Polymerázová řetězová reakce

aneb

Děkujeme, pane Mullis!

Vytvořila: Mgr. Tereza Králová www.zivaveda.ivb.cz

CZ.1.07/2.3.00/35.0026 Věda všemi smysly

DNA nositelka dědičné informace

• deoxyribonukleová kyselina • objev struktury v roce

1953

(J. Watson, F. Crick, M. Wilkins) • buňka → jádro → chromozom → histon → vlákno DNA → gen • nukleotidy:

adenin (A) , guanin (G), thymin (T) , cytosin (C)

cs.wikipedia.org/wiki /Párování_bází

princip komplementarity

tokresource.org

Proces přenosu genetické informace replikace

DNA → DNA

transkripce

DNA → RNA

translace

RNA → protein nové vlákno původní vlákno DNA nové vlákno původní vlákno DNA

replikace DNA

http://www.mojechemie.cz/Biochemie:Nuk leov%C3%A9_kyseliny

Genetický kód

Klonování

vložení DNA do bakteriálního vektoru

Cizorodá DNA

zájmová oblast misky s agarem (= živnou půdou)

Escherichia coli

Spojení plasmidu a naší DNA Vložení DNA do bakterie

bílé tečky = narostlé kolonie bakteriálních klonů http://www.disputea

bout.eu/clanek/what -the-heck-is-an-e-coli

Klony

http://biologie-v-kostce.blogspot.cz/2011/05/66-metody prenosu-dna-do-eukaryontnich.html

Až jednoho dne…

Dr. Kary B. Mullis (* 28. 12. 1944)

americký biochemik Cetus Corporation, Kalifornie

1983

objev polymerázové řetězové reakce

$10,000 bonus (Cetus - $300 milionů od firmy Roche Molecular Systems)

1993 Nobelova cena za chemii

Polymerázová řeťezová reakce

=

PCR

, z angl.

P

olymerase

C

hain

R

eaction ústřední metoda v biochemii a molekulární biologii

„polymerázová“

– využití DNA polymerázy (replikace)

„řetězová reakce“

– více reakcí za sebou, produkt první reakce se stává „šablonou“ v další reakci Thomas D. Brock

DNA polymeráza

v přírodě existuje mnoho typů schopnost zkopírovat DNA (za optimálních podmínek a přítomnosti určitých látek)

Taq

polymeráza (izolována 1965) Národní park Yellowstone optimum 72 ° C

Thermus aquaticus

http://www.yellowstonepark.com/ scenic-drive-hot-springs-geysers/ http://en.wikipedia.org/wiki/Taq_polymerase

Složky PCR

DNA ( templát)

G

oligonukleotidy (tzv. primery) pufr

Taq

DNA polymeráza ddH 2 O volné dinukleotidy (dNTPs)

G

hořčík (Mg 2+ ) a další…

1. Denaturace

(Denaturing)

94

°

C

2. Nasedání primerů

(Annealing)

50-65

°

C

3. Elongace prodlužování vlákna

(Extension)

72

°

C

3. Elongace prodlužování vlákna

(Extension)

72

°

C

3. Elongace – prodlužování vlákna

(Extension)

72

°

C

Opakování cyklu

exponenciální amplifikace

zdvojnásobení počtu molekul po každém cyklu 32 cyklů = 4 294 967 296 kopií po x tém cyklu => 2 x molekul DNA http://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction

Automatizace

„Baby Blue“ (1986) starší prototyp termocykleru mikrozkumavky na PCR Biometra T1 (1999) http://en.wikipedia.org/wiki/Po lymerase_chain_reaction Eppendorf Mastercycler EP (2003) G-STORM GS4 (2006) Techne TC-PLUS (2010)

Využití v praxi

lékařství molekulární biologie genetika biochemie testy otcovství forenzní vědy kriminalistika paleobiologie a další… http://www.scq.ubc.ca/a-brief-tour-of dna-fingerprinting/ http://musicoronada.blogspot.cz/2 012/03/1b-y-1c-el-mamut.html

www.rkm.com.au

http://humanresrourcelegalreso urce.wordpress.com/2012/01/ http://www.environmentalgraffiti.com

Lékařství

detekce mutací - diagnóza leukémie (SPRED1 gen), lymfomů detekce nákazy – HIV, tuberkulóza

(Mycobacterium tuberculosis

), ...

preimplantační diagnóza (umělé oplodnění) prenatální diagnostika (amniocentéza – Rh faktor, Downův syndrom apod.)

“PCR made it easier to see that certain people are infected with HIV.”

Kary Mullis

Genetika a molekulární biologie Genetické inženýrství

základní výzkum (identifikace druhů, taxonomické vztahy…) testy paternity (polygamie, mimopárová paternita…) geneticky modifikované organismy (GMO) genová terapie – pomocí virů (léčba dědičných onemocnění, nahrazení nefunkčního genu funkčním)

Paleobiologie

„ancient DNA“ www.plosone.org

Kriminalistika

genetický otisk prstu (DNA fingerprint) genetická daktyloskopie spolehlivá identifikace jedince (člověk – použití 13 mikrosatelitů) pachatel podezřelý 1 podezřelý 2 podezřelý 3

Nevýhody využití metody

citlivost - nutnost optimalizace heterozygot ní sekvence náročné na koncentraci DNA (ani moc, ani málo) chyby DNA polymerázy (tzv. PCR artefakty) … atd.

Výhody však jednoznačně převažují, takže…

Díky, pane Mullis!

