Transcript 2,3 Mb
Laboratorní postupy testování toxicity
průmyslových chemikálií – část I
Průmyslová toxikologie (C867)
Posouzení nebezpečnosti PrCHL pro lidské
zdraví
CÍL
•
odvodit hodnoty expozice látek, jež by pro člověka neměly být překročeny
CESTA
•
získat informace o nepříznivých (toxických) účincích na zdraví způsobené
expozicí látky nebo přípravku.
INFORMACE O
•
•
•
•
•
•
toxikokinetice, metabolismu a distribuci
akutních účincích (akutní toxicita, dráždivost a žíravost)
senzibilizaci
toxicitě po opakovaných dávkách
účincích CMR (karcinogenita, mutagenita a toxicita pro reprodukci)
účincích na činnost hormonů
Strategie zkoušení - minimalizace počtu zvířat
Metody:
in silico – modelové systémy na počítači
in vitro – pokusy mimo živé tělo (vitrum = zkumavka)
ex vivo – pokusy mimo živé tělo
in vivo – pokusy v živém organismu
Strategie zkoušení v praxi
•
•
•
počítačové modely a databáze = predikce toxicity
alternativní metody in vitro = predikce dávky
nové metody in vivo = mechanismus působení v organismu, na
omezeném počtu zvířat s použitím zobrazovací techniky
Strategie zkoušení - minimalizace počtu zvířat
Replacement = nahrazení:
•
metody in vitro mimo živý organismus = ALTERNATIVY BEZ POUŽITÍ ZVÍŘAT
Reduction = redukce počtu:
•
in vivo = v živém organismu, na omezeném počtu pokusných zvířat
Refinement = zmírnění:
•
in vivo, ex vivo = živý organismus, upravené metody experimentování
Koncepci alternativ k pokusům na zvířatech položili Russel a Burch 1959
v knize „Principy humánní experimentální techniky“.
•
Alternativy zahrnují všechny postupy, které mohou buď úplně, nahradit pokusy
na zvířatech, nebo snižovat počet používaných zvířat, nebo alespoň zmenšovat
jejich utrpení v pokusech, které podstupují zvířata proto, aby byly uspokojeny
základní potřeby člověka, nebo jiných zvířat“. (Přesná definice Smyth, 1978
Fram, Bals 1983)
Toxikologické testování
EXPOZICE - ČAS - CESTA
Podle času
•
•
•
•
Akutní
Subakutní
Subchronická
Chronická
jednorázová, krátkodobá
opakovaná, 14; 28-denní
opakovaná 90-denní
opakovaná 6; 12; 24 měsíců
Podle cesty vstupu do organismu –
• Orální – do zažívacího traktu ve vodě; v krmení; sondou
• Dermální – na kůži
• Inhalační – do respiračního traktu
Způsob podání – přiblížit se možné expozici pro člověka !
Laboratorní zvířata
Konvenční typ zvířat
• otevřený chov za dodržení základních hygienických pravidel,
•
nedefinovaná mikroflóra.
SPF (Specific pathogen free)
•
•
bariérový chov – přísná hygienická pravidla,
Nesmí být přítomny specifické patogeny pro daná laboratorní zvířata
Axenická – Germ-free
•
•
chov ve sterilním prostředí v bezmikrobních izolátorech
bez mikroflóry v zažívacím traktu a na povrchu těla
Gnotobiotická zvířata
•
•
•
chov ve sterilním prostředí – bezmikróbní izolátory
+ velmi dobře definovaná střevní mikroflóra
= očkování specifické mikroflóry axenickým zvířatům
Testování na zvířatech - Legislativa ČR
Zákon a. 246/1992 Sb., na ochranu zvířat proti týrání
•
přednostně používat alternativní metody.
Vyhláška o ochraně, chovu a využití pokusných zvířat
•
zajistit standardní podmínky pro experimentální zvířata
Nejčastěji používaná laboratorní zvířata
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Myš laboratorní
Potkan laboratorní
Morče domácí
Křeček
Králík domácí
Pes domácí
Prase domácí
Ptáci
Ryby
Testy na zvířatech – podmínky ve viváriích
TEPLOTA
•
•
Zachování tepelné rovnováhy, v němž je organismus v klidovém stavu
Myš, Potkan, Morče – 22 + 2 °C, Králík, Pes 18 + 3 °C, Prase, Ovce 17 + 7 °C
VLHKOST VZDUCHU
•
•
V prostorách pro zvířata je nutná stálá relativní vlhkost cca 55 + 10 %.
