Transcript Detekce klonality IgH B-buněk a TCR T

Molekulárně biologická analýza
klonální přestavby IgH B-buněk
a TCR T-buněk metodou PCR
Michaela Šváchová
Ústav patologie FN Olomouc
Klonalita

detekce klonality – diagnostika a klasifikace
lymfoproliferativních onemocnění

polyklonalita – normální stav organizmu (benigní), přítomnost
velkého počtu klonů s odlišnými přestavbami, schopné reagovat na
velké množství antigenů

monoklonalita – patologický proces (maligní), nádorové
proliferace odvozené od jedné transformované buňky, stejná
genetická výbava

B- a T-lymfomy – populace s monoklonální přestavbou IgH
B-buněk a TCR T-buněk
B- a T-lymfocyty
 Lymfocyty –
vznikají v kostní dřeni z pluripotentních
kmenových buněk (lymfoidní linie)
 Vývoj a diferenciace – B-lymfocyty – v embryonálních játrech
v kostní dřeni
T-lymfocyty – v thymu
Jeden lymfocyt – jediná protilátka
 B-lymfocyty – humorální imunitní reakce (produkují
imunoglobuliny)
 T-lymfocyty – buněčná imunita (vytvářejí antigen-specifické
receptory na povrchu buňky)
Detekce klonální přestavby IgH B-buněk
a TCR T-buněk u maligních lymfomů

IgH B-buněk a TCR T-buněk
genové
segmenty (subgeny)
přeskupení subgenů
(VDJ rekombinace)
funkční strukturní gen
funkční polypeptidové řetězce IgH a TCR

VDJ rekombinace – unikátní klonální marker

PCR – k detekci klonální přestavby
u lymfoproliferativních onemocnění
Struktura imunoglobulinu
Ig – 2 těžké (H) a 2 lehké (L) polypeptidové řetězce o stejné primární struktuře
Spojeny disulfidovými vazbami
Konstantní oblasti (C) – relativně neměnná sekvence AA
Variabilní oblasti (V) – jednotlivé imunoglobuliny příslušného typu těžkého nebo
lehkého řetězce se navzájem liší sekvencí AA
 Variabilní oblast – FR I-IV tzv. úseky struktury základní (framework)
CDR I-III hypervariabilní úseky, (complementarity determining region), oblasti
určující komplementaritu,
vazebná místa pro antigen




T buněčný receptor
 TCR – heterodimer, spojuje disulfidovou vazbou glykoproteinové
řetězce αβ nebo γδ
 Většina T lymfocytů exprimuje na svém povrchu αβ řetězce, buňky
exprimující γδ tvoří asi 5% T buněčné populace
 Jednotlivé buňky exprimují buď αβ nebo γδ heterodimery
 Řetězce tvořeny V a C doménami
(kódované přeskupenými subgeny)
B-lymfocyt
T-lymfocyt
IgH
TCRD
Igκ
exprese IgH/Igκ
TCRG
exprese TCRγδ
delece Igκ
delece TCRD
Igλ
TCRB
exprese IgH/Igλ
Izotypická exkluze
TCRA
exprese TCRαβ
Imunoglobulin a přeskupení subgenů
 Ig subgeny – lokalizovány na
chromozomech 2, 22, 14
 TCR subgeny – 14, 7
 V – subgeny kódují variabilní oblast
 C – subgeny kódují konstantní oblast
 J – subgeny kódují 12-21 koncových
AA variabilní oblasti
 D – subgeny – každý kóduje asi 5 AA
CDRIII úseku
 VJ somatická rekombinace –
– κ a λ Ig řetězce
– α a γ TCR
 VDJ somatická rekombinace –
– IgH
– β a δ TCR
VDJ rekombinace
 Rekombinace subgenů V, D a J
řízena RAG1 a RAG2
rekombinázovými enzymy
 RAG1 a RAG2 rozpoznávají
specifické DNA sekvence RSS
(rekombinační signální
sekvence), lokalizované po obou
stranách přeskupujících se
subgenů
 RSS obsahují heptamery
a nonamery, oddělené od sebe
12 nebo 23 páry bazí, kde
dochází ke štěpení DNA a k ligaci
vytvořených kódujících spojů
 Vytvoření funkčního Ig nebo TCR
genového produktu
Přeskupení TCR β
Zpracování bioptických vzorků,
izolace DNA











