Transcript real-time PCR kvantifikace – hitovka!!!
Slide 1
CHARAKTERIZACE DNA
Slide 2
CHARAKTERIZACE DNA
QANTUM = kolik?
QUALIS = jaký?
KVANTIFIKACE
KVALIFIKACE
SPECIES = druh
SPECIFIKACE
Proč tyto testy provádět?
• účinnost izolace
• optimalizace vstupního množství DNA do dalších analýz, zejména PCR
• Konfucius
Slide 3
Je těžké hledat černou kočku v temné místnosti. Zvláště když tam není.
Slide 4
Kvantita - několikero vzorečků
MOLEKULÁRNÍ HMOTNOST
MW (dsDNA) = (počet bp) x 660 [Da]
MW (ssDNA) = (počet b) x 330 [Da]
PŘEPOČET µg ↔ pmol (dsDNA)
pmol (dsDNA) = µg (dsDNA) x 1,515 / N (bp)
µg (dsDNA) = pmol (dsDNA) x N (bp) x 6,6.10-4
PŘEPOČET µg ↔ pmol (ssDNA)
pmol (ssDNA) = µg (ssDNA) x 3,030 / N (b)
µg (ssDNA) = pmol (ssDNA) x N (b) x 3,3.10-4
Slide 5
Obsah DNA v buňce
Celková DNA
6 pg
Celková RNA
10-30 pg
Velikost genomu
2 x 3,3.109 bp
Plazma
Erytrocyty
Leukocyty
Trombocyty
Počet v ml krve
-
5. 109
4-7.106
3-4. 108
Obsah DNA v ml
krve
něco
málo…
-
30-60 µg
-
Objem
2 a více ml
koncentrace spermií
20 milionů v ml a více
Obsah DNA v ml spermatu
60 µg a více
Slide 6
Kvalita DNA - degradace
fragmentace
narušení struktury
Slide 7
Kvalita DNA - degradace
Slide 8
Kvalita DNA - inhibitory
Slide 9
specifita DNA
Slide 10
Kvantitativní detekce DNA = spektrofotometrie
Měříme, kolikrát poklesne intenzita monochromatického světla
procházejícího roztokem DNA
Lambert – Beerův zákon
transmitance
Tλ = Ip / IV
absorbance
Aλ = -log Tλ = ελ · c · l
Slide 11
Kvantitativní detekce DNA = spektrofotometrie
Absorpční maximum DNA
λ = 260 nm
Slide 12
Kvantitativní detekce DNA = spektrofotometrie
Pro forenzní použití je ale spektrofotometrie velmi nevhodná… Proč?
• malá senzitivita (nízké koncentrace nezachytí)
• nulová specifita (cokoli zvyšuje absorpci při 260 nm, je považováno za DNA)
• k měření jsou třeba velká množství izolátu
Slide 13
MALÉ FYZIKÁLNÍ REWIEW „-SCENCÍ“
LUMINISCENCE
CHEMOTERMOELEKTROKATODOSONOMECHANOFOTO-
Slide 14
FOTOLUMINISCENCE
fluorescence
fosforescence
Slide 15
DETEKCE DNA – interkalační fluorofory
Nukleotidy a nukleové kyseliny obecně nefluoreskují. Výjimkou je kvasinková
tRNAPE, která obsahuje vysoce fluorescentní bázi známou jako Yt-báze
(emmax 470 nm). DNA je tedy jen slabě fluorescentní nebo nefluorescentní.
Slide 16
DETEKCE DNA – interkalační fluorofory
ethidiumbromid
SYBR green
Slide 17
Kvantitativní detekce fluoroforů = fluorimetrie
PICO Green
OLIGO Green
Slide 18
detekce specificky lidské DNA
Metoda je z logiky věci vždy založena na sekvenční specifitě
Slide 19
Kvantifikace specificky lidské DNA - blotting
• izolát blotujeme na membránu
• hybridizujeme se specifickou sondou
• sondu nějak zobrazíme – čím silnější bude signál, tím víc sondy je
navázáno, tzn. tím víc cílových sekvencí sonda našla = tím víc DNA
QuantiBlot® Human DNA Quantitation Kit
α-satelitní DNA sekvence v lokusu D17Z1
Slide 20
Kvantifikace specificky lidské DNA luminometrie
AluQuant™ Human DNA Quantitation System
Alu-repetice (???)