Rozmezí 30 – 70% . Jiné po dobu delší než 48 hodin = nepřiměřený stres.
SVĚTLO: intenzita, kvalita,
•
•
•
•
Doporučen světelný režim 12 hodin světlo- 12 hodin tma
Intenzita osvětlení do 200 lx. Pouze při ošetřování 1000 – 1300 lx.
Citlivost u albinotických zvířat. Postupné stmívání vyžadují jen kuřata.
Denní světlo požadují: opice, pes, kočka. Nevhodné pro hlodavce.
Testy na zvířatech – podmínky ve viváriích
AKLIMATIZACE
•
před experimentem minimálně 5 dnů po dodání z chovného zařízení
VODA
•
pitná voda (ad libitum), stálá kontrola kvality
POTRAVA
•
standardní peletovaná krmná směs určená pro daný druh zvířete
KONTROLA ZDRAVOTNÍHO STAVU
•
permanentní kontrola = bakteriologické a parazitologické vyšetření určitého
vzorku experimentální zvířat
KONTROLA PROSTŘEDÍ
•
monitorování čistoty prostředí ve viváriu – mikrobiologické vyšetření stěrů z
chovných nádob a jiného technologického zařízení
Akutní toxicita orální – OECD 420, 423, 425
DEFINICE
•
nepříznivé účinky látky, které se projeví po orálním podání jedné dávky nebo více
dávek látky během 24h.
Strategie testování:
1. in silico
2. in vivo – v současné době není vhodná in vitro metoda
TESTOVACÍ METODA
•
pokusné zvíře – albinotický potkan (3 ks na dávku)
•
příprava zvířat - odebrání potravy – 24h před testem, vážení
•
limitní test – výchozí dávka 2000 mg/kg
a) negativní výsledek – test ukončen
b) úhyn - úplná studie – následné dávky – 300, 50 a 5 mg/kg.
Akutní toxicita orální – OECD 420, 423, 425
KLINICKÁ VYŠETŘENÍ
•
příznaky toxicity – změny kůže, srsti, očí, sliznic, dýchání a krevníhooběhu,
vegetativního a centrálního nervového systému, motorické aktivity a chování.
Pozornost bude věnována také výskytu třesu, křečím, slinění, průjmu, letargii,
spánku a kómatu.
MAKROSKOPICKÁ PITVA
•
•
u všech zvířat použitých ve studii (uhynulých i utracených). Utracení
bude provedeno vet. přípravkem T 61 inj. ad us vet. (15. den testu).
VÝSLEDEK TESTU
LD50 ekvivalentních dávek – kategorie
•
A 50 – 5 mg/kg – velmi toxický
•
B 300 – 50 mg/kg – toxický
•
C 300 – 2000 mg/kg – škodlivý
•
D 2000 – 5000 mg/kg - netoxický
Akutní toxicita inhalační – OECD 403
•
albinotický potkan - obojí pohlaví
•
příprava test. látky – příslušná koncentrace v ovzduší
•
inhalační box – průtok vzduchu, sledování koncentrace v dýchací zóně,
měření teploty a vlhkosti
•
limitní test – nejméně 4 hod expozice, c=20 mg/L plynu, par, aerosolu nebo
5 mg/L pevné látky
– toxické účinky nepozorovány - ukončení studie
– úhyn – celá studie, expoziční koncentrace – nejméně 3 hladiny (10
zvířat pro jednu dávku 5+5)
•
pozorování – 14 dní , makroskopická pitva
•
stanovení LC50 (letální koncentrace = 50% úhyn)
Akutní toxicita inhalační – OECD 403
Systém pro inhalační expozici plynům a aerosolům
Akutní toxicita dermální – OECD 404
•
albinotický potkan - obojí pohlaví
•
příprava zvířat – holení (24h. před začátkem testování), vážení
•
aplikace rovnoměrně na plochu asi 10% celkového povrchu těla – látka
navlhčena – zajištění dobrého kontaktu s kůží
S (mm2) = hmotnost (g) x 0,66 x délka těla (mm)
•
doba expozice – 24h. – testovaná látka je fixována pomocí mulového
obvazu a nedráždivé náplasti – zabránění orálnímu příjmu
•
ukončení aplikace – zbytky odstraněny omytím vodou
•
pozorování – 14 dní , makroskopická pitva
Testy kožní dráždivosti a leptavosti
DEFINICE
•stanovení dráždivých/leptavých účinků po jednorázovém nanesení testované
látky na kůži.
Strategie testování:
1. In silico + pH testované látky
2. In vitro – modely lidské kůže EpiDerm, EPISKIN
3. In vivo – pokusné zvíře albinotický králík
Testy kožní dráždivosti a leptavosti
In-vitro – Modely lidské kůže EpiDerm a Episkin
Princip:
•trojrozměrný model lidské kůže - rekonstruované epidermis s funkční stratum
corneum
•účinek testované látky na životnost buněk
•cytotoxicita je vyjádřena jako redukce aktivity mitochondriální dehydrogenázy
Provedení:
•testovaná látka je umístěny na stratum corneum epidermálního modelu ve 2
epozičních časech. Expozice je ukončena omytím fosfátovým pufrem. Poté jsou
tkáně inkubovány s MTT (žlutá tetrazoliová sůl). Pokud jsou buňky živé, MTT je
v mitochondriích redukován sukcinát dehydrogenázou na modrý formazanový
precipitát. Ten je přes noc z buněk vyextrahován okyseleným izopropanolem a
kvantifikován spektrofotometricky.
Použití:
•testy leptavých účinků na modelech lidské kůže jsou schopny rozlišit dráždivé a
leptavé účinky.
Testy kožní dráždivosti a leptavosti
EPISKIN
MTT
Formazan
Testy kožní dráždivosti a leptavosti
Pozorovaná barevná změna při in-vitro testu na kožním modelu Episkin
Akutní toxicita
dráždivé a leptavé účinky na kůži - OECD 404
•
In vivo test nelze použít pro látky s pH menším než 2 a vyšší než 11,5
TESTOVACÍ METODA
•
pokusné zvířa – albinotický králík plemene Novozélandský bílý bez rozlišení
pohlaví
- dávka – 0,5 ml nebo 0,5 g (zaleží na skupenství)
- před aplikací oholení kůže ve hřbetní krajině, vážení zvířete
•
aplikace testované látky (6cm²) - fixace pomocí mulového obvazu a nedráždivé
náplasti (u pevných testovaných látek – smočení vodou – lepší kontakt s kůží)
Akutní toxicita
dráždivé a leptavé účinky na kůži - OECD 404
Počáteční zkouška – 1 zvíře – expozice: 3 min., 1h., 4h.
Potvrzující zkouška - 2 zvířata - expozice: 4h.
•pozorování - stupeň podráždění kůže - příznaky erytému a edému za 1 hod, 24, 48,
72 hodin a dále pokud je nutné 1x denně po dobu 14 dnů
•jiné toxické účinky (pitva jen v závažných případech toxicity)
HODNOCENÍ VÝSLEDKU TESTU
•stupeň podráždění kůže, vratnost či nevratnost kožních lézí
Testy oční dráždivosti a leptavosti
DEFINICE
•
stanovení dráždivých a leptavých účinků na oči po jednorázové aplikaci
testované látky do oka
Strategie testování:
1. In silico
2. In vitro – modely EpiOcular
3. Ex vivo – metoda BCOP – test na hovězí rohovce
4. In vivo – pokusné zvíře - albinotický králík
Testy oční dráždivosti a leptavosti
In-vitro – Modely lidské kůže EpiOcular
Princip testu:
•trojrozměrný model umělé tkáně EpiOcularTM z lidských keratinocytů kultivovaných
do podoby vrstevnatého dlaždicovitého epitelu podobného lidské rohovce
•zjišťuje se účinek látky na životnost buněk, cytotoxicita je vyjádřena jako redukce
aktivity mitochondriální dehydrogenázy
Provedení:
•testovaná látka je umístěna na povrch modelu ve 3 expozičních časech
•inkubace v 37°C, 5%CO2 inkubátoru v intervalech – 3 min., 30 min., a 60 min)
•do testu vloženy i tkáně inkubované s pozitivní (Triton X-100) a negativní kontrolou
(destilovaná voda)
Testy oční dráždivosti a leptavosti
Ex-vivo – Metoda BCOP – Bovine Corneal Opacity and Permeability
– OECD 437
•
BCOP je alternativní metoda pro testování oční dráždivosti/žíravosti in-vitro.
Účelem zavedení BCOP testovací metody je snaha o redukci množství použitých
laboratorních zvířat (králíků) nahrazením jiným testovacím systémem, tj. použití
tkání z poraženého hovězího dobytka (ex-vivo).
•
Míra poškození rohovky způsobeného testovanou látkou je vyjádřena kvantitativně
IVIS (in vitro irritancy score) pomocí něhož je přiřazena kategorie dráždivosti pro
odhad in-vivo očního dráždivého potenciálu testované látky.
Testy oční dráždivosti a leptavosti
Ex-vivo – Metoda BCOP – Bovine Corneal Opacity and Permeability
– OECD 437
•
Rohovky bez defektů jsou odříznuty (2 až 3 mm prstenec bělimy).
Izolované rohovky jsou umístěny do speciálně navržených držáků. Držáky jsou
naplněny mediem (EMEM).
Testy oční dráždivosti a leptavosti
Ex-vivo – Metoda BCOP – Bovine Corneal Opacity and Permeability
– OECD 437
Opacita:
•
množství světla prošlého rohovkou (opacitometr), průměrná hodnota
opacity
Permeabilita:
•
množství fluoresceinu sodného, které proniklo všemi buněčnými vrstvami
rohovky. Roztok fluoresceinu (4[l] nebo 5[s] mg/ml) je přidán do přední
komory držáku (epithelialní strana rohovky). Koncentrace fluoresceinu,
která pronikla do zadní komory (endoteliální strana rohovky) je měřena
pomocí UV/VIS spektrofotometru při 490 nm
Testy oční dráždivosti a leptavosti
Ex-vivo – Metoda BCOP – Bovine Corneal Opacity and Permeability
– OECD 437
průměrná hodnota permeability OD490 - IVIS (in vitro irritancy score)
IVIS = průměrná hodnota opacity + (15x průměrná hodnota permeability OD490 )
IVIS
≥55,1
Klasifikace
Dráždivé nebo žíravé
Akutní toxicita dráždivé a leptavé účinky na oči
– OECD 405
In vivo test
TEST JE PROVÁDĚN V NÁVAZNOSTI NA TEST DRÁŽDIVÉ A LEPTAVÉ
ÚČINKY NA KŮŽI
provedení testu je možné jen při znalosti účinků testované látky na kůži
pozitivní test na kůži – předpoklad pozitivního účinku i na oko
(oko citlivější) – netestuje se na zvířatech
Akutní toxicita dráždivé a leptavé účinky na oči
– OECD 405
In vivo test
TESTOVACÍ METODA
•
pokusné zvířa – albinotický králík plemene Novozélandský bílý bez rozlišení
pohlaví
•
24 hodin před aplikací vyšetření obou očí, vážení zvířete
•
dávka – 0,1 ml nebo 0,1 g (zaleží na skupenství)
•
aplikace testovaného materiálu do spojivkového vaku levého oka (pravé oko –
kontrola)
Počáteční zkouška – 1 zvíře
Potvrzující zkouška - 2 zvířata
Akutní toxicita dráždivé a leptavé účinky na oči
– OECD 405
In vivo test
TESTOVACÍ METODA
•
výplach – 24h. po aplikaci testovaného materiálu
•
pozorování
– oči se vyšetřují po 1, 24, 48 a 72 hodinách
– oční léze – intenzita (rohovka, duhovka, mžurka, spojivka),
– vratnost nebo nevratnost změn (pozorování až 21 dní)
– jiné projevy toxicity (denně)
HODNOCENÍ VÝSLEDKU TESTU
•
stupeň vzniku očních lézí na rohovce, duhovce, mžurce, spojivce