Transcript MolTax2010

REKAPITULACE
x1, y1, z1 = plesiomofie
x2 = synapomorfie (homologie) pro BCD
y2 = autapomorfie pro B
z2 = homoplázie (konvergence) pro ED
REKAPITULACE
Jak získáváme znaky pomocí sekvenace unikátních lokusů
Sekvenace lokusu u taxonů,
které chceme studovat
1. Přednáška
Stažení homologních sekvencí od
relevantních taxonů z databáze
2. přednáška
Tvorba alignmentu
3. přednáška
Bude náplní prvního praktika
tento pátek 9:50, B5
ALIGNMENT
Mutliple sequence alignment (MSA)
Kontrolní otázka: Co v alignmentu představuje jeden znak?
OSTATNÍ METODY ZÍSKÁVÁNÍ
MOLEKULÁRNÍCH DAT
Pokud bychom měli k dispozici kompletní
genomové sekvence organismů, které
chceme studovat, žádné takové metody
bychom nepotřebovali. Jenže je nemáme a
jejich sekvenování je stále neprakticky
drahé. Následující metody umožňují rychle a
často levně získat dostatečné množství dat
pro otázky, které v molekulární taxonomii
řešíme.
DNA-DNA HYBRIDIZACE
Kvantifikace reasociace
• Stanovit střední teplotu tání homoduplexů
Tm= (TmA + TmB)/2
• Stanovit teplotu tání heteroduplexu
• Vypočítat pokles ΔTm
∆Tm=((TmA + TmB)/2) - Tms
• Vypočítat p (podíl rozdílných nukleotidů)
p = ΔTm . 0,01 (0,015)
Kontrolní otázka: Co u téhle metody
představuje jeden znak?
DNA-DNA HYBRIDIZACE
Výhody
• Multilokusová (totilokusová) metoda
• Použitelná na nejvzdálenější taxony
Nevýhody
• Distanční metoda
• Experimentálně dosti náročná
• Vyžaduje větší množství DNA (mg)
• Náchylná k artefaktům (repetitivní DNA)
• Experimentální náročnost N x N
IZOENZYMOVÁ ANALÝZA
•Isozymy – enzymy vykazující stejnou nebo
podobnou aktivitu.
•Alozymy – podmnožina isozymů, alelické
formy téhož enzymu (v jednom lokusu)
•Zymodem -taxonomická jednotka
vymezená na podkladě isozymového vzoru
•Zymogram - rozložení zón a tedy i
jednotlivých enzymů na elektroforetogramu
IZOENZYMOVÁ ANALÝZA
Princip
Detekce
elektroforetickou
mobilitou se lišících
forem enzymů
kódovaných různými
alelami určitého genu.
Jednotlivé enzymy se
detekují
prostřednictvím jejich
specifické aktivity,
většinou pomocí
spřažené enzymatické
reakce s barevným
produktem.
IZOENZYMOVÁ ANALÝZA
Biologická podstata
• Velké množství genů pro enzymy je
polymorfních (nejhojnější alela <90 %)
• Velká část tohoto polymorfismu představuje
polymorfismus vnitropopulační (obvykle 15 %
genů je polymorfních, od 0-50 %) (málo ptáci!)
• Alozymy se liší sekvencí aminokyselin,
značná část změn se projeví změnami
elektromobility.
IZOENZYMOVÁ ANALÝZA
IZOENZYMOVÁ ANALÝZA
Detekce
Princip: Tetrazoliové soli jsou redukovány na modrý formazan
Chromogenní substrát: methyl thiazolová modř(MTT)
přenašeč elektronů: phenasin methosulfát (PMS)
Glukozofosfát isomeráza
fruktozo-6-fosfát
GPI
glukozo-6-fosfát
NADP
GPD
glukonolakton-6-fosfát
NADPH
PMS
MTT
fruktozo-6-fosfát, NADP, MgCl2 ,MTT,
PMS, glukozo-6-fosfát dehydrogenáza
NADP
formazan
IZOENZYMOVÁ ANALÝZA
Výhody
• Kodominance
• Množství polymorfismu je vhodné pro vnitropopulační studie
• Znaková metoda
• Nízká cena analýzy a cena vybavení
Nevýhody
• Nemusí být selekčně neutrální (mikrosatelity jsou lepší)
• Konvergence (i různé alozymy mohou mít shodnou
elektromobilitu)
• Maximální divergence 60-70 %
•u žab na úrovni rodu či spíše druhů
•u savců na úrovni podčeledí
IZOENZYMOVÁ ANALÝZA
Využití
•Studium populační struktury
•rozmnožovací struktura (např. panmixie)
•migrace
•genetická příbuznost populací
•Studium druhové diversity
•kryptické (sibling) druhy (sym/alopatrické)
•determinace známých druhů
•Fylogeneze
MIKROSATELITY
Mikrosatelity - (nazývané i STR - Short Tandem
Repeat) jsou krátké sekvenční motivy
(dinukleotidy až hexanukleotidy) vyskytující se
na některých místech genomu v mnoha
tandemově uspořádaných kopiích o celkové délce
až 150 nukleotidů. Zpravidla existuje velmi značný
vnitropopulační polymorfismus v počtech kopií
daného mikrosatelitu a tento polymorfismus
a mutabilitu (okolo 0,1 % mutací za generaci)
můžeme snadno studovat například PCR
amplifikací daného lokusu.
