Transcript 1. PrednáškaLabMedPoslOpr 10965KB Dec 04 2014 02:45:08 PM

Diagnostika autoprotilátok
z pohľadu patológa
J. Rajčáni, M. Benčat, L. Kořínková, O. Ďurinková,
J. Papanová
Patológia s.r.o.
Diagnostické centrum, Martin
Historické východisko*: diagnostika autoprotilátok
na Ústave patologickej anatómie v Hradci Králové
•
•
•
•
Prof. Z. Nožička uverejnil v roku 1991 výsledky svojho 20 ročného bádania v oblasti,
ktorú nazval „histoserógiou“.
Na kryostatových rezoch orgánov pochádzajúcich z pitiev alebo odobratých od králikov
respektíve morčiat, nachádzal pomocou metódy nepriamej imunofluorescencie (IF)
pozitívnu reakciu pri sérach pacientov s niektorými autoimunitnými chorobami.
Výber orgánov a tkanív, ktoré použil ako antigén bol mnohotvárny. Rovnako
impozantné boli aj ním pozorované výsledky: reagoval medzibunkový tmel dlaždicového
epitelu kože a slizníc (ezofagus), parietálne bunky sliznice žalúdka, myocyty priečne
pruhovaného ako aj srdcového svalu, bunky hladkých svalov ako aj väzivo v stene
zažívacieho traktu, koloid ako aj folikulárne bunky štítnej žľazy, epitelové bunky acinov
pankreatu a slinných žliaz ale aj beta-bunky Langerhansových ostrovčekov pankreasu,
epitelové bunky trámcov kôry nadobličky, epitelové bunky trámcov pečene, epitel
tubulov obličiek ale aj bazálna membrána kapilár glomerulov obličiek.
Zistila sa aj existencia tzv. anti-nukleárneho faktora v sérach osôb
s lupus erythematosus (dnes protilátky ANA).
*Nožička, Z. Patologico-anatomic contribution to antibody detection in
immunopathologic diseases. S. Ved Pr Lek Fak Karlovy Univerzity
Hradci Králové, Suppl. 34, 1-169, 1991.
Metódy detekcie (auto)protilátok v sére
Nepriama imunofluorescencia
V oddelení Patológia Martin
sa ELISA nevykonáva
Dodá firma
Vykoná laboratórium
V rezoch alebo v bunkách sa dokazovaný
antigén nachádza buď ako prirodzený produkt,
alebo ako produkt exprimovaný v geneticky
manipulovaných bunkách (majoritný antigén).
Imunoblot
Ag+Ab
Ag
Antigén (Ag) je obvykle
v čistej forme, často ide o
rekombinantný proteín (RAg).
Dodá firma
Vykoná laboratórium
Na prúžku býva viacero čistých antigénov
Náš postup pri diagnostike autoprotilátok
(IF na bunkách a rezoch, IB a biočipy)
I. Nepriama imunofluorescencia (IF) na bunkách Hep-2 (najmä antinukleárne ANA)
Prvá fáza: skríning metódou nepriamej IF (vyradenie negatívnych sér) .
U pozitívnych sér nasleduje druhá fáza: spresnenie nálezu metódou IB
1A. Pri ANA titrácia autoprotilátok (riedenie od 1:100 a vyššie; pri riedení 1:10 určenie triedy).
1B. Na stripoch IB: spresnenie reakčného profilu autoprotilátok - prúžok Euroline ANA
Profile 3; na odlíšenie sklerodermie od systémovej sklerózy sa používa strip Euroline
Systemic Sclerosis Profile.
2. Nepriama IF na krvných náteroch polymorfonukleárnych leukocytov (granulocytov): antineutrofilné ANCA (anti-neutrophilic cytoplasmic antibody): možno odlíšiť cANCA, pANCA
alebo xANCA). Dif. dg: fixácia etanol/formol alebo mikročastice s nadviazaným antigénom,
tzv. biočipy (ANCA Europlus Mosaics Euroimmun)
3. Nátery spermií (ASA, antisperm antibody, nátery spermií, dodáva fy Euroimmun)
4. Na detekciu anti-dsDNA: nátery prvoka Crithidium luciliae
II. Nepriama IF na rezoch orgánov: najprv skríning a potom spresnenie (pomocou IB alebo
tzv. biočipy: mikročastice s nadviazaným antigénom (intrinsic factor, gliadín ap)
1. pri poškodeniach pečene (autoimunitnych hepatitídach, AIH), myokardu (myokarditídy,
kardiomyopatia s dilatáciou, DCM – dilated cardiomyopathy), pri myozitídach, enteritídach
alebo encefalopatiách (paraneoplastický sy ap.). Spresnenie metódou imunoblot.
2. Pri primárnej membránovej nefropatii (PMN) sú antigénom transformované bunky
HEK-293 (expresia receptora podocytov pre fosfolipázu, PLA-2R1)
Klasifikácie obrazov ANA v porovnaní s domácou
nomenklatúrou (Dynex 1. časť)
Taxonómia CANTOR*
Prevecal (Biosystems) Eular**
Nuclear membrane fluorescence
Membraneous nuclear patterns 1.1.Smooth membraneous
(smooth and/or punctate)
1.2. Punctate membraneous
Nucleolasmic fluorescence patterns
Homogeneous nucleoplasmic
2.1. Homogenous nuclear
Speckled patterns:
Speckled patterns:
Large speckled nucleoplasmic 2.2.1. Large speckled
Coarse speckled nucleoplasmic 2.2.2. Coarse speckled
Fine speckled nucleoplasmic
2.2.3. Fine speckled
Pleomorphic speckled (PCNA) 2.2.5. Pleomorphic speckled
(PCNA)
Centromere
2.2.6. Centromere (CENP-B)
Multiple nuclear dots
2.2.7. Multiple nuclear dots
Few nuclear dots (coiled
2.2.8. Coiled body pattern
bodies)
Fine grainy Scl-70-like
2.2.4. Grainy Scl-70-like
Nucleolar fluoresecnce patterns
Homogeneous nucleolar
3.1. Homogenous nucleolar
Clumpy nucleolar
3.2. Clumpy nucleolear
Punctate nucleolar
3.3. Punctate nucleolar
Dynex
2. Homogénní jaderná membrána
3. Póry v jaderné membráne
1. Homogénní jaderný typ
Skvrnité formy:
7. Jaderná s velkými skvrnami
6. Hrubá skvrnitá
5. Jemne zrnitá
20. Ruznorodá zrnitá (anti- PCNA)
4. Skvrnitá (zrnitá) jadérní fluor.
12. Centromérová fluorescencia
10. Četné jaderní tečky
11. Ojedinelé jaderné tečky
9. Zrnitá fl. jádra podobná Scl-70
8. Fluor. jádra podobná Ku
13. Homogénní jadérka
14. Chuchvalcová jadérka
15. Tečková jadérka
*na základe údajov Wiik et al, J Autoimmunity 35, 276-290, 2010 **European League Association of Rheumatology
Medzinárodné klasifikácie obrazov ANA v porovnaní
s domácou nomenklatúrou (Dynex, 2.časť)
Taxonómia CANTOR*
Prevecal Biosystems Eular**
Cytoplasmic fluoresecence pattern
Diffuse cytoplasmic
5.2. Diffuse cytoplasmic
Fine speckled cytoplasmic
5.1. Fine speckled
cytoplasmic
Mitochondrial like
5.3. Mitochondrial like
Lysosomal like
5.4. Lysosomal like
Golgi like
5.5. Golgi like
Vimentin like
5.7. Vimentin like
5.6. Actin like
Contact proteins
Dynex/
26. Difúzní cytoplazmatický obraz
25. Jemne zrnitý cytoplazmatický
obr.
23. Mitochondriální obraz
27. Lysozomální obraz
29. Golgiho aparát
32. Vimentin
30. Aktin
28. Peroxizómy
31. Tropomyosin
33. Cytokeratin
26. Anti-SRP
Spindle apparatus
Centriole (centrosome)
Spindle pole (NuMa) (MSA-1)
Spindle fibre
Midbody (MSA-2)
CENP-F (MSA-3)
4.1. Centriole
4.2. Spindle pole (NuMa)
4.3. Spindle fibre
4.4. Midbody
4.5. CENP-F (MSA-3)
16. Centrioly
18. Póly delícího vreténka
17. Vlákna delícího vreténka
19. Delící telésko (MSA-2)
21. Centroméra F (MSA-3)
22. Fluor. chromatínové deštičky
Zjednodušené vzory* IF obrazov ANA a im
zodpovedajúce antigény detegované metódou IB**
*porovnaj: Rigon A. et al., Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 72B:472–477 (2007)
PORADIE DRUH FLUORESCENCIE
1
Škvrnitá (zrnitá) IF nukleoplazmy
Difúzne homogénna IF
nukleoplazmy
Mnohopočetné bodky
v nukleoplazme
Bodková IF jadierok
Ojedinelé bodky v jadre
2
3
POČET PODIEL
56/127
44,1 %
30/127
23,7 %
22/127
17,3 %
ANTIGÉNY
SSA/Ro, SSB/La,
nRNP/Sm a Sm
dsDNA, históny, Scl-70 ***
(aj iné)
CENP-B, Sp100
4
13/127
10,2 %
RNApoly, fibrilarín
5
6/127
4,7 %
Spolu
127/127 100 %
** z celkového počtu 5518 sér vyšetrených v priebehu roka 2011
(2,3 % sér bolo pozitívnych metódou nepriamej IF)
***zriedkavo až splývajúca inokedy však jemne zrnitá fluorescencia (Scl-like)
1
2
3
4
5
Porovnanie frekvencie ANA pri detekcii
dvoma metódami (IF a IB)
Výsledky testu nepriamej IF v porovnaní s testom imunoblot (IB)
Imunoblot pri pozitívnom IF teste
IF test negatívny
Typ IF
IF test
nerobený
<1:100
pozitívny pozitívny negatívny spolu
1
56
42
3
45
11
2
30
9
7
16
14
3
22
15
2
17
5
4
13
2
3
5
8
5
6
0
3
3
3
Spolu
127
68
18
86
41
Celkom 407
IB test pozitívny pri negatívnom alebo spornom výsledku IF testu
Porovnanie výsledkov testovania ANA oboma metódami pri dvoch súboroch sér
IF test pozitívny
IF test negatívny
IB nerobený IB negatívny IB pozitívny IB pozitívny
127*
41**
18
68
407 (3,2 násobok IF)
42*
4**
8
30***
156 (3,7 násobok IF)
* rovnaký pomer vzhľadom na dĺžku sledovaného obdobia
** pokles relatívneho počtu sér, ktoré neboli vyšetrené testom IB
***relatívny vzostup počtu
Súbor (za
obdobie)
12 mesiacov
4 mesiace
Ochorenia spojené s výskytom
autoprotilátok ANA
Antigén (IB)
SS-A
SS-B
ds-DNA
históny
nukleozómy
PM-Scl
Scl-70
CENP-B
nRNP/Sm
Jo-1
Rib-P-proteín

Ochorenie (syndróm)
Systémový lupus erythematosus (SLE)
Lupus erythematosus novorodencov
Sjogrenov syndróm
Systémový lupus erythematosus (SLE)
Lupus erythematosus novorodencov
Sjogrenov syndróm
Systémový lupus erythematosus (SLE)
Systémový lupus erythematosus (SLE)
Reumatoidná artritída
Systémový lupus erythematosus (SLE)
Systémová skleróza difúzna (SSc)
Polyomyozitída
Systémová skleróza difúzna (SSc, často)
Sklerodermia ohraničená (zriedkavo)
Systémová sklerodemia difúzna (SSc)
Systémová sklerodermia ohraničená (často)
Systémový lupus erythematosus (SLE)
Systémová sklerodermia (SSc)
Polydermatomyozitída
Sharpov syndróm*
Polymyozitída/dermatomyozitída
Systémový lupus erythematosus (SLE)

Frekvencia
ANA
20-60 %
95 %
40-95 %
20-60 %
95 %
40-95 %
40-90 %
50 %
15-50 %
40-70 %
7-10 %
18 %
40-70 %
5-15 %
8%
80-90 %
10-40 %
2-12 %
12-16 %
12-16 %
25-35 %
10 %
*Sharp et al., 1972 (Sharp GC et al.: Am J Med. 52, 148-159, 1979).
