Transcript homologní rekombinace

Transgenoze:
metody transformace rostlin,
rekombinace
Vnesení genu
• stabilní
• transientní
dochází / nedochází k integraci vnesené DNA do genomu
•
Vnášená DNA se může začlenit do jaderné či
organelové DNA (plastom, chondriom)
- pro expresi genu (= tvorba funkčního proteinu či RNA)
v jiném organismu jsou nutné regulační sekvence
- rozpoznání transkripčním (a příp. i translačním aparátem)
v organismu příjemce
- umožňují funkční přenosy genů i mezi vzdálenými organismy
Transkripce
Transkripční faktor
RNA polymeráza
polyA
mRNA
PROMOTOR
TERMINÁTOR transkripce
= polyA signál
Promotor:
- určuje začátek a směr transkripce
- váže transkripční faktory – časově/místně specifická transkripce
- konstitutivní x inducibilní: ethanol, teplo, dexametazon, estradiol, …
vedlejší účinky, částečná aktivita (leakiness)
- původ: rostliny, rostlinné patogeny
(viry – JAKÉ?, agrobaktérium)
- transkripce ale ovlivněna i místem integrace a stavem chromatinu (TGS)!
Translace
AACAATG
terminační kodón
mRNA
kódující sekvence
-
stabilita transkriptu
(PTGS – polyA, počet kopií, introny)
-
odlišné využívání kodónů
u různých skupin organismů
-
odlišné užívání kodónů v závislosti
na kontextu (nukleozómy)
-
charakter sekvence před iniciačním
kodónem (Kozakové sekvence)
přenos genů mezi baktériemi a
rostlinami - cílená mutageneze
pomocí PCR, …
Princip přípravy transgenních rostlin
1.
Transformace jedné somatické buňky (vaječné buňky)
2.
3.
Pomnožení transformované buňky (zpravidla za selekčních podmínek)
Indukce organogeneze či somatické (zygotická) embryogeneze
(často aplikací vhodných regulátorů rostlinného růstu v in vitro podmínkách)
vnesení genu
selekce
organogeneze
embryogeneze
transformovaná
buňka
transformovaný kalus
Somaklonální variabilita
- průvodní jev regenerací de novo
(tedy i transformací)
Příčiny:
pretransformační x posttransformační
- somatické mutace (různého typu)
- somatické reaktivace TE
- epigenetické změny v somatických buňkách
- samovolné či indukované při diferenciaci a
následné de- a rediferenciaci (např. změny ploidie
v důsledku působení růstových regulátorů - synt.
auxinů)
Optimalizace
transformačního protokolu
Optimalizace:
- rostlinného materiálu
- schopnost aktivace buněčného dělení (kalus)
- schopnost následné regenerace (!)
- genotyp, orgán, vývojové stádium, ošetření …
- metody přenosu DNA
- selekčního systému
Selekce transformovaných buněk (rostlin)
Selekční geny - pouze transformované, rezistentní buňky se
mohou dělit (a vytvořit rostlinu)
- rezistence k antibiotikům (kanamycin, hygromycin)
- k herbicidům (Roundup® - glyphosate, Liberty® - glufosinate)
5-enolpyruvylšikimát-3-fosfátsyntáza, glutaminsyntetáza
(produkt selekčního genu buďto degraduje selekční látku, či
komplementuje zasaženou buněčnou funkci)
- PMI (fosfomanóza isomeráza) – přeměna manóza-6-P na
fruktóza-6-fosfát, …
Reportérové geny
(vizuální selekce transformantů):
- GFP (zelený fluorescenční protein),
- glukuronidáza, luciferáza, …
Selekční markery
princip
selekce
selekční agens
gen
produkt genu
nptII
neomycinfosfotransferáza
kanamycin
hpt
hygromycinfosfotransferáza
hygromycin
dhfr
dihydrofolátreduktáza
ble
vazebný protein bleomycinu
bleomycin
cat
chloramfenikolacetyltransferáza
chloramfenikol
bar
fosfinotricinacetyltransferáza
fosfinotricin
(glufosinát)
EPSP
CP4
bakteriální 5-enolpyruvylšikimát3-fosfátsyntáza
deh1
dehalogenáza
rezistence
k
antibiotiku
rezistence
k herbicidu
methotrexát
glyfosát
dalapon
Metody transformace
„Přirozené“ metody