MIKROSATELITY
Postup při analýze
• najít vhodný lokus (genomová knihovna a
hybridizace)
• připravit PCR primery ohraničující daný
lokus
• amplifikovat lokus
• elekroforéza amplifikovaných fragmentů
MIKROSATELITY
MIKROSATELITY
Využití metody
• vnitrodruhové studie či příbuzné druhy
• kodominance znaků – populační genetika
• modernější a přesnější varianta alozymové
analýzy
• možno analyzovat velké množství vzorků
• nákladné pouze zavedení metody pro nové
organismy
RESTRIKČNÍ ANALÝZY
• Izolace DNA
EcoRI
• Nastříhání DNA pomocí
restrikčních endonukleáz
• Velké množství endonukleáz,
možno použít i jejich kombinace
• Problémy s přílišnou komplexitou
vzorů
– Snížení komplexity výchozí DNA
– Kvalita separace fragmentů
– Specifičnost detekce zón
RESTRIKČNÍ ANALÝZY
RFLP bakteriální DNA
Komplexita bakteriálního
genomu je nízká, a proto
vzniká i méně komplexní vzor,
ze kterého je možno odečíst
jednotlivé pruhy
Celková DNA po
naštěpení rozdělena na
PAGE a obarvena EtBr
RESTRIKČNÍ ANALÝZY
RFLP organelové DNA
Izolovaná cpDNA naštěpena enzymy, rozdělena na agarose a
obarvena EtBr.
RESTRIKČNÍ ANALÝZY
mtRFLP – krok 1
Celková DNA rozštěpena, rozdělena na agarose, obarvena EtBr
RESTRIKČNÍ ANALÝZY
mtRFLP – krok 2 – Southern blot
RESTRIKČNÍ ANALÝZY
mtRFLP – krok 2
DNA z agarosy přeblotována na nylon, hybridizována s mtDNA
sondou a detekována autoradiograficky.
RESTRIKČNÍ ANALÝZY
VNTR – Variable Number of Tantem Repeats
Využívá polymorfismus v počtu
kopií tandemových repetic –
minisatelitů (10-60 nt). Tento
polymorfismus je velmi
variabilní i mezi jedinci téhož
druhu.
Celkovou DNA naštípeme restrikční endonukleázou
štěpící mimo minisatelit. Naštípanou DNA
přeblotujeme na membránu a hybridizujeme se
značenou próbou buďto proti minisatelitu (pokud
chceme zviditelnit všechny lokusy) nebo nebo proti
minisatelitu a unikátní sekvenci v sousedství (pokud
chceme zviditelnit jeden lokus, na obrázku).
RESTRIKČNÍ ANALÝZY
Výhody
•
•
•
•
•
•
Relativní jednoduchost a láce
Velké množství dat
Slušná reprodukovatelnost
Kodominance znaků
Multilokusový charakter
Selekční neutralita znaků
RESTRIKČNÍ ANALÝZY
Nevýhody
•
•
•
•
Potřeba většího množství DNA
Potřeba kvalitnější a čistší DNA
Spíše pro příbuzné druhy
Někdy špatně čitelné
elektroforetogramy – nutnost snižovat
komplexitu DNA
• Znaky nemusí být nezávislé
• Spíše distanční metoda
SINE
Short INterspersed repetitive Elements
Retroposony derivované z tRNA, případně 7 SL
RNA (Alu). Velikost: 70-500 PB. Vytvářejí značnou
část eukaryotického genomu, často až 104 kopií na
genom. Výhoda pro molekulární fylogenetiku
existuje jen malá pravděpodobnost, že by se u dvou
nepříbuzných organismů vložily do stejného místa a
je téměř vyloučeno, že by se bezestopy z daného
místa vystřihly.
SINE
Postup
• Najít nový SINE element (in vitro transkribce
celkové DNA)
• Naklonovat úseky genomu obsahující daný
SINE (genomová knihovna)
• Vytipovat SINE lokusy které jsou polymorfní u
studovaného taxonu (hybridizace nebo PCR)
• PCR amplifikace vybraného lokusu
• Ověření absenci SINE sekvenací získaných
krátkých PCR fragmentů
SINE
PCR produkty EtBr
Hybridizace se
SINE probou
Hybridizace s okolní
unikátní sekvencí
SINE
SINE
Využití
• použitelná pro vyšší taxony (maximálně však
75-100 milionů let
• málo znaků – není možno počítat délku větví
• unikátní události malá pravděpodobnost
homoplázií
• vždy nutno ověřit absenci SINE v daném
lokusu minimálně amplifikací, raději
sekvenací
RAPD
Random Amplified Polymorphic DNA
• Amplifikace pomocí „náhodných“ primerů
• Různé metody zvyšování počtu znaků
– Kombinace primerů, restrikce enzymy,
semiselektivní primery (transposomy)
RAPD
Výhody
•
•
•
•
•
•
•
Cena
Rychlost
Univerzálnost
Malé množství materiálu
Nižší požadavky na kvalitu DNA
Obrovské (libovolné) množství dat
Kvalita elektroforetogramů
RAPD
Nevýhody
• Neprodukuje věrohodné znaky (mnoho
falešných homologií), při analýze je třeba
převést na genetické vzdálenosti
• Použitelné jen u relativně příbuzných druhů
• Chybí kodominance
• Interference znaků
– Vliv kontaminující DNA
• Nízká reprodukovatelnost PCR
AFLP
Amplified Fragment Length Polymorphism
AFLP
AFLP
kapilárová elektroforéza
standard molekulární váhy
amplifikované fragmenty
AFLP
Výhody
• Vysoká reprodukovatelnost výsledků
• Velké množství znaků
• Kodominance znaků
• Minimum falešných homologií
• Lze použít znakově orientované metody
Nevýhody
• Nákladnost kitů i přístrojového vybavení
• Složitost metody
• Spíše pro příbuzné druhy