Bunkové funkcie jadrových antigénov
reagujúcich s autoprotilátkami ANA
Proteín
SS-A/Ro-60
(60 kDa)
SS-B/La (48 kDa)
Funkcia
Proteín Ro-60 sa spája s molekulami malých RNA rodiny Y,
najmä s Y5 RNA, čím vzniká ribonukleoproteín Ro hY5RNP.
Spája sa s ostatnými molekulami malých RNA rodiny Y (Y1 až
Y4 RNP)
nRNP*/Sm**
Proteín(y) Sm sa spájajú sa s molekulami krátkych U/RNA,
(U1 RNP)
najmä s U1 RNA (tvorí sa U1 RNP)
Scl-70 (95 kDa)
topoizomeráza I
CENP-B
súčasť ukotvenia mikrotubulov (kinetochórov) na
(centromérový)
chromozómy
Sp100
Proteín(y) tzv. jadrových teliesok, ktoré sú antagonistami
ubikvitínov (SUMO, small ubiquitin modifiers).
Sm**
Viaceré polypeptidy, ktoré asociujú s U RNA.
Históny (H2, 3, 4) Bázické proteíny viažuce sa na dsDNA (tvorba nukleozómu)
Histón H1
Bázický proteín s regulačnou funkciou viažuci sa na dsDNA
nukleozómy
Základná štruktúrna jednotka chromatínu (dsDNA
asociovaná s histónmi H2, H3 a H4)
U3 RNP
fibrilarin
* najmenej 3 proteíny asociujú s malou jadrovou (nuclearRNA tiez snRNA)
** sedem proteínov (skratka podľa mena pacienta, Smith antigen)
Základné IF obrazy pri detekcii ASA
(anti-sperm antibody)
A
C
B
A = hroty hlavičiek, akrozómy
B = chvostík a kŕčok hlavičky
C = chvostík a membrána hlavičky
Výsledky prednesené na 9th Int. Congress on
Autoimmunity, Nice, 2014, prednáška č. 753)
Výskyt ASA na základe nášho archívneho
materiálu*
*Výsledky stanovenia ASA v Diagnostickom centre Patológia v Martine v rokoch 2012/2013
Roky 2012 a 2013
18.565
Vyštrené spolu
4.258
Vyšetrené na ASA
281
Pozitívne spolu (podiel testov ASA)
160
Výrazná fluorescencia ASA spolu
Druh fluorescencie
1. Membrána hlavičky
2. Akrozóm hlavičky
3. Chvostík
4. Krčok a prech. oblasť
Samostatne
3%
18 %
13 %
18 %
Podiel zo všetkých
22,9 %
1,52 %
0,86 %
V kombinácii
1+4 (13 %); 1+3+4 (8%)
Podiel z vyšetrených na ASA
6,6 %
3,76 %
spolu
24 %
18 %
3+4 (26%), [1+4 (13 %)], [1+3+4 (8%)] 39 %
[1+3+4 (8%)], [3+4 (26%)]
18 %
Detekcia protilátok ANCA (anti-neutrophil
cytoplasmic antibodies) metódou nepriamej IF
IF je spoľahlivá metóda na detegciu ANCA (Csernok et al., Rheumatology
2002, vol. 41:1313–1317)*.
PR3 (ochorenie WG)
MPO (ochorenie MPA)
Ukážka fluorescencie cANCA (proti proteináze 3, PR3) a pANCA (proti myeloperoxidáze, MPO).
Na spresnenie antigénu reakcie sa v našom laboratóriu sa používa technológia biočipov
(jednotlivé antigény nadviazané na gulôčky syntetického polyméru (ANCA Europlus Mosaics)
*tento záver vyplynul z porovnania ELISA kitov od 11 firiem.
Nález autoprotilátok (ANCA) pri vaskulitídach
a pri kolitíde (intestinal bowel disease)
•
•
•
Reakcia s granulami obsahujúcimi proteinázu 3 (PR3) je
rozložená rovnomerne v cytoplazme (cANCA)
Reakcia s granulami obsahujúcimi myeloperoxidázu (MPO)
sa sústreďuje v okolí membrány laločnatých jadier, najmä v ich
záhyboch (pozorovať po fixácii alkoholom pri pANCA).
Reakcia s inými enzýmami granúl (katepsín G, elastáza alebo
lyzozym) sa vyskytuje pri atypickej xANCA; po fixácii formalínom
býva negatívna.
Druh nálezu
cANCA
Formalin
cytoplazma
Alkohol
cytoplazma
pANCA
distribúcia
granul
atypická
asociácia
antigénu
s membránou
jadra
xANCA
negativna
cytoplasma
Antigén
PR3
Choroba
Wegenerova granulomatóza
(66 %)
MPO
Mikroskopická
polyangiitis (58 %),
Churgov-Straussov syndróm
(EGPO, 58 %)
pri ulceróznej kolitide (50 %),
katepsin G pri (pri UC az 75%)
elastáza
lysozym
Klinické stavy, pri ktorých sa odporúča vyšetriť
protilátky ANCA*
•
•
•
•
•
•
•
Pri vaskulitíde (spojené s nefropatiou)*
Progredujúca glomerulonefitída*
Plúcna fibróza s hemoptýzou
Pri kožnej forme vaskulitidy
Pri sinusitíde alebo otitíde rezistentnej na antibiotiká
Pri episkleritíde, uveitíde alebo vaskulitidach na sietnici
Pri zápalových ochoreniach GIT (diferenciálna diagnostika ulceróznej kolitidy a
Crohnovej choroby)
*Poznámka: odber séra na vyšetrenie autoprotilátok nezaťaží pacienta. Je to
jednoduchý úkon, ktorý sa najlepšie hodí na odber aj pre skríning. Až v prípade
pozitívnej reakcie ANCA (predbežná dg) sa odporúča prikročiť k renálnej biopsii.
Testy: nepriama IF, biočipy, ELISA, chemiluminiscencia
Liečba: pôvodne sa na liečbu používali glukokortikoidy a cyklofosfamid, novšie
Rituximab, mykofenolát mofetil alebo azathioprín.
Autoimunitné vaskulitídy (AAV, časť 1)
•
•
•
•
Wegenerova granulomatóza (granulomatóza s
polyangiitídou, GPA) je nekrotizujúca vaskulitída
malých arteriol a vénul, zahŕňujúca aj kapiláry.
Zmeny nachádzame v obličkách (fokálna
trombotizujúca glomerulonefritída, nekrotizujúca
arteriitída intrarenálnych ciev) a v pľúcach.
Interšticiálny infiltrát obsahuje spočiatku
neutrofily, neskôr najmä lymfocyty, makrofágy a
napokon sa tvoria veľké mnohojadrové bunky
(granulómy).
Zvláštna forma GPA/WG je eozinofilná
granulomatóza s polyangiitidou (EGPA), predtým
Churgov-Straussov sy (CSS).
Pri MPA (mikroskopická polyangiitída)
pozorujeme zápalové zmeny malých ciev
(glomerulonepfritídu). Aktivácia komplementu,
ktorá nastáva alternatívnou dráhou, bola
preukazaná aj úloha T lymfocytov. Vyskytujú sa
protilátky najmä proti myeloperoxidáze
(MPO/pANCA).
Protilátka reagujúca s membránou lyzozómov
(membránovy protein 2, LAMP-2), bola opísaná
ako nový marker renálnej formy AAV (popri
PR3-cANCA a MPO-pANCA).
Histologické zmeny v glomerulách pri AAV
A – bezo zmien; B – srpkovitý infiltrát buniek;
C – čiastočná fibróza glomerulu;
D–
difúzna fibróza glomerulu
Druh poskodenia glomerulov
Frekvencia
srpkovitá fibroza
srpkovity infiltrát
zmiesana srpkovita lezia
difúzna skleroza
intersticiálny infiltrát
intersticiálna fibroza
atrofia tubulov
62 %
17 %
34 %
6%
56 %
56 %
50 %
Autoprotilátky pri ulceróznej kolitíde (UC)
a Crohnovej chorobe
Choroba
Ulcerózna
kolitída
Crohnova
choroba
protilátka
pANCA,
(neutrofilné
leukocyty)
GAB*
antigén
Myeloperoxidáza
(MPO)
poznámka
pANCA plus
ASCAmínus
Pohárikové bunky
Autoprotilátka
PAB (rPAB,
exokrinný
pankreas)
Hlavný zymogénny
Autoprotilátka
proteín v granulách
acinov pankreasu,
glykosylfosfatidyl inosin
(GPI)**
Glykánové protilátky* ASCAplus
(ALCA, ACCA, AMCA, pANCAmínus
anti-L, anti-C**)
Anti-OmpC, anti-Cbir
(flagellin), anti-I2**
ASCA (antiSaccharomyces
cerevisae)
AntiPseudomonas
* goblet cell antibody (IF), ASCA (IF)
**dôkaz testom ELISA (rozličné antigény steny kvasiniek alebo pseudomonád)
Autoprotilátky voči štruktúram glomerulov obličiek
Protilátky môžu byť namierené proti bazálnym membránam kapilárnych
kľučiek (AMeA). Bazálna membrána glomerulov je sama o sebe
komplexný antigén: obsahuje kolagén (typ IV), laminín, vimentin a
proteoglykány.
Do bazálnej membrány
glomerulov sa ukladajú aj
imunokomplexy (produkty
interakcie antigén/protilátka),
ktoré kolujú v plazme.
1. Pri zriedkavom ochorení označovanom ako
Goodpasterov syndróm sa vyskytujú protilátky proti
podjednotke 3 kolagénu IV. Ukladanie týchto
autoprotilátok poškodzujúce aj kapiláry pľúcnych
alveol, takže uvedený syndróm sa prejavuje krvavým
kašľom ako aj prítomnosťou červených krviniek v
moči.
2. Pri idiopatickej membránovej nefropatii (IMN)
respektíve pri primárnej membránovej
glomerulonefritíde (MGN) je antigénom povrchová
molekula membrány podocytov, receptor pre
fosfolipázu A2. Po interakcii s protilátkou vidno
depozity vedúce k zhrubnutiu subepitelovej vrstvy
Bowmanovho puzdra.
3. Preto treba teda odlíšiť autoprotilátky, ktoré sa v
glomerulách zachytili (obsahujú aj komplement), od
protilátok reagujúcich priamo s antigénmi BM.
Autoprotilátky proti PLA2 receptoru podocytov
pri primárnej membránovej nefritíde
•
•
•
•
Protilátky k receptoru PLA2 R1
podocytov tvoria subepitelové depozity
(zhrubnutie BM) a aktivujú
komplement (komplex C5b-9).
Test je založený na interakcii s
rekombinantným receptorom pre PLA
(IF na bunkách HEK-293, ktoré
exprimujú PLA2 R1) alebo test ELISA.
Ich pomocou je možné odlíšiť
nefropatiu asociovanú s ANCA od
primárnej MN respektíve od nefropatie
pri SLE.
V poslednej dobe boli pri PMN zistené
aj protilátky aj proti iným enzýmom
(výlučne testy ELISA) ako sú: superoxid
dismutáza 2 (SOD2), reduktáza aldózy
(AR) alebo neutrálna endopeptidáza
(NEP).
Poznámky ku diferenciálnej diagnostike
autoimunitných hepatitíd
• Pri primárnej biliárnej cirhóze možno detegovať protilátky
k mitochondriám (AMA) metódou nepriamej IF na rezoch
orgánov hlodavcov (pečeň, žalúdok, obličky).
• Na bunkách HEp-2 možno pozorovať cytoplazmovú
fluorescenciu protilátok proti mitochondriám.
• Niektoré ANA (detegované metódou IF alebo IB) môžu byť
smerodajné pre hodnotenie stavu choroby, napríklad AC (anticentromerové protilátky), anti-gp210, anti-PML a anti-Sp100
asociované s tažkým priebehom PBC (imunoblot).
• Anti-F-actin sa považuje za charakteristickú protilátku pri AIH
typ 1. Pri prerušení liečby sa opäť objaví, takže je indikátorom
relapsu (test IB alebo ELISA).
• Protilátky proti asialo-glykoproteinovému receptoru (ASGP-R,
výlučne iba ELISA) sú ďaľším znakom relapsu: tiež sa
odporúčajú na monitorovanie liečby (test ELISA).
Protilátky pri autoimunitnej hepatitíde (AIH)
Choroba protilátka
AIH 1
ASMA (anti-smooth muscle Ab)
ANA (homogénna fl. jadier)
pANCA
ASPG-R2
SLA/LP*
AIH 2
antigén
Aktín, vimentín, dezmín
Históny, nukleozómy
Myeloperoxidáza (MPO)
Asialoglykoproteínový
receptor
proteín asociovaný s tRNA
(UGA supresor)***
LKM1 (liver kidney microsome)
LKM2
LKM3
ASPG-R
Cytochróm p450
2D6/CYP2D6***
Cytochróm P450 2C9***
UDP-glukuronosyltransferáza (UGT1)**
Asialoglykoproteínový
receptor
Formiminotransferáza***
Cytochróm P450 IA2***
E2-dehydrogenáza
poznámka
IF test, IB test
IF test, IB test
IF test, biočipy
aj pri AIH 2
* predtým AIH 3
IF test
Aj pri hepatitíde C
Aj pri hepatitíde D
LC1 (liver cytosol 1)
LM (liver microsome)
PBC
AMA-M2, Sp100 (strip IB)
Protilátky AMA
PSC
Protilátky k intrahepatálnym
Protilátky ABCA,
žlčovodom
pANCA
* soluble liver antigen(s)/liver-pancreas antigen(s) v prípadoch ASMAmínus/ANCAplus
** UDP (uridin-difosfát)-glukuronosyl-transferáza (UGT)
***dôkaz testom ELISA
Autoprotilátky reagujúce s parietálnymi bunkami
sliznice žalúdka (APCA)
•
•
•
•
APCA (anti-parietal cell antibody) reagujú so skupinou buniek
v žliazkach žalúdočnej sliznice označovaných ako parietálne
bunky. Parietálne bunky lemujú krypty žliazok, ich apikálny
pól smeruje dovnútra žliazky, kam sa vylučuje HCl
(hydrochlórová kyselina). Antigénom sú obe podjednotky
H+/K+-ATPázy, ktorá je v podstate protónová pumpa.
Okrem toho parietálne bunky vylučujú glykoproteín, potrebný
pre vstrebávanie vitamínu B12 a iónov vápnika v tenkom
čreve (najnovšie je možný dôkaz protilátok pomocou biočipu).
Pozitívna fluorescencia ABCA je viazaná na oblasť v sliznici,
kým hladká svalovina steny je negatívna (ASMA negat).
Niekedy je potrebné odlíšiť fluorescenciu vláken retikula
(ARA), respektíve protilátky namierené voči endomýziu väziva
(AEmA). Na odlíšenie protilátok AMA sa odporúča súbežné IF
farbenie rezov obličiek, ktoré budú negatívne.
APCA sa vyskytujú pri atrofickej gastritíde typu A
sprevádzajúcej pernicióznu anémiu ( frekvencia až 90%), ale
môžu byť prítomné aj v neskorom období atrofickej gastritídy
typu B navodenej baktériami ako je Helicobacter pylori.
Autoprotilátky pri myozitídach (MSA – myositis
specific antibodies, 1. časť)
•
•
•
•
•
•
•
Idiopatická zápalová myopatia, IIM –idiopatic inflammatory myopathy, a jej juvenilná
forma JIIM – juvenile IIM) vznikajú v dôsledku mikrovaskulitídy spojenej s
aktiváciou komplementu. Pri následnej deštrukcii kapilár sa znižuje prekrvenie
perifascikulárnej oblasti svalu.
Histologický obraz rozličných foriem myozitíd má svoje špecifiká (najmä infiltrát z
lymfocytov T/CD8). Ich spoločným znakom je svalová slabosť a zvýšená hladina
enzýmov svalového pôvodu (napr. kreatinín kináza, CK) v sére.
Dermatomyozitída (DM) ako aj polymyozitída (PM) sú zápaly nejasného pôvodu (nijaké
známe infekčné agens): zmeny vo svaloch sú kombinované s kožnými zmenami (DM)
alebo sa vyskytujú bez nich (PM). Niekedy pozorovať len kožné zmeny bez poškodenia
svalu (klinicky: nie svalová forma, C-ADM, clinically amyopathic DM).
Pri PM sú charakteristické autoprotilátky, namierené proti tRNA syntázam
(najčastejšie Jo-1, menej často aj iné syntázy ako PL-1, PL-7, PL-12, EJ, OJ, JS a KS,
test IB).
Nekrotizujúca myopatia môže byť vyvolaná vírusmi alebo toxickými vplyvmi
pri následnej aktivácii makrofágov. Typické sú autoprotilátky proti časticiam
rozpoznávajúcim signálne peptidy (SRP, signal recognizing peptide), ktoré sú súčasťou
endoplazmového retikula. Uvedené protilátky môžu vyvolať nekrózu svalových vláken
najmä v prítomnosti komplementu (zložky C3 a C5).
Sporadická myozitída s inklúznymi telieskami je charakterizovaná vakuolizáciou
svalových buniek a prítomnosťou nerozpustného beta-amyloidu (zloženého
z nesprávne konfigurovaných polypeptidov).
C-ADM treba odlišiť od Sharpovho syndrómu (mixed connective tissue disease), pri
ktorom sa tvoria protilátky voči niektorým antigénom bunkového jadra respektíve
jadierka (PM-Scl, U1 RNP/Sm, Ku), zriedka aj protilátky proti antigénom, ktoré sú
typické pre SLE (Ro-52/kDa, Ro-60/kDa/SS-A alebo La/48kDa/SS-B.
Autoprotilátky pri myozitídach (časť 2)
Choroba
Polymyozitída (PM)
Dermatomyositis (DM)
a jej zvláštne formy:
C-ADM
ILD
Nekrotizujúca
myozitída
Autoprotilátka
Anti-Jo-1(IB)*
Antigén
Hystidyl tRNA syntáza
(HRS)*
Anti MDA-5/
MDA5/IFIH1 antigén
anti-CADM-140** receptor pre RNA
vírusy pri indukcii
interferónu
Anti-Mi-2
DNA viažuca helikáza
(regulátor
transkripcie)
Anti-TIF1
Intermediárny
kofaktor transkripcie
Anti-SAE
Malý ubikvitín
modulátor (SUMO)
Anti-SRP
Proteín ER
rozpoznávajúci
signálny peptid
Poznámka
Interšticiálna fibróza
pľúc (test IB)
Pri DM 30 %
Ťažká fibróza pľúc
(ILD, interstitial lung
disease, test ELISA)**
Kožné lézie
(test ELISA)**
(test ELISA)**
Kožné zmeny
(test ELISA)**
Degeneratívne
zmeny svalov
* ako aj protilátky k viacerým alternatívnym tRNA syntázam; štiepne produkty
sa viažu na CCR5 chemokíny a aktivujú Toll-like receptory (TLR4), čím indukujú
zápalové zmeny.
** C-ADM – clinically amyopathic DM (DM s minimálnymi klinickými príznakmi od
svalov) je antigénom proteín o m.h. 140 kDA z rodiny receptorov pre vírusovú RNA
(pravdepodobnosť výskytu 35 % až 70 %); MDA-5 : melanoma associated gene 5
(melanómom asociovaný gén 5)
Myasthenia gravis (MG) ako autoimunitné ochorenie
(testy ELISA)
•
•
•
•
•
Pri MG možno s vysokou pravdepodobnosťou (okolo 85 %) identifikovať
autoprotilátky k nikotínovému receptoru pre acetylcholín (AChR,
acetylcholin receptor) na nervovo svalovej platničke, kde dochádza k
prevodu vzruchu z nervu na sval.
S nižšou pravdepodobnosťou (okolo 50 %) sa vyskytujú protilátky
k pridruženému enzýmu tyrozín kináze; reakcia je špecifická pre svalové
tkanivo (MuSK, muscle specific thyrosine kinase).
Ďalším antigénom nervovo svalovej platničky je proteínový receptor
pridružený k lipoproteínu (LRPR4, lipoprotein related protein receptor
4), proti ktorému sa vytvoria samostatné autoprotilátky.
V patogenéze MG hrá dôležitú úlohu porucha eliminácie
autoagresivnych T a B buniek, ktorá je viazaná na týmus. Selekcia
lymfocytov rozpoznávajúcich antigény self/non-self nastáva tesne pred
narodením a pokračuje aj v prvých mesiacoch postnatálneho života.
Tymóm sa vyskytuje asi pri 20% prípadov MG
Myokarditída a tvorba autoprotilátok (1)
•
Príčinou zápalu srdcového svalu môžu byť rozličné infekčné agensy alebo toxické látky.
Známy pôvodca myokarditídy je virus Coxsackie B3 (CVB3). Zápalove ochorenie
srdcového svalu sa môže skomplikovať autoimunitným procesom smerujúcim do
kardiomyopatie s dilatáciou (dilated cardiomyopathy, DCM).
Infekcia CVB3
•
•
•
•
Myokarditída
Dilatovaná kardiomyopatia (DCM)
Infekciu CVB3 je možné experimentálne navodiť u inbredných myší (A/CA alebo
A/SW), u ktorých v patogenéze zohráva dôležitú úlohu proteázou aktivovaný receptor 2
(PAR-2) potláčajúci prirodzenú imunitnú odpoveď.
V chronickom štádiu sa tvoria protilátky k alfa podjednotke myozínu (poškodzuje
svalovinu predsiene) ako aj k jej beta podjednotke (poškodenie svaloviny komôr ako aj
priečne pruhovaných svalov).
Známkou rozkladu vláken myozínu je uvoľnenie troponínov (troponín I, cTnI), ktorých
hladina v sére predstavuje dôležitý indikátor prognózy.
Pacienti s dilatovanou kardiomyopatiou (DCM) vykazujú protilátky najmä k alpha
podjednotke myozínu (presnejšie k jeho S2 fragmentu)* ako aj ku troponínu (cTn).
Polypeptid cTn I medzi aa. 105-122 obsahuje epitop, ktorý indukuje v srdcovom svale
tvorbu cytokínov, následné zápalové zmeny a napokon fibrózu (rozsah je priamo úmerný
zlyhaniu srdca).
*V skorom štádiu myokarditídy sa vyskytujú protilátky k málo definovanému antigénu
sarkolemmy, proti mitochondriovým antigénom a ku beta-adrenergnému muskarínovému
receptoru myocytov (aktivácia signálnej drahy cAMP-dependentnej proteinkinázy A).
Myokarditída a tvorba autoprotilátok (časť 2)
Protilátky voči myolemme
(sarkolemme).
V skorom štádiu
myokarditídy sa
vyskytujú protilátky proti
sarkolemme, ktoré sa
niekedy dajú dokázať aj u
zdravých príbuzných
pacienta.
Protilátky proti
myofibrilám
(myozín)
Protiláka
myokarditída Dilatovaná kardiomyopatia
Proti sarkolemme
47 %
10 %
Proti myofibrilám
31 %
41 %
Proti aktínu
0%
70 %
Proti hsp60**
0%
80 %
Proti troponínu I
0%
55 %
Proti alpha myozínu
17 %
20 %
Proti mitochondriám E2
100 %
60 %
**heat shock protein, bielkoviny teplotného soku
kontrola
18* %
3%
0%
0%
0%
2%
0%
Metóda dôkazu
IF, rezy
IF, rezy
IB stripy
IB stripy
IB stripy
ELISA
ELISA
Autoantigény kože a slizníc s dlaždicovým
epitelom (ABMA/ICA)
Protilátky k bazálnej membráne dlaždicového epitelu
(ABMA, anti-basement membrane antibody) ako aj
protilátky k medzibunkovej hmote (ICA, intercellular
substance antibody) sa vyskytujú pri 3 ochoreniach kože,
menovite pri pemhigus vulgaris (PV), pemphigus foliaceus
(PF) a pri bulóznej forme pemfigoidu (BF) respektíve pri
ochorení sliznice ústnej dutiny (slizničný membránový
pemfigoid, OMMP, oral mucosa MP)
•
•
•
•
Pri BF po aplikácii séra pacienta na rezy kože pozorujeme metódou
nepriamej IF zrnitú reakciu nepravidelnej hrúbky v tesnej blízkosti
bazálnej membrány (ABMA).
Pri PV sérum reaguje s antigénom medzibunkovej hmoty spinálnych
buniek označovaným ako desmoglein 3 (Dsg3), takže vidno difúznu
fluorescenciu medzi epitelového tmelu, ktorá nie je obmedzená len na
kožu, lebo ju možno pozorovať aj na slizniciach s nerohovatejúcim
dlaždicovým epitelom (napr. ezofagus).
Pri PF je antigénom dezmogleín 1 (Dsg1), pričom sa znázorní
medzibunkový tmel iba v koži.
Pri OMMP je antigénom zložka bazálnej membrány označovaná ako
BP180. Protilátky sú v sére a v slinách.
Autoprotilátky proti štruktúram mozgu
•
•
•
•
•
Pre IF test sa ako antigén hodia najmä rezy z mozočka, v ktorých sa
dajú ľahko identifikovať veľké neuróny (Purkyněho bunky) ako aj
malé nervové bunky (v stratum granulosum).
Protilátky k antigénu Yo znázornia cytoplazmu Purkyněho buniek,
kým cytoplazma malých neurónov mozočkovej kôry je negatívna.
Protilátka anti-Hu znázorní nielen jadrá Purkyněho buniek, ale aj
jadrá malých neurónov mozočkovej kôry. Okrem toho sa znázornia
ojedinelé neuróny intramurálnych vegetatívnych ganglií (plexus
myentericus) v stene tenkého čreva.
Rezy mozočka (nervové bunky) reagujú aj so sérami pacientov
obsahujúcimi autoprotilátky voči enzýmu GAD (dekarboxyláza
glutámovej kyseliny), ktorý je prítomný v neurónoch stratum
granulosum ako aj v gliových bunkách (stratum moleculare) kôry
mozočka.
V IF teste možno identifikovať aj protilátky voči bázickej bielkovine
myelínu (BMA). Ak antigénom sú tukové zložky (gangliozidy GM1-3,
GD1a, GD1b), ktoré prítomné v pošvách obaľujúcich axóny, možno
príslušné protilátky identifikovať v teste IB. V súčasnosti sú k
dispozícii prúžky (stripy) s antigénmi Hu, Ri a Yo (doplnenie IF
testu), ako aj s antigénmi ako sú amfyzín, titín, akvaporín a iné.
Autoprotilátky k bunkám endokrinných žliaz (časť I)
Štítna žľaza
•
•
•
•
•
•
•
Autoprotilátky môžu reagovať s obsahom folikulov štítnej žľazy (koloid) alebo
s ich epitelovou výstelkou.
Súčasťou koloidu je tyreoblobulín (Tg), voči ktorému sa tvoria protilátky (antiTg).
Tyroidálna peroxidáza (TPO) je základný enzým pre syntézu tyroxínu, k čomu
dochádza v epiteli folikulov (tu bol pôvodné opísaný tzv. mikrozómový antigén).
Protilátka LATS (long acting thyroid stimulator) inhibuje receptor pre TSH
Beta-bunky Langerhansových ostrovčekov pankreasu
Protilátky k beta-bunkám Langerhansových ostrovčekov pankreasu (AICA,
anti Islet Cell Antibody) možno orientačne detegovať na rezoch pankreasu
krysy (v granulách cytoplazmy beta-buniek) metódou nepriamej IF.
Terčové antigény ako sú inzulín (AAI, anti-insulin autoantibody),
dekarboxyláza glutamovej kyseliny (AGAD, anti-glutamic acid decarboxylase
antibody), podjednotka tyrozín fosfatázy asociujúcej s inzulínom (AIA2, antiinsulin antibody 2) a katióny transportujúca molekula obsahujúca zinok
(AZnT8); sa jednotlivo dokazujú v teste ELISA.
Protilátky AICA znížujú aktivitu beta-buniek ako aj ich počet. Spôsobujú
ochorenie označované ako diabetes I. typu, alebo tiež diabetes mladistvých.
Pri indukcii AICA zohráva významnú úlohu infekcia enterovírusmi, najmä
vírusom Coxsackie B4 (jeden z vírusom kódovaných proteínov má homológnu
sekvenciu k peptidu/doméne enzýmu GAD65).
Autoprotilátky k bunkám endokrinných žliaz (časť II).
Vaječník(y).
Autoimunitné poškodenie vaječníkov (oophoritis) sa vyznačuje selektívnou deštrukciou
buniek theca interna primárnych folikulov, ktorých granulárne bunky neprodukujú
dostatok estradiolu (prvotné zlyhanie vaječníkov, primary ovarian failure, POF).
Antigénom pre autoprotilátky sú enzýmy syntetizujúce steroidy (cytochrómy z rodiny
P450, ako napr. P450c17 (alpha-hydroxyláza, alebo P450scc (štiepenie postranných
reťazcov). Súhrnne sa označujú ako SCA (steroid cell antibodies).
Sérum pri POF môže reagovať aj s interšticiálnymi bunkami ovária pochádzajúcimi
z theca folliculi externa antrálnych folikulov, ktoré majú receptory pre luteotrofný
hormón. V niektorých prípadoch sa vyskytujú protilátky reagujúce s bunkami zona
granulosa alebo aj s ovalbumínom v tekutine vyplňujúcej antrálne folikuly.
Záver: protilátky voči antigénom vaječníkov sú najmä anti-SCA ale aj iné. Terčom sa
stávajú aj antigény ZP (zona pellucida) na povrchu oocytu.
Nadobličky
•
•
Protilátky k bunkám kôry nadobličiek (adrenal cortex antibodies, AACA), sú
namierené proti enzýmom syntetizujúcim 11-deoxykortikosterón (napr. 21hydroxyláza), ale aj proti P450scc (protilátky anti-SCA uvedené zhora).
Pri autoimunitnej forme Addisonovej choroby sú prítomné skrížene reagujúce
autoprotilátky proti ováriám a placente, takže takéto ochorenie sa označuje ako
polyglandulárny autoimunitný syndróm (APS).
Autoprotilátky, ktoré sa vyšetrujú v Diagnostickom
centre Patológia s.r.o., Alphamedical a.s., Martin
(prehľadná rekapitulácia)
Autoprotilátky proti bunkám
•
•
•
•
ANA – anti-nuclear antibodies, Hep-2 bunky
Proti antigénom cytoplazmy a mitotickým
štrukúram: obvykle súčasť ANA.
ANCA - anti-neutrophil cytoplasm antibodies
(proti granulocytom): cANCA, pANCA alebo
xANCA)
ASA – anti-sperm antibodies (proti antigénom
spermií)
Proti tkanivám a orgánom
•
•
•
•
•
•
Imunoblot (IB) (antigény sú purifikované)
•
strip Euroline Systemic sclerosis profile;
strip Euroline ANA profile 3
•
strip Euroline antigenic profile 2 (mozog)
strip Euroline Profile Autoimmune Liver •
Disease (pečeň)
•
strip Euroline Myositis Profile 3 (svaly)
Biočipy (antigény sú purifikované):
•
pri ANCA Europlus Mosaics,
•
pri celiakii gliadin (Europlus GAF-3X),
dermatologická mozaika (dezmogleín 1 a 3,
•
antigény BP180 a BP230)
•
Pečeň (ABBA, ASMA, ANA, ANCA; nadväzuje IB strip:
AMA-M2, M2-3E/BPO, Sp100, PML, gp210, LKM-1, LC1,
SLA/LP, Ro52)
Obličky: glomeruly (BM), bunky kanálikov – (LKM
liver/kidney microsomes), bunky HEK-293 (PLA-2R1)
Žalúdok – proti parietálnym bunkám žliazok (APCA),
stanovenie intrinsic faktoru (biočip)
Mozoček: neróny (Hu, Yo, GAD), myelín (gangliozidy),
IB: Amphiphysin, CV2, MA2/TA, Ri, Yo a Hu
Ezofagus a koža: (dezmogelíny, BP180 a BP230, biočip)
Štítna žľaza: receptory TSH, mikrozómy (bunky folikov)
alebo tyreoglobulín-(anti-TAb – koloid folikulov)
Hladký sval: anti-aktínové protilátky, ASMA – anti-smooth
muscle antibody
Priečne pruhovaný (kostrový) sval, IB pri dif. dg. myozitíd:
Mi-2, Ku, PM-Scl100, PM-Scl75, SRP, Jo-1, PL-7, PL-12,
OJ, EJ, Ro-52 .
Myokard: svalové vlákna (myozín, troponín),
sarkolemma – myolemma).
Pankreas: beta-bunky Langerhansovýcb ostrovčekov, bunky
žliazok (zymogénne granulá acinov)
Tenké črevo – endomýzium, antiretikulárne protilátky
(ARA), ANCA, ASCA (pri dif. UC a Crohnovej choroby)
Koža a ezofagus (bazálna membrána epidermy,
medzibunkový tmel)
Ováriá (interštícium, tekálne bunky folikulov)
Kôra nadobličiek (rezy, SCA)
Súhrn
Autoprotilátky v sérach (plazme) pacientov možno zistiť:
• Metódou nepriamej IF (antigénom sú nátery buniek, bunkové
kultúry, kultúry buniek po transfekcii, rezy orgánov): odčítanie
reakcie sa deje vo fluorescenčnom mikroskope.
• Metódou imunoblot (stripy/prúžky), kde antigénom sú proteíny
zachytené na membráne, druhá protilátka je označená enzýmom,
reakcia sa odčítava voľným okom alebo lupou.
• Metódou biočipov (mikročastice) s nadviazaným antigénom,
reakcia sa odčítava sa vo fluorescenčnom mikroskope.
• V poslednej dobe vyšetrovanie autoprotilátok prestáva byť
výlučnou doménou reumatológie respektíve imunológie. Záujem
majú aj lekári odborov ako je gynekológia, endokrinológia,
dermatológia, neurológia respektíve onkológia.
• Je preto žiaduce vykonať komplexné vyhodnotenie navzájom
súvisiacich špecializovaných vyšetrení.
• Nevyhnutnou sa javí aj spolupráca laboratórií imunológie,
biochémie, patológie, molekulovej biológie, mikrobiológie ap.
Porovnanie výsledkov IB a ELISA (z praxe virológa,
na príklade zhodných antigénov vírusu EB)
•
positive rates
ELISA results
100%
80%
60%
40%
20%
0%
VCA
EA-D
IB
day 8
day 28
•
day 98
intervals post-infection
per cent
IB positive rate
group A
group B
total
100,0%
80,0%
60,0%
40,0%
20,0%
0,0%
•
•
p18
p23
BZLF1
p138
p54
Príklad ukazuje výsledky
stanovenia protilátok proti
5 antigénom vírusu EBV (pri
metóde IB) alebo 2 antigénom
EBV (pri metóde ELISA). Dva
antigény sa zhodujú (šípky).
EA-D je protilátka ku skorej
bielkovine p54, ktorá je
kofaktorom DNA polymerázy a
je indukovaná vírusom (v blote
okrajové stĺpčeky vpravo).
VCA je protilátka ku
kapsidovému proteínu, ktorý je
súčasťou častice (v blote
stĺpčeky druhé zľava).
ELISA býva mierne citlivejšia
ako IB; na strane druhej IB
ukazuje protilátky k viacerým
antigénom naraz.
antigens detected
Poznámka: v laboratóriu Patológia a.s. Martin sa test ELISA nevykonáva.
Autoimunitné vaskulitídy (AAV, časť 2)
•
•
•
•
Pri poškodeniach malých ciev, ako sú mikroskopická polyangiitída (MPA) a
Wegenerova granulomatóza (WG/GPA, tzv. granulomatóza s polyangiitídou)
dochádza aj k tvorbe autoprotilátok proti neutrofilným leukocytom.
Etiológia AAV (ANCA-associated vasculitis) je multifaktoriálna,
pravdepodobná je genetická predispozícia (okrem iného vyššia expresia
Toll-like receptora 4 na povrchu buniek endotelu) ako aj zlyhanie inhibičnej
funkcie Treg buniek.
Protilátky anti-PR3/cANCA (enzým proteáza 3) sú síce dôležitým
diagnostickým znakom WG/GPA, ich úloha v patogenéze však nie je jasná.
Protilátka PR-3/cANCA sa viaže na granulocyty a makrofágy cez Fc-receptor,
čo v nich zvyšuje syntézu PR-3 a vyvoláva následnú degranuláciu.
Aktivované fagocyty priľnú na endotel (cez E-kadherín). Základom WG/GPA
je teda poškodenie endotelu, jeho odlučovanie od bazálnej membrány a
následná trombóza (fibrín, agregácia doštičiek). V neskoršom štádiu dochádza
k tvorbe protilátok aj proti cievnemu endotelu.