• via Agrobacterium
– modifikace metody: infiltrace (vakuová), floral dip
• pomocí rostlinného viru
– přechodná (transientní) transformace (DNA není začleněna do
genomu)
Biolistika („particle bombardment“, „microprojectile bombardment“)
- modifikace: agrolistika (využití biolistiky a proteinů agrobaktéria)
Direct gene transfer – přímé vnesení DNA do protoplastu:
• elektroporací
• působením polyethylenglykolu (PEG)
Mikroinjekce do buněk
Přirozená transformace agrobaktériem
(Agrobacterium tumefaciens)
• půdní baktérie G- (Rhizobiaceae), Ti plasmid
• „genetický parazitismus“ na dvouděložných
rostlinách
• přenáší několik svých genů do rostlinných buněk v
místě poranění
– z transformované buňky se tvoří nádor:
ipt – isopentenyltransferáza
iaaH – indolacetamidhydroláza
– transformované buňky tvoří výživné látky (opiny)
pro agrobaktérium (nopalin/octopinsyntáza)
Přirozená transformace agrobaktériem
Upravené agrobaktérium
- geny způsobující vznik nádoru
a syntézu opinů odstraněny
– využívá se pouze schopnosti
agrobaktéria přenášet T-DNA
(definovanou hraničními
sekvencemi) do rostlinných b.
Ti plasmid rozdělen (na dva):
• T-DNA v malém podvojném
(binárním) plasmidu
• vir geny (zodpovědné za
přenos T-DNA) na helper
plasmidu in trans)
Schema binárního transformačního vektoru pro přenos
do rostlinné buňky pomocí agrobakteria
Binární transformační vektor
pro
selekční marker
ter
transgen
ori
selekční marker
pro
Sekvence pro expresi v bakteriální
buňce (promotor, selekční marker,
počátky replikace, počátek
ori
ori
Sekvence pro expresi v rostlinné
buňce (promotor, selekční marker,
terminátor transkripce aj.)
hraniční sekvence T-DNA
Nezbytné sekvence:
pro klonování v E. coli
počátek replikace, selekční marker pro bakterie
pro udržování (přenos) do agrobakteria:
počátek replikace (příp. počátek konjug.
přenosu)
pro přenos do rostliny pomocí agrobakteria
hraniční sekvence
pro selekci transgenních buněk
selekční marker pod „rostlinným“ promotorem
Vyštěpení T-DNA
hraniční sekvence T-DNA:
- nedokonalá přímá
repetice 25 bp:
LB a RB = right, left border
- jednovláknový zlom virD2
(D1/D2 dimer)
- vytěsnění ssT-DNA
opravnou replikací
Agrobakteriální infekce - produkty vir genů
indukce exprese vir oblasti
v reakci na fenolickou látku
(VirA,VirG)
štěpení na koncích T-DNA
(VirD1, VirD2)
tvorba póru pro mezibuněčný
přenos (VirB1-11)
ochrana T-DNA řetězce před
degradací (VirE2)
přenos T-DNA do jádra
(VirE2 vazba na rostlinný
transkripční faktor VIP, VirD2
s NLS vazba na importin
KAP-α)
cílená proteolýza proteinů
T-DNA komplexu před
integrací (VirF)
Integrace T-DNA do genomu
- nehomologní rekombinace (illegitimní)
- několik bází mikrohomologie s hraniční sekvencí v místě integrace
- delece, přeuspořádání, filler (vyplňující) sekvence
- zachována zpravidla pravá hraniční oblast (chrání VirD2 protein)
převládající způsob integrace DNA i u přímých metod transformace
Alternativně: vytvoření dsT-DNA, navázání komplexu zajišťujícího ligaci
do dvojvláknového zlomu DNA
Výhody transformace pomocí
agrobaktéria
• poměrně vysoká frekvence stabilní transformace
• menší počet kopií (menší riziko umlčení exprese RNAi)
• možnost přenosu delších úseků DNA (až 45 kbp)
Způsoby transformace pomocí agrobaktéria
• prostá kokultivace agrobaktéria s rostlinným pletivem,
buněčnou kulturou, protoplasty in vitro
• infiltrace (vakuová/tlaková) agrobakteria do pletiva
• inokulace in planta (květenství, listy)
• pro transformaci jednoděložných rostlin a některých
dalších je nutné indukovat vir geny agrobaktéria externě
(acetosyringonem)
Transformace bramboru pomocí agrobaktéria
vstup agrobaktéria
do pletiva v místě
poranění
mikroskopický kalus
agrobaktérium
viditelné kalusy 3-4 týdny
po transformaci
kokultivace
s poraněnými
listy
5-6 týdnů po transformaci
Transformace Arabidopsis thaliana
inokulace in planta (floral dip)
Ponoření květenství s poupaty do suspenze agrobaktéria
Transformace Arabidopsis thaliana
pomocí agrobaktéria
- cílem transformace je zpravidla vajíčko/vaječná
buňka – z něj transformovaná embrya (semena) a
následně rostliny
transformovaná embrya - modře zbarvený produkt
enzymové aktivity glukuronidázy, která byla použita jako
reportérový gen
Agroinfiltrace tabáku
(in planta)
- předběžné testování exprese transgenů
- bez nutnosti práce in vitro
- kotransformace s virovým
supresorem silencingu (p19)
k potlačení PTGS (vnesen GFP gen)
se supresorem
bez
Biolistická (biobalistická) metoda,
transformace (Partickle gun, Gene gun)
• nabalení DNA na zlaté či
wolframové kuličky
• nastřelení na rostlinný orgán,
celé rostliny, buněčnou kulturu,...
sítko
Biolistická metoda
transformace
nastřelování pomocí podtlaku či přetlaku (kombinace)
Biolistická metoda transformace
• univerzální použitelnost bez druhových limitací
• možnost transformace organel (plastidů)
• získání transformovaných rostlin podobné jako
po transformaci agrobaktériem
zlatá partikule (1 m)
chloroplast (5 x 3 m)
Transformace chloroplastů
- biolistickou metodou
- vysoký počet kopií v genomu
-
vysoké hladiny proteinu
není silencing
možnost cílení do určitého místa – homologní rekombinace
plastidový genom je většinou nepřenosný pylem
(pokud se nezačlení do jaderného genomu)
Nevýhody:
- nejsou eukaryotické posttranslační modifikace
- příprava homoplasmických a nechimerických rostlin
je časově náročná
Transformace chloroplastů
Integrace rekombinací
– transgen obklopený chloroplastovými sekvencemi
Postupná selekce homoplasmických buněk a nechimerických rostlin
Agrolistika - varianta biolistiky
- 1. plasmid s geny pro proteiny VirD1 a VirD2
- 2. plasmid s hraničními oblastmi T-DNA
ohraničujícími transgen a selekční marker
- spíše zajímavá kuriozita; nevýhoda - integrace obou
konstruktů (= i konstruktu s vir geny)
- někdy také (nesprávné) označení postupu, kdy se biolistika
použije k poranění buněk před kokultivací s agrobaktériem
Virové vektory
pro transientní exprese proteinů
- episomální - neintegrují se do genomu
(= není poziční efekt)
- vyšší počet kopií
- silná exprese - rychlá akumulace produktu
- přirozené supresory silencingu (x PTGS)
- systémové šíření rostlinou
- často široké hostitelské spektrum
Virové vektory
pro transientní exprese proteinů
původně z Caulimovirů (např. CaMV)
-
-
dsDNA genom - možnost sekvenčně modifikovat
až 106 kopií na buňku, 3-4 týdny systémová infekce
celé rostliny
infekce mechanicky (odřením listu)
ALE malá kapacita – inserty do 500 bp (polyhedrální
kapsida) a polycistronní transkripty (komplikované
úpravy sekvencí)
- nevyužívají se v praxi
Virové vektory
-
výhodnější helikální viry (vláknité, tyčkovité), např. TMV
-
vyšší tolerance vůči větším insertům
-
umožněno objevem RT - příprava cDNA (možnost
sekvenčně modifikovat RNA viry)
-
často se využívá k primární infekci agrobaktérium
nesoucí T-DNA s cDNA viru – virový genom vzniká
transkripcí
Virové vektory:
- substituční (záměna za virový gen např. CP - CaMV)
- inserční (vnesený gen je navíc – např. TMV)
- modulární (vícekomponentové) – rozdělení na více
replikonů (např. TMV, Geminiviry – polyhedrální!)
Přímá metoda transformace protoplastů
- odstranění buněčné stěny (bariéra přenosu DNA do
buňky) – z mesofylových buněk, buněčných kultur
- přenos přes buněčnou membránu podobně jako u
živočišných buněk
- regenerace buněk (vytvoření BS) a následná de novo
regenerace rostlin je problematická (často nemožná)
- integrace většího množství kopií
- nepřesnost integrace (kopie často zkrácené,
přeuspořádané)
Přímá metoda transformace
protoplastů
PEG (polyethylen glykol)
možno kombinovat s elektroporací
elektroporace
podmínky elektroporace (napětí, délka a množství pulsů) závislé na
průměru buňky
lipozómy
umělé lipidové váčky pro přenos DNA
ochrana DNA před degradací DNázami
přenos DNA do protoplastu fúzí či endocytózou
Kotransformace x supertransformace
transformace více vektory zároveň x následně
(u agrobaktéria možné více T-DNA na jednom vektoru)
optimálně každý vektor (T-DNA) nese jiný selekční marker
(u kotransformace není nezbytné)
Inkorporace transgenu
- ssT-DNA: nehomologní rekombinace (mikrohomologní)
- dsDNA: oprava DSB (dvojřetězcový zlom DNA)
• prosté spojení konců DNA (nehomologní rekombinace)
– pouhé spojení zatupených volných konců (často delece, translokace,..)
– dominantní způsob u rostlin (většiny eukaryot)
• homologní rekombinace
– integrace transgenů u kvasinek a plastidů a Physcomitrelly)
– rekombinace mezi dvěma příbuznými sekvencemi
– přesná bezchybná oprava (je-li správný „vzor“!)
Homologní rekombinace – základní funkce
• crossing over při meiozi (homologní chromozómy)
• oprava DNA po poškození (sesterské chromatidy)
Homologní rekombinace
1. extrachromozomální rekombinace rekombinace mezi dvěma
vnášenými molekulami DNA
- holé molekuly DNA i T-DNA komplexy: u rostlin frekvence 1 až 4 %
2. intrachromozomální rekombinace
rekombinace mezi dvěma úseky DNA na tomtéž chromozómu
- u rostlin frekvence 10-5 až 10-6 (není žádoucí)
- pravděpodobně složitější mechanismus než u extrachromozomální
rekombinace (nutné narušení struktury chromatinu)
CHS lokus
3. gene targeting
rekombinace mezi vnášenou DNA
a cílovým místem na chromozómu
(cílení integrace transgenu
u kvasinek, plastidů, apod.)
NPTII
vektor pro gene targeting
oblasti
homologie
zasažený
lokus
upravený CHS lokus
NPTII
Frekvence homologní rekombinace
(při inserci DNA s homologními úseky)
poměr homologní/nehomologní rekombinace
vyšší rostliny 10-3 až 10-6
(vysoká frekvence illegitimní rekombinace je překážkou pro homologní
rekombinaci)
savci
10-2 až 10-5
nižší eukaryota (kvasinky, prvoci, vláknité houby)
nad 10%
mech Physcomitrella patens
90%
- vliv délky homologní sekvence, ploidie, buněčného typu, fáze
buněčného cyklu, …
Stimulace přesné integrace transgenu
homologní rekombinací:
- expresí rekombinačních enzymů (i bakteriálních)
- represe či mutageneze genů účastnících se ilegitimní rekombinace, inhibice
jejich produktů
- vytvořením cílených DSB expresí místně specifické endonukleázy (viz dříve)
(integrace i nehomologní rekombinací)
nehomologní rekombinací
- použitím místně specifických rekombinačních systémů prokaryot a nižších
eukaryot (rekombináza/rozpoznávané cílové místo)
Cre/lox
bakteriofága P1
Flp/frt
Saccharomyces cerevisiae
R/RS
Zygosaccharomyces rouxii
Reparace DSB
Místně specifická inzerce
transgenu (= GM)
- integrace transgenu s homologními
koncovými sekvencemi
(homologní rekombinací)
- integrace nehomologní
rekombinací v místě DSB
Místně specifická mutageneze
- samovolná reparace (často s lokální
delecí)
- DNA templátem řízená mutageneze
HOMOLOGNÍ REKOMBINACE
Cre/loxP
- cílená integrace do místa předchozí inzerce
- specifické vystřižení selekčního markeru: