Transcript KVANTIFIKACE ZMĚN GENOVÉ EXPRESE

KVANTIFIKACE ZMĚN
GENOVÉ EXPRESE
•
Northern bloty
pracné a zdlouhavé
•
Genové čipy
nákladné; http://www.molbio.upol.cz/
•
Semikvantitativní RT-PCR
nepřesné
•
qPCR
metodiky real-time PCR
vysoké dynamické rozpětí
problém: precizní kvantifikace mRNA
spektrofotometrické stanovení koncentrace RNA nemusí být dostatečné
řešení: stanovení
koncentrace RNA pomocí
fluorescenčního barviva
RIBOgreen™ - 1000x
citlivější, nereaguje s
nukleotidy a krátkými
fragmenty.
nebo
relativní stanovení pomocí
qPCR
NORTHERN BLOT
control
expt
cílový gen GOI
referenční gen
aktin, GAPDHetc
korigovaný nárůst exprese = 10/2 = 5
aplikace REAL-TIME PCR
1) absolutní kvantifikace
množství DNA ve vzorku k externímu standardu,
detekce virální či bakteriální DNA, forenzní chemie
2) koncová detekce
SNP genotypizace, detekce mutací a polymorfismů
3) relativní kvantifikace
srovnání úrovně exprese mRNA nebo mikroRNA
mezi různými tkáněmi či biologickými podmínkami
princip
měření vznikající fluorescence po každém
cyklu PCR, stanovení křivek tání
chemismus
1) interkalační barviva
SYBRgreen
interkalace barviva na dvoušroubovici vznikající
(amplifikované) DNA
precizní výběr primerů – nesmí vytvářet dimery
nutná kontrola amplifikovaného produktu na
křivku denaturačních teplot
chemismus
2) hybridizační sondy (TAGman)
uvolňování fluorescence po degradaci sondy
nutná 5´-3´exonukleasová aktivita Taq polymerasy
fluorescenční značka: VIC, FAM (fluorescein)
zhášeč: Tamra (Tetramethyl-6-Carboxyrhodamine )
FRET = Förster/fluorescence resonance energy transfer
srovnání
TagMan
SybrGreen
specifita
primery
proba
PCR podmínky
primery
PCR podmínky
flexibilita
singleplex
multiplex (max.4)
singleplex
aplikace
kvantifikace
SNP detekce
kvantifikace
cena
vysoká
nízká
kontaminace
• největší problém PCR
• aerosol, pipety, staré amplikony
• částečné řešení
URACIL N-GLYKOSYLASA





štěpí ss a dsDNA s inkorporovaným deoxyuracilem (dUTP)
termolabilní, 0% aktivita nad 55◦C
nereaguje s templátem (dTTP)
dUTP v qPCR mixu místo dTTP
pracuje během nastavení PCR reakce
chyby v pipetování
•
•
templát (cDNA)
premix (primery, proba, polymerasa, dNTP, pufr, srovnávací
fluorescenční barvivo)
částečné řešení
- ROX (Karboxy-X-Rhodamin)
fluorescence se nemění během PCR cyklů a vzrůstající
fluorescence v každé zkumavce vzorku je extrapolována na
srovnávací
DVOJÍ PIPETOVÁNÍ REAKČNÍ SMĚSI
pracujeme s premixy
1)
pufr, Mg2+,dNTP, ROX, SybrGreen, TaqPol, primery
2)
vzorek (cDNA, genomická DNA)
AMOUNT OF DNA
lineární vynesení
1600000000
AMOUNT OF DNA
1
2
4
8
16
32
64
128
256
512
1,024
2,048
4,096
8,192
16,384
32,768
65,536
131,072
262,144
524,288
1,048,576
2,097,152
4,194,304
8,388,608
16,777,216
33,554,432
67,108,864
134,217,728
268,435,456
536,870,912
1,073,741,824
1,400,000,000
1,500,000,000
1,550,000,000
1,580,000,000
1400000000
1200000000
1000000000
800000000
600000000
400000000
200000000
0
0
5
10
15
20
25
30
35
PCR CYCLE NUMBER
logaritmické vynesení
AMOUNT OF DNA
CYCLE NUMBER
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
10000000000
1000000000
100000000
10000000
1000000
100000
10000
1000
100
10
1
0
5
10
15
20
25
PCR CYCLE NUMBER
30
35
lineární ~20 do ~1500
CT hodnoty
threshold
treshold je třeba nastavit
aby
u každého
vzorku procházel lineární části
SERIEStak
OF
10-FOLD
DILUTIONS
15
křivky
CT počet cyklů při kterém fluorescence vzorku překročí threshold (prahovou
hodnotu)
před každou kvantifikací je třeba vždy udělat
standardní křivku
threshold
SERIES OF 10-FOLD DILUTIONS
templát: 10x ředění
buď přímo cDNA, nebo plasmid s
naklonovaným genem, který
stanovujeme
15
CT
koncentrace templátu
PARAMETRY STANDARDNÍ KŘIVKY
• směrnice: ideální -3,32 = 100% efektivita reakce
• %EFF – kolik kopii templátu je zkopírováno v každém cyklu
• R2 korelační koeficient (tolerovat se dá ještě 0,995)
Eff=10(-1/slope) –1
1,200,000,000
%EFF
1,000,000,000
800,000,000
600,000,000
100%
= 2.00x
400,000,000
90% = 1.90x
200,000,000
80% = 1.80x
0
70% 0= 1.70x
10
20
10,000,000,000
100% EFF
90% EFF
80% EFF
70% EFF
1,000,000,000
AMOUNT OF DNA
CYCLE AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA
100% EFFICIENCY 90% EFFICIENCY 80% EFFICIENCY 70% EFFICIENCY
0
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
4
4
3
3
3
8
7
6
5
4
16
13
10
8
5
32
25
19
14
6
64
47
34
24
7
128
89
61
41
8
256
170
110
70
9
512
323
198
119
10
1,024
613
357
202
11
2,048
1,165
643
343
12
4,096
2,213
1,157
583
13
8,192
4,205
2,082
990
14
16,384
7,990
3,748
1,684
15
32,768
15,181
6,747
2,862
16
65,536
28,844
12,144
4,866
17
131,072
54,804
21,859
8,272
18
262,144
104,127
39,346
14,063
19
524,288
197,842
70,824
23,907
20
1,048,576
375,900
127,482
40,642
21
2,097,152
714,209
229,468
69,092
22
4,194,304
1,356,998
413,043
117,456
23
8,388,608
2,578,296
743,477
199,676
24
16,777,216
4,898,763
1,338,259
339,449
25
33,554,432
9,307,650
2,408,866
577,063
26
67,108,864
17,684,534
4,335,959
981,007
27
134,217,728
33,600,615
7,804,726
1,667,711
28
268,435,456
63,841,168
14,048,506
2,835,109
29
536,870,912
121,298,220
25,287,311
4,819,686
30
1,073,741,824
230,466,618
45,517,160
8,193,466
100,000,000
10,000,000
1,000,000
100,000
10,000
1,000
100
10
1
0
10
20
30
PCR CYCLE NUMBER
relativní kvantifikace je možná pouze pokud sledovaný gen a referenční gen
má srovnatelnou a vysokou efektivitu > 90%  3%
tolerance efektivity
Chemismus SybrGreen
Nutná kontrola výsledných amplikonů na teplotní křivky tání
teplota
REFERENČNÍ GEN
• musí mít stabilní expresi ve všech studovaných
vzorcích
• nejčastěji provozní geny (house-keeping)
• aktin, GAPDH, cyklofilin, 18S RNA, EF1
TaqMan Human Endogenous Control Plate
CT
CT = 2
čtyřnásobný rozdíl v expresi
změna v jednom cyklu při 100% efektivitě je rovna dvounásobné změně ve
výchozí koncentraci cDNA
18S ribosomální RNA
• přepisována jinou RNA polymerasou než mRNA
• byly popsány výkyvy mezi množstvím rRNA a mRNA
• nelze použít pokud se vychází z mRNA
vyhodnocení
kalibrátor
sample 1
sample 2
izolace celkové RNA (mRNA) přepis do cDNA
navržení primerů a sond pro referenční gen a studovaný (GOI)
určení standardních křivek pro oba geny a stanovení efektivity
GAPDH
GOI
GAPDH
GOI
GAPDH
GOI
vyhodnocení
kalibrátor sample A
sample A
sample B
kalibrátor
sample B
GAPDH
GOI
1
vyhodnocení
metoda „delta delta cé té“
změny exprese pro sample 1
1. určíme CT pro všechny křivky
2. určíme CT
3.
4.
GOI
určíme CT
- CT
GOI
GAPDH
- CT
pro kalibrátor
CT kalibrátor
pro sample 1
CT sample 1
GAPDH
CTsample 1 - CTkalibrátor
CT
výsledek (kolikrát je gen více či méně exprimován)
2-CT
2
vyhodnocení
počítá se i s efektivitou
Sample A - kalibrátor
Sample B - vzorek
3
vyhodnocení
pomocí standardů o známe koncentraci se spočítají počty kopií ve
vzorcích
příklad
linie živočišných buněk byla podstoupena umlčení (silencing) genu pkg2 s
linie transfekované a netransfekované (kalibrátor) byla izolována RNA,
přepsana do cDNA a provedeno qPCR s primery a probou na gen pkg2 a
GAPDH (referenční gen).
Snížila se exprese genu pkg2 po umlčení?
pkg2 Eff 86%
cDNA
cDNA
kalibrator
silencing
CT 22,48
CT 22,3
GAPDH Eff 77%
cDNA kalibrator
CT 20,05
cDNA silencing
CT 16,97
pkg2
2-CT
2
–(5,33-2,43)
0,134
7,5x
cDNA
cDNA
1,1x104 kopií
1,23x104 kopií
kalibrator
silencing
GAPDH
(1+0,86)0,18/(1+0,77)3,08
0,192
Gen snížil expresi
5,2x
cDNA
cDNA
kalibrator
silencing
1,55x104 kopií
8,92x104 kopií
0,194
5,2x
navrhování primerů
velikost amplikonu
50-150 bp
délka primerů
20 bp
primery se nesmí překrývat s próbou
Tm 58-60◦C
optimální teplota pro degradaci proby exonukleasovou aktivitou
GC obsah 50-70%
žádné vlásenky
žádné dimery (self-dimery, cross-dimery)
navrhování proby
délka proby
13-25 bp
primery se nesmí překrývat s próbou
Tm 68-70◦C
o 10◦C vyšší než Tm primerů
GC obsah 50-70%
žádné G na 5´konci
zháší fluorescenci FAM barvy
navrhování primerů a proby
kontaminace genomickou DNA
1) ošetření vzorků před RT DNasou
2) navržení primerů do dvou exonů mezi nimiž je dlouhý intron
3) navržení primeru nebo proby na přechod intron/exon
MGB PROBY
•
minor groove binding
•
stabilizuje vazbu proby na ssDNA
•
výrazně zvyšuje Tm
•
můžeme navrhovat krátké proby při
zachování vysoké Tm
MGB PROBY
využití pro alelické diskriminace
kolik replikací a kdy replikovat?
sample
extrakce RNA
přepis do cDNA
qPCR
3X
6X
kolik replikací a kdy replikovat?
ideální 3x
sample
extrakce RNA
přepis do cDNA
qPCR
27X
instrumentace
7500 Real Time PCR System
7900HT Real Time PCR System
StepONE Real Time
PCR System
zesilovač
halogenová
lampa
emisní filtry
excitační filtry
zkumavky se vzorky v
peltierovém bloku
ccd
kamera
instrumentace
http://www.youtube.com/watch?v=k16WgEU1kVM
HRM ANALYSA
(HIGH RESOLUTION MELT)
• detekce SNP bez specifických sond
• díky kvalitní instrumentaci Corbett (0.02◦C) a
nové generaci interkalačních barviv (LCGreenPlus)
HRM ANALYSA
pro amplikony do 200bp