Biopsie, tkáň fixovaná formalínem a zalitá do parafínu
Odparafínování xylenem, promytí a odstranění xylenu etanolem
Izolace DNA pomocí Puregene DNA Purification Kit
Lýza buněk – lyzační pufr a proteináza K, inkubace přes noc při
56°C
Odstranění RNA inkubací lyzátu s RNázou při 37°C
Odstranění (vysrážení) proteinů přidáním precipitačního roztoku
Vysrážení DNA izopropanolem
Promytí DNA 70% etanolem, odpaření etanolu
Hydratace DNA hydratačním pufrem
Kontrola kvality a množství DNA měřením na spektrofotometru při
260 a 280 nm
Kontrolní PCR k ověření integrity a amplifikovatelnosti vyšetřované
DNA
Kontrolní PCR
DNA MARKER
DNA MARKER
-zjištění integrity a amplifikovatelnosti vyšetřované DNA
400 bp
400 bp
300 bp
300 bp
200 bp
200 bp
100 bp
100 bp
Polymerázová řetězová reakce PCR
 Metoda pro mnohonásobnou
amplifikaci specifického úseku
DNA in vitro založená na
principu replikace
 Reakční směs obsahuje:
- templátovou DNA
- primery (oligonukleotidy)
- dNTP (směs nukleotidů)
- PCR vodu
- PCR pufr
- roztok MgCl2
- enzym – termostabilní DNA
polymerázu, vyznačující se
5´→3´polymerázovou a
3´→5´exonukleázovou
aktivitou
PCR-Polymerázová řetězová reakce
 Amplifikace hypervariabilních oblastí VDJ
 Primery – specifické ke konzervovaným oblastem FR1 – FR3, JH
 Multiplex PCR – použití více párů primerů, nutná optimalizace
z důvodu možné kompetice mezi primery
 Nested PCR – odstupňovaná PCR, vyšší specifita, primární produkt
získaný pomocí 1. sady vnějších primerů je amplifikován pomocí
2. sady vnitřních primerů
 Seminested PCR – jeden z párů primerů je použit v 1. i 2. kole PCR
VH
FR1
FR1
FR1
CDR1
FR2
DH
CDR2
FR3
FR2
FR3
JH2
JH1
N
JH
N
CDR3
FR4
JH primers
monoklonální band
+ -
+
-
+ -
DNA MARKER
Stanovení klonality T-buněk
200 bp
100 bp
75 bp
Vγ11-Jγ11
TβD1-TβJ2 TβD2-TβJ2
monoklonální band
+ -
+
+ +
+
+ -
DNA MARKER
Stanovení klonality B-buněk
500 bp
300 bp
200 bp
100 bp
FR1
FR2
FR3
Interpretace a limitace výsledků PCR
 Polyklonalita – smear
 Monoklonalita – band
 Monoklonalita na polyklonálním pozadí – příměs reaktivních
buněk
 Bialelické přeskupení – obě alely – dva bandy
 Klonalita nemusí znamenat malignitu
 „Lineage infidelity“ – fenomén nevěry k příslušné buněčné
linii (prekurzorová B-ALL, AML)
 Pseudoklonalita (vysoká senzitivita PCR může způsobit
amplifikaci několika málo přeskupení, což může být chybně
interpretováno jako klonální přeskupení)
 Falešně negativní výsledky – chybné nasedání primerů např.
v důsledku mutací vyšetřované DNA
 Falešně pozitivní výsledky – využití heteroduplexní analýzy
Heteroduplexní analýza PCR produktu





denaturace 5 min při 94°C
rychlá náhodná renaturace 1 hod při 4°C
indukce homo nebo heteroduplexních formací
heteroduplexy – různá migrační rychlost – polyklonální lymfoproliferace
homoduplexy – identická migrační rychlost – monoklonální proliferace
před
po
Srovnání barvení EtBr × GelRed
EtBr
GelRed
Závěr
 Záchytnost metody –
60-100% odhalených skutečně klonálních
lymfoproliferací (závisí na vlastnostech
analyzované tkáně)
 Vysoký záchyt – B-chronická lymfatická leukémie, leukémie
z vlasatých buněk, lymfom z plášťových buněk
 Nižší záchyt – folikulární lymfom, difuzní velkobuněčný B-lymfom
(důsledek somatických hypermutací u germinálních
a postgerminálních lymfomů)
 Citlivost metody – odhalení klonality v případě výskytu alespoň 5%
buněk s klonální přestavbou ve vyšetřovaném
vzorku
 Kvalita vyšetřované tkáně – způsob zpracování (fixace
formalínem – degradace DNA, cross reakce mezi vlákny DNA, sekvenční
alterace atd. – selhání PCR)
vhodnější tkáň nativní, mražená, příp. fixovaná fixativy na bázi etanolu
DNA marker
uzlina
prostata
plíce
ledvina
myokard
játra
uzlina
sval
Fixace tkáně /nekropsie/
VAKUUM
400 bp
300 bp
200 bp
100 bp
FFPE
200 bp
100 bp