Transcript s predmetu Bioanalytika

Analýza látok v biologických systémoch
Elektromigračné separačné metódy
PharmDr. Katarína Maráková, PhD.
Katedra farmaceutickej analýzy a nukleárnej farmácie, Farmaceutická fakulta UK,
Bratislava
Agillent technologies, High performance capillary electrophoresis
Mikuš a Maráková, Hyphenated electrophoretic techniques in advanced analysis
Mikuš, Chiral capillary electrophoresis in current pharmaceutical and biomediical analysis
B. Králová a kol., Bioanalytické metódy, Vysoká škola chemicko-technologická v Prahe
O. Križanová, Vybrané biochemické a molekulárne-biologické metódy v lekárskom výskume a medicínskej diagnostike
Princíp
pohyb nabitých častíc v elektrickom poli k opačne nabitým elektródam
Tiselius - 1937 oddelil zmes bielkovín (Nobelova cena)


n=mE
n = rýchlosť iónu, m = elektroforetická pohyblivosť, E = intenzita elektrického poľa (napätie na dĺžku kapiláry –
V/cm)
Pohyblivosť - výsledkom rovnováhy medzi silou pôsobiacou na ióny v elektrickom poli (Fe) a
silou vnútorného trenia (Ff)

Fe = qE
Ff = -6pnr
m = q/ 6pr
q = náboj,  = viskozita, r = polomer iónu, n = rýchlosť iónu
Efektívna pohyblivosť (nameraná pohyblivosť)


obvykle nižšia než teoretická elektroforetická pohyblivosť

závislá na pH a použitom elektrolytovom systéme
meff = ma
Plošná elektroforéza
Plošné usporiadanie
1. Elektroforéza na papieri
2. Gélová elektroforéza
Nevýhody:


Dlhý čas analýzy

Nízka separačná účinnosť

Problematická detekcia a automatizácia
Gélová elektroforéza

Patrí medzi najúčinnejšie metódy analýzy proteínov a nukleových kyselín

Delenie v elektrickom poli podľa veľkosti náboja, Mr a tvaru

Pohyblivosť nabitej častice v géli sa dá zjednodušene vyjadriť
m = p/t.U
p – vzdialenosť (cm), t- čas (s), U- napätie (V)

celulóza, agaróza, polyakrylamid
A) Elektroforéza v agarózovom géli
•
Detekcia produktov PCR
•
k identifikácii, separácii a purifikácii fragmentov DNA získaných pomocou PCR
•
Fragmenty DNA sú delené v elektrickom poli v závislosti na ich veľkosti
•
Touto metódou môže byť detegovaný až 1 ng DNA

Pre delenie malých fragmentov DNA možno použiť tiež polyakrylamidový gel alebo
špeciálne pripravenú agarózu

Elektroforézou v polyakrylamidovom géli za denaturujúcich podmienok možno
pripraviť jednoreťazcové molekuly DNA
A) Elektroforéza v agarózovom géli
Detekcia produktov PCR
1.
príprava gélu vhodnej hustoty (zaistené optimálne rozdelenie očakávaných fragmentov
DNA)
2.
vzorky DNA sú aplikované do jamiek v géli a delené za vhodného napätia pre
elektroforézu po dobu, ktorá zodpovedá optimálnej separácii
Rozdelenie možno monitorovať na základe rozdelenia prúžkov farieb o známych
molekulových hmotnostiach (brómfenolová modrá)
3.
Gél je farbený ethidium bromidom (interkalačné činidlo - viaže sa medzi vlákna DNA a
červeno-oranžovo fluoreskuje po ožiarení UV svetlom o vlnovej dĺžke 260-360 nm)
Komplex DNA a ethidium bromid je vizualizovaný osvetlením pomocou zdroja UV žiarenia
tzv. transluminátoru (z intenzity pruhu možno odhadnúť koncentráciu DNA)
B) Polyakrylamidová gélová elektroforéza
(PAGE)

Polyakrylamid
o
kontrolovanie veľkosti pórov
o
homogénny/gradientový

najčastejšie používaná metóda

Nosič sa spolu so vzorkou umiestnia medzi dve elektródy,
medzi ktorými prechádza jednosmerný prúd

horizontálna

Vertikálna
Príprava vzorky



Rozpustenie zmesi v roztoku s nižšou iónovou silou ako má elektrolyt (vyššia koncentrácia solí negatívne ovplyvňuje
ich separáciu – nepravidelné a difúzne škvrny)

Prídavok SDS – rovnaký náboj analytov, rozrušenie trojrozmernej štruktúry - približne rovnaký tvar

Prídavok glycerínu (ťažší ako voda – zabraňuje vyplaveniu vzoriek z nanášacieho kanáliku)

