Slide 1

CHARAKTERIZACE DNA


Slide 2

CHARAKTERIZACE DNA
QANTUM = kolik?

QUALIS = jaký?

KVANTIFIKACE

KVALIFIKACE

SPECIES = druh

SPECIFIKACE

Proč tyto testy provádět?
• účinnost izolace
• optimalizace vstupního množství DNA do dalších analýz, zejména PCR
• Konfucius


Slide 3

Je těžké hledat černou kočku v temné místnosti. Zvláště když tam není.


Slide 4

Kvantita - několikero vzorečků
MOLEKULÁRNÍ HMOTNOST
MW (dsDNA) = (počet bp) x 660 [Da]
MW (ssDNA) = (počet b) x 330 [Da]

PŘEPOČET µg ↔ pmol (dsDNA)
pmol (dsDNA) = µg (dsDNA) x 1,515 / N (bp)
µg (dsDNA) = pmol (dsDNA) x N (bp) x 6,6.10-4

PŘEPOČET µg ↔ pmol (ssDNA)
pmol (ssDNA) = µg (ssDNA) x 3,030 / N (b)
µg (ssDNA) = pmol (ssDNA) x N (b) x 3,3.10-4


Slide 5

Obsah DNA v buňce
Celková DNA

6 pg

Celková RNA

10-30 pg

Velikost genomu

2 x 3,3.109 bp

Plazma

Erytrocyty

Leukocyty

Trombocyty

Počet v ml krve

-

5. 109

4-7.106

3-4. 108

Obsah DNA v ml
krve

něco
málo…

-

30-60 µg

-

Objem

2 a více ml

koncentrace spermií

20 milionů v ml a více

Obsah DNA v ml spermatu

60 µg a více


Slide 6

Kvalita DNA - degradace
fragmentace

narušení struktury


Slide 7

Kvalita DNA - degradace


Slide 8

Kvalita DNA - inhibitory


Slide 9

specifita DNA


Slide 10

Kvantitativní detekce DNA = spektrofotometrie

Měříme, kolikrát poklesne intenzita monochromatického světla
procházejícího roztokem DNA

Lambert – Beerův zákon
transmitance

Tλ = Ip / IV
absorbance

Aλ = -log Tλ = ελ · c · l


Slide 11

Kvantitativní detekce DNA = spektrofotometrie

Absorpční maximum DNA
λ = 260 nm


Slide 12

Kvantitativní detekce DNA = spektrofotometrie

Pro forenzní použití je ale spektrofotometrie velmi nevhodná… Proč?
• malá senzitivita (nízké koncentrace nezachytí)

• nulová specifita (cokoli zvyšuje absorpci při 260 nm, je považováno za DNA)
• k měření jsou třeba velká množství izolátu


Slide 13

MALÉ FYZIKÁLNÍ REWIEW „-SCENCÍ“

LUMINISCENCE
CHEMOTERMOELEKTROKATODOSONOMECHANOFOTO-


Slide 14

FOTOLUMINISCENCE

fluorescence

fosforescence


Slide 15

DETEKCE DNA – interkalační fluorofory
Nukleotidy a nukleové kyseliny obecně nefluoreskují. Výjimkou je kvasinková
tRNAPE, která obsahuje vysoce fluorescentní bázi známou jako Yt-báze
(emmax  470 nm). DNA je tedy jen slabě fluorescentní nebo nefluorescentní.


Slide 16

DETEKCE DNA – interkalační fluorofory
ethidiumbromid

SYBR green


Slide 17

Kvantitativní detekce fluoroforů = fluorimetrie

PICO Green
OLIGO Green


Slide 18

detekce specificky lidské DNA

Metoda je z logiky věci vždy založena na sekvenční specifitě


Slide 19

Kvantifikace specificky lidské DNA - blotting
• izolát blotujeme na membránu
• hybridizujeme se specifickou sondou

• sondu nějak zobrazíme – čím silnější bude signál, tím víc sondy je
navázáno, tzn. tím víc cílových sekvencí sonda našla = tím víc DNA

QuantiBlot® Human DNA Quantitation Kit
α-satelitní DNA sekvence v lokusu D17Z1


Slide 20

Kvantifikace specificky lidské DNA luminometrie
AluQuant™ Human DNA Quantitation System
Alu-repetice (???)

• denaturujeme dsDNA na ssDNA
• hybridizujeme se specifickou sondou
• přidáme polymerázu s exonukleázovou aktivitou a pyrofosfát – sonda je
odbourána, vznikají volné dNTP

• fosfát je přenesen pomocí kinázy na přidané ADP, vzniká ATP
• ATP je použito na luminiscenční enzymatickou reakci


Slide 21

real-time PCR kvantifikace – hitovka!!!


Slide 22

real-time PCR kvantifikace – hitovka!!!


Slide 23

real-time PCR kvantifikace – hitovka!!!
Emisní filtr
Detektor

Excitační
Filtr

Zdroj světla


Slide 24

real-time PCR kvantifikace – možné principy
nespecifické interkalační fluorofory
SYBR green, EtBr

hydrolyzační sondy
TaqMan, majáky („beacons“), štíři („scorpions“)

hybridizační sondy
LightCycler


Slide 25

real-time PCR kvantifikace
nespecifické interkalační fluorofory
• provádíme PCR specificky lidského lokusu (např. Alu)
• současně měříme fluorescenci (v roztoku je SYBR Green či jiná dye)
• čím více je dsDNA, tím větší je fluorescence
• je nutno mít ověřenou specifitu amplifikace!!!


Slide 26

real-time PCR kvantifikace – Sybr green


Slide 27

real-time PCR kvantifikace
hydrolyzační sondy

TaqMan, majáky („beacons“), štíři („scorpions“)

hybridizační sondy

LightCycler

využívají tzv. FRET =
Fluorescent
(Förster) Resonance Energy Transfer

λexcitA

Dye A

λemisAλemisB
λexcitA

Dye B


Slide 28

real-time PCR kvantifikace - TaqMan


Slide 29

real-time PCR kvantifikace - maják


Slide 30

real-time PCR kvantifikace - štír


Slide 31

real-time PCR kvantifikace - LightCycler


Slide 32

real-time PCR kvantifikace

plató

exponenciální
fáze

CT


Slide 33

real-time PCR kvantifikace


Slide 34

real-time PCR kvantifikace


Slide 35

real-time PCR kvantifikace
mohu měřit i přítomnost inhibitorů – jak?
neprovádím monoplex PCR, ale duplex PCR

kvantifikovaný lokus

kontrolní lokus