• denaturujeme dsDNA na ssDNA
• hybridizujeme se specifickou sondou
• přidáme polymerázu s exonukleázovou aktivitou a pyrofosfát – sonda je
odbourána, vznikají volné dNTP
• fosfát je přenesen pomocí kinázy na přidané ADP, vzniká ATP
• ATP je použito na luminiscenční enzymatickou reakci
Slide 21
real-time PCR kvantifikace – hitovka!!!
Slide 22
real-time PCR kvantifikace – hitovka!!!
Slide 23
real-time PCR kvantifikace – hitovka!!!
Emisní filtr
Detektor
Excitační
Filtr
Zdroj světla
Slide 24
real-time PCR kvantifikace – možné principy
nespecifické interkalační fluorofory
SYBR green, EtBr
hydrolyzační sondy
TaqMan, majáky („beacons“), štíři („scorpions“)
hybridizační sondy
LightCycler
Slide 25
real-time PCR kvantifikace
nespecifické interkalační fluorofory
• provádíme PCR specificky lidského lokusu (např. Alu)
• současně měříme fluorescenci (v roztoku je SYBR Green či jiná dye)
• čím více je dsDNA, tím větší je fluorescence
• je nutno mít ověřenou specifitu amplifikace!!!
Slide 26
real-time PCR kvantifikace – Sybr green
Slide 27
real-time PCR kvantifikace
hydrolyzační sondy
TaqMan, majáky („beacons“), štíři („scorpions“)
hybridizační sondy
LightCycler
využívají tzv. FRET =
Fluorescent
(Förster) Resonance Energy Transfer
λexcitA
Dye A
λemisAλemisB
λexcitA
Dye B
Slide 28
real-time PCR kvantifikace - TaqMan
Slide 29
real-time PCR kvantifikace - maják
Slide 30
real-time PCR kvantifikace - štír
Slide 31
real-time PCR kvantifikace - LightCycler
Slide 32
real-time PCR kvantifikace
plató
exponenciální
fáze
CT
Slide 33
real-time PCR kvantifikace
Slide 34
real-time PCR kvantifikace
Slide 35
real-time PCR kvantifikace
mohu měřit i přítomnost inhibitorů – jak?
neprovádím monoplex PCR, ale duplex PCR
kvantifikovaný lokus
kontrolní lokus
CHARAKTERIZACE DNA
Slide 2
CHARAKTERIZACE DNA
QANTUM = kolik?
QUALIS = jaký?
KVANTIFIKACE
KVALIFIKACE
SPECIES = druh
SPECIFIKACE
Proč tyto testy provádět?
• účinnost izolace
• optimalizace vstupního množství DNA do dalších analýz, zejména PCR
• Konfucius
Slide 3
Je těžké hledat černou kočku v temné místnosti. Zvláště když tam není.
Slide 4
Kvantita - několikero vzorečků
MOLEKULÁRNÍ HMOTNOST
MW (dsDNA) = (počet bp) x 660 [Da]
MW (ssDNA) = (počet b) x 330 [Da]
PŘEPOČET µg ↔ pmol (dsDNA)
pmol (dsDNA) = µg (dsDNA) x 1,515 / N (bp)
µg (dsDNA) = pmol (dsDNA) x N (bp) x 6,6.10-4
PŘEPOČET µg ↔ pmol (ssDNA)
pmol (ssDNA) = µg (ssDNA) x 3,030 / N (b)
µg (ssDNA) = pmol (ssDNA) x N (b) x 3,3.10-4
Slide 5
Obsah DNA v buňce
Celková DNA
6 pg
Celková RNA
10-30 pg
Velikost genomu
2 x 3,3.109 bp
Plazma
Erytrocyty
Leukocyty
Trombocyty
Počet v ml krve
-
5. 109
4-7.106
3-4. 108
Obsah DNA v ml
krve
něco
málo…
-
30-60 µg
-
Objem
2 a více ml
koncentrace spermií
20 milionů v ml a více
Obsah DNA v ml spermatu
60 µg a více
Slide 6
Kvalita DNA - degradace
fragmentace
narušení struktury
Slide 7
Kvalita DNA - degradace
Slide 8
Kvalita DNA - inhibitory
Slide 9
specifita DNA
Slide 10
Kvantitativní detekce DNA = spektrofotometrie
Měříme, kolikrát poklesne intenzita monochromatického světla
procházejícího roztokem DNA
Lambert – Beerův zákon
transmitance
Tλ = Ip / IV
absorbance
Aλ = -log Tλ = ελ · c · l
Slide 11
Kvantitativní detekce DNA = spektrofotometrie
Absorpční maximum DNA
λ = 260 nm
Slide 12
Kvantitativní detekce DNA = spektrofotometrie
Pro forenzní použití je ale spektrofotometrie velmi nevhodná… Proč?