Brómfenolová modrá – ukazuje ako ďaleko sa vzorka v géli dostala (je ľahká a putuje ako prvá)
Dôležité je nadávkované množstvo vzorky (nad 100 mg – prekračuje deliaci rozsah gélu)
B) PAGE v gradientovom géli

s rastúcou vzdialenosťou od štartu rastie koncentrácia polyakrylamidu
(zmenšuje sa veľkosť pórov)

Vzdialenosť, ktorú sú molekuly schopné prejsť potom závisí na ich
veľkosti - hlavný separačný faktor

Výhody:
◦ Lepšie zaostrenie jednotlivých zón obsahujúcich molekuly rovnakej
veľkosti
◦ Lepšia separačná schopnosť
◦ širší rozsah proteínov
B) PAGE s dodecylsulfátom sodným (SDSPAGE)

SDS sa viaže na peptidové väzby a alkalické bočné reťazce proteínov –
všetky molekuly budú mať rovnaký záporný povrchový náboj

Delenie podľa veľkosti molekúl

Pohyblivosť komplexu SDS-bielkovina v polyakrylamidovom géli je
priamo úmerná logaritmu molekulovej hmotnosti príslušnej bielkoviny

naviazaním SDS na bielkovinu veľmi často dochádza k strate biologickej
aktivity
C) Afinitná elektroforéza

Gél so zapolymerizovaným alebo naviazaným afinitným ligandom (farebný ligand,
inhibítor enzýmu,...)

Analýza zmesi, v ktorej sa nachádza zlúčenina so špecificitou voči ligandu

táto molekula sa buď úplne zastaví (ak je dostatočné množstvo ligandu) alebo
bude migrovať pomalšie ako molekuly, ktoré afinitu k ligandu nemajú (rýchlosť
zodpovedá ich elektroforetickému pohybu a veľkosti molekuly)

zo stupňa oneskorenia a koncentrácie imobilizovaného ligandu možno stanoviť
disociačnú konštantu komplexu biomolekula-ligand

Porovnanie s kontrolným gélom bez imobilizovaného ligandu

zvláštny prípad – elektroimunodifúzia (ligandom je PL)
Dvojrozmerná elektroforéza

analýza komplikovaných vzoriek (proteíny z buniek, tkanív, telesných tekutín)

zlepšenie separácie

dve principiálne odlišné elektroforetické metódy (IEF a SDS-PAGE) v dvoch na seba
kolmých smeroch

Detekcia markerov ochorení, monitorovanie účinnosti terapie, výskum liečiv,
onkologický výskum
Uvoľnenie separovaných látok z gélovej
matrice

difúzia
- žiadne špeciálne zariadenia
- časť gélu s požadovanou zónou sa vystrihne a vloží do
nádobky s pufrom
- za intenzívneho miešania sa látka desorbuje z gélu a
uvoľňuje do pufru
- neumožňuje úplnú desorbciu látky z gélu
- pre polyakrylamid sa nehodí

Elektroelúcia
- využíva jednoduchý elektroforetický pohyb

Elektroforetická desorpcia
- princíp IEF
- výhoda je, že látky sú pri nej koncentrované v ostrých
zónach
Vizualizácia separovaných látok

adsorpcia farbiva – amidočerň, metylénová modrá

vyredukovaie striebra z amoniakálneho roztoku (50x citlivejšie)

farbivo fluoreskamin, ktorý po reakcii s primárnymi amínmi dáva produkt s
intenzívnou fluorescenciou

Autorádiografia - mikromnožstvá bielkovín

Glykoproteíny – fuchsinové činidlo

enzýmové reakcie za vzniku farebných produktov alebo straty farby (nie pre SDSPAGE)

DNA – interkalačné činidlá (ethidium bromid, proflavin) – viažu sa interkaláciou na
závitnicu DNA a UV intenzívne fluoreskujú
Imunochemické metódy založené na
princípe elektroforézy
Metódy jednoduchej difúzie (kvantitatívne,
semikvantitatívne)

Pohybuje sa len jedna zložka (AG/PL), druhá je
rovnomerne rozptýlená v géli
a.
Elektroimunodifúzia
b.
Dvojrozmerná imunoelektroforéza
A) Elektroimunodifúzia

Jednoduchá radiálna imunodifúzia kombinovaná s elektroforézou, ktorá urýchli
difúziu antigénu a tým tvorbu precipitátu
B) Dvojrozmerná imunoelektroforéza

kombinácia imunoelektroforézy s elektroimunodifúznou technikou

zmes antigénov sa najskôr rozdelí elektroforeticky v géli

vyreže sa pruh gélu prenesie sa na okraj sklenenej dosky s agarózovým gélom so
zmesou protilátok (polyvalentné antisérum)

v kolmom smere ďalšia elektroforéza
Metódy dvojitej difúzie (kvalitatívne,
semikvantitatívne)

