolagenní vlákna se barví zeleně.
Weigert van Gieson
Hrot jazyka svalovina
Barviva: Weigertův železitý hematoxylin, pikrofuchsin Výsledek bavení:
jádra hnědočerně, fuchsin barví kolagenní vlákna červeně, kyselina pikrová cytoplasmu, svalovinu a erytrocyty žlutě Dřeň ledviny vazivo
Foto: doc. Z. Jirsová Mikrofotografie: K ühnel, Pocket Atlas, 2003
Barviva: azokarmín, anilínová modř, oranž G Výsledek barvení:
Jádra karmínově červená, cytoplasma světle fialová, kolagenní vlákna blankytně modrá, svalovina červená, erytrocyty oranžovočervené
AZAN, slinná žláza
vazivo jádra
AZAN
svalovina jádra kolag. vazivo
• • • • • •
Speciální barvicí metody - příklady
Cílené metody, které znázorní pouze určitý typ buněk nebo buněčný či tkáňový detail
Cytologické metody
: Heidenhainovo barvení Barvení elastických vláken (
elastinu
): orcein, aldehyd-fuchsin, resorcin-fuchsin Průkaz
retikulárních vláken
: impregnace stříbrem, PAS reakce
Histochemické metody Neurohistologické
metody: – Barevné: • průkaz Nisslovy substance (Nisslova metoda) • Průkaz myelinu: Weigertova metoda, luxolová modř – Impregnační: • Znázornění neurofibril • Znázornění gliových buněk
Heidenhainův železitý hematoxylin, HH
Mitochondrie, HH Kosterní sval, HH
Membr. elastica externa
Barvení na elastiku, artérie
Membrana elastica interna Elastická vlákna v medii
Trámce hepatocytů
Retikulární vlákna, impregnace, játra
Portobiliární prostor Retikulární vlákna