• malá senzitivita (nízké koncentrace nezachytí)
• nulová specifita (cokoli zvyšuje absorpci při 260 nm, je považováno za DNA)
• k měření jsou třeba velká množství izolátu
Slide 13
MALÉ FYZIKÁLNÍ REWIEW „-SCENCÍ“
LUMINISCENCE
CHEMOTERMOELEKTROKATODOSONOMECHANOFOTO-
Slide 14
FOTOLUMINISCENCE
fluorescence
fosforescence
Slide 15
DETEKCE DNA – interkalační fluorofory
Nukleotidy a nukleové kyseliny obecně nefluoreskují. Výjimkou je kvasinková
tRNAPE, která obsahuje vysoce fluorescentní bázi známou jako Yt-báze
(emmax 470 nm). DNA je tedy jen slabě fluorescentní nebo nefluorescentní.
Slide 16
DETEKCE DNA – interkalační fluorofory
ethidiumbromid
SYBR green
Slide 17
Kvantitativní detekce fluoroforů = fluorimetrie
PICO Green
OLIGO Green
Slide 18
detekce specificky lidské DNA
Metoda je z logiky věci vždy založena na sekvenční specifitě
Slide 19
Kvantifikace specificky lidské DNA - blotting
• izolát blotujeme na membránu
• hybridizujeme se specifickou sondou
• sondu nějak zobrazíme – čím silnější bude signál, tím víc sondy je
navázáno, tzn. tím víc cílových sekvencí sonda našla = tím víc DNA
QuantiBlot® Human DNA Quantitation Kit
α-satelitní DNA sekvence v lokusu D17Z1
Slide 20
Kvantifikace specificky lidské DNA luminometrie
AluQuant™ Human DNA Quantitation System
Alu-repetice (???)
• denaturujeme dsDNA na ssDNA
• hybridizujeme se specifickou sondou
• přidáme polymerázu s exonukleázovou aktivitou a pyrofosfát – sonda je
odbourána, vznikají volné dNTP
• fosfát je přenesen pomocí kinázy na přidané ADP, vzniká ATP
• ATP je použito na luminiscenční enzymatickou reakci
Slide 21
real-time PCR kvantifikace – hitovka!!!
Slide 22
real-time PCR kvantifikace – hitovka!!!
Slide 23
real-time PCR kvantifikace – hitovka!!!
Emisní filtr
Detektor
Excitační
Filtr
Zdroj světla
Slide 24
real-time PCR kvantifikace – možné principy
nespecifické interkalační fluorofory
SYBR green, EtBr
hydrolyzační sondy
TaqMan, majáky („beacons“), štíři („scorpions“)
hybridizační sondy
LightCycler
Slide 25
real-time PCR kvantifikace
nespecifické interkalační fluorofory
• provádíme PCR specificky lidského lokusu (např. Alu)
• současně měříme fluorescenci (v roztoku je SYBR Green či jiná dye)
• čím více je dsDNA, tím větší je fluorescence
• je nutno mít ověřenou specifitu amplifikace!!!
Slide 26
real-time PCR kvantifikace – Sybr green
Slide 27
real-time PCR kvantifikace
hydrolyzační sondy
TaqMan, majáky („beacons“), štíři („scorpions“)
hybridizační sondy
LightCycler
využívají tzv. FRET =
Fluorescent
(Förster) Resonance Energy Transfer
λexcitA
Dye A
λemisAλemisB
λexcitA
Dye B
Slide 28
real-time PCR kvantifikace - TaqMan
Slide 29
real-time PCR kvantifikace - maják
Slide 30
real-time PCR kvantifikace - štír
Slide 31
real-time PCR kvantifikace - LightCycler
Slide 32
real-time PCR kvantifikace
plató
exponenciální
fáze
CT
Slide 33
real-time PCR kvantifikace
Slide 34
real-time PCR kvantifikace
Slide 35
real-time PCR kvantifikace
mohu měřit i přítomnost inhibitorů – jak?
neprovádím monoplex PCR, ale duplex PCR
kvantifikovaný lokus
kontrolní lokus