Užitečné odkazy:

Osobní stránky K. Mullise, obsahují popis objevu a principu PCR (vč. videa) http://www.karymullis.com/pcr.shtml

Popis událostí předcházejících objevu PCR http://en.wikipedia.org/wiki/History_of_polymerase_chain_reaction Video o průběhu PCR http://www.youtube.com/watch?v=2KoLnIwoZKU Modifikace PCR http://en.wikipedia.org/wiki/Variants_of_PCR PCR song, povedená píseň firmy BioRad http://www.youtube.com/watch?v=x5yPkxCLads PCR song, text http://biorad.cnpg.com/lsca/videos/ScientistsForBetterPCR/assets/BioR ad_PCRsong_Lyrics.pdf

Kvíz

1. Z čeho je odvozena zkratka PCR?

A) Progressive Chain Reaction B) Polymerase Chain Reaction C) Polymerase Cumulative Reaction

Kvíz

1. Z čeho je odvozena zkratka PCR?

A) Progressive Chain Reaction B) Polymerase Chain Reaction C) Polymerase Cumulative Reaction

Kvíz

2. Kdo v roce 1983 objevil metodu PCR?

A) James Watson a Francis Crick B) Maurice Wilkins C) Kary B. Mullis

Kvíz

2. Kdo v roce 1983 objevil metodu PCR?

A) James Watson a Francis Crick B) Maurice Wilkins C) Kary B. Mullis

Kvíz

3. Princip komplementarity je pravidlo, podle kterého se vzájemně párují nukleotidové báze dvou řetězců DNA. Jak?

A) adenin s guaninem, thymin s cytosinem B) adenin s thyminem, guanin s cytosinem C) adenin s cytosinem, guanin s thyminem

Kvíz

3. Princip komplementarity je pravidlo, podle kterého se vzájemně párují nukleotidové báze dvou řetězců DNA. Jak?

A) adenin s guaninem, thymin s cytosinem B) adenin s thyminem, guanin s cytosinem C) adenin s cytosinem, guanin s thyminem

Kvíz

4. Která složka polymerázové řetězové reakce je přímo zodpovědná za navazování volných dinukleotidů na templátovou DNA a tím prodlužování vlákna?

A) DNA polymeráza B) pufr s rozpuštěnými kationty Mg 2+ C) krátké oligonukleotidy (primery)

Kvíz

4. Která složka polymerázové řetězové reakce je přímo zodpovědná za navazování volných dinukleotidů na templátovou DNA a tím prodlužování vlákna?

A) DNA polymeráza B) pufr s rozpuštěnými kationty Mg 2+ C) krátké oligonukleotidy (primery)

Kvíz

5. Při jaké teplotě dochází k denaturaci vlákna DNA, čili přerušení vodíkových vazeb mezi nukleotidovými bázemi a rozdělení dvoušroubovice na dvě samostatná vlákna?

A) 72 ° C B) 87 ° C C) 94 ° C

Kvíz

5. Při jaké teplotě dochází k denaturaci vlákna DNA, čili přerušení vodíkových vazeb mezi nukleotidovými bázemi a rozdělení dvoušroubovice na dvě samostatná vlákna?

A) 72 ° C B) 87 ° C C) 94 ° C

Kvíz

6. Jak se nazývají tři základní kroky jednoho cyklu polymerázové řetězové reakce?

A) polymerace, methylace, oxidace B) replikace, transkripce, translace C) denaturace, nasedání primerů, elongace

Kvíz

6. Jak se nazývají tři základní kroky jednoho cyklu polymerázové řetězové reakce?

A) polymerace, methylace, oxidace B) replikace, transkripce, translace C) denaturace, nasedání primerů, elongace

Kvíz

7. Jak roste počet kopií DNA po každém cyklu PCR?

A) exponenciálně B) lineárně C) logaritmicky

Kvíz

7. Jak roste počet kopií DNA po každém cyklu PCR?

A) exponenciálně B) lineárně C) logaritmicky

Kvíz

8. Který přirozený proces přenosu genetické informace napodobuje metoda PCR?

A) translaci B) transkripci C) replikaci

Kvíz

8. Který přirozený proces přenosu genetické informace napodobuje metoda PCR?

A) translaci B) transkripci C) replikaci

Kvíz

9. Co je to genetický otisk prstu, tzv. DNA fingerprint?

A) část genomu, kterou dědíme po jednom z rodičů B) DNA profil osoby získaný pomocí PCR, který slouží obzvláště v kriminalistice k identifikaci osob C) klasický otisk prstu, který pachatel zanechal na místě činu společně s kouskem své tkáně, ze které kriminalisté v laboratoři získají DNA

Kvíz

9. Co je to genetický otisk prstu, tzv. DNA fingerprint?

A) část genomu, kterou dědíme po jednom z rodičů B) DNA profil osoby získaný pomocí PCR, který slouží obzvláště v kriminalistice k identifikaci osob C) klasický otisk prstu, který pachatel zanechal na místě činu společně s kouskem své tkáně, ze které kriminalisté v laboratoři získají DNA

10. Co je to PCR artefakt?

Kvíz

A) starobylá DNA (tzv. ancient DNA) zkoumaná pomocí PCR B) chyba DNA polymerázy, kdy do nového řetězce zařadí nesprávný nukleotid C) označení prototypu termocykleru se třemi vaničkami s vodou o různých teplotách, ve kterých probíhaly první PCR reakce

10. Co je to PCR artefakt?

Kvíz

A) starobylá DNA (tzv. ancient DNA) zkoumaná pomocí PCR B) chyba DNA polymerázy, kdy do nového řetězce zařadí nesprávný nukleotid C) označení prototypu termocykleru se třemi vaničkami s vodou o různých teplotách, ve kterých probíhaly první PCR reakce