Obe zložky imunochemickej reakcie sa pohybujú
oproti sebe
a.
Imunoelektroforéza
b.
Protismerná imunoelektroforéza
A) Imunoelektroforéza





prvá etapa – rozdelí zmes antigénov v géli elektroforeticky podľa náboja
druhá etapa – nanesie sa pozdĺž rozdelených antigénov polyvalentné
antisérum (zmes protilátok)
následne prebehne dvojitá imunodifúzia
súčasná detekcia viacerých antigénov
dlhý čas analýzy (2 dni)
B) Protismerná imunoelektroforéza

obmena dvojitej difúzie

pohyb molekúl antigénu a protilátok je urýchlovaný jednosmerným elektrickým
prúdom
Imunoblottovacie metódy

Prenos molekúl (difúziou/pomocou jednosmerného prúdu) z mobilnej fázy v géli
do pevnej fázy (membrána)

Po prenesení – detekcia



Farebné reakcie

Imunodetekcia AG vo vzorke po elektroforetickom rozdelení v géli
Elektroforetické delenie v géli

otlačok elektrochromatogramu na vhodnú matricu (nitrocelulózová membrána) a to pomocou
jednosmerného prúdu

voľné miesta na matrici sa vysýtia inertnou bielkovinou

vlastná imunodetekcia (matrica sa ponorí do roztoku špecifických PL, opláchne a miesta s naviazanými
PL sa preukážu napr. pomocou druhej PL značenej enzýmom)

vyfarbenie príslušných zón umožní enzýmová reakcia
Výhody: ľahké prevedenie, vysoká citlivosť a špecificita, možnosť detegovať jediný
AG v zložitých zmesiach
Blotting – DNA, RNA
- - Southern blotting, elektroblotting
– DNA, využíva rádioaktívne
značenú RNA
- Northern blotting - RNA
Blotting - proteíny
Western blotting (imunoblotting)

Prenos proteínov rozdelených na
PAGE na membránu

Nitrocelulózové membrány

Prenos nikdy nie je 100%

Imunochemická detekcia na
membráne
◦ Výber vhodného typu PL (značené 125I alebo
enzýmami)
◦ identifikácia príslušnej bielkoviny - finálna
enzýmová reakcia (z chromogénneho
substrátu sa uvoľňuje farebná látka)
◦ Detekcia – chemiluminiscencia, fluorescencia
Kapilárna elektroforéza (CE)
Prečo kapiláry?
1967 - Hjérten
Kremenné kapiláry – 25-100 mm

Možnosť použitia vyššieho napätia (10-30 kV, E = 100-500 V/cm)

kratší čas analýzy

vyššia separačná účinnosť (N >105-106) a rozlíšenie

menšia difúzia zón

Malé množstvo vzorky (1-50 nL)

On-line detekcia

Automatizácia

Vyššia selektivita (rôzne separačné módy)

Cena

Flexibilita

Horšia reprodukovateľnosť (EOF)

Nízka dávkovacia kapacita vzorky

Nižšia citlivosť pri UV detekcii (iná detekcia, predúprava vzorky)
Kapilárna elektroforéza (CE)
Komplementárna analýza k HPLC

◦
jednoduchší vývoj metódy
◦
menšie množstvo organického odpadu
◦
kompatibilita s biologickými vzorkami

efektívna dĺžka kapiláry - vzdialenosť
anódového konca kapiláry (štart) po
detektor

migračný čas - čas, ktorý potrebuje ión
aby prešiel od štartu po detektor (efektívna
dĺžka kapiláry a rýchlosť pohybu)

Rýchlosť
pohybu
–
závisí
na
elektroforetickej pohyblivosti, tvare a
veľkosti častíc, napätí, koncentrácii BGE a
jeho pH
Elektroosmotický tok (EOF)

spontánny tok kvapaliny v kapiláre v dôsledku náboja vnútornej
steny kapiláry (silanolové skupiny – kremenné kapiláry,
adsorbované ióny - teflón)

Vplyvom EOF dochádza k pohybu všetkých molekúl bez ohľadu
na náboj

pri opačnom náboji na stene kapiláry (modifikácia steny kapiláry)
- EOF opačne

EOF - závislý na pH, na iónovej sile roztoku

Redukcia EOF – ITP, CGE, IEF

EOF znížime
◦
zvýšením iónovej sily BGE a jeho koncentrácie (zároveň zníženie
interakcii analytu so stenami - nižší efektívny náboj steny, vyššia
produkcia tepla) - 10-50mM
◦
pokrytím kapilár
◦
Zmenou pH
Vplyv na rozširovanie zón a tvar píku
a) Difúzia
b) Teplotná disperzia (Joulovo teplo - zmeny teploty, zmeny viskozity)
c) dĺžka zóny (predávkovanie kapiláry)
d) interakcia so stenami (hlavne katióny, hydrofilné aj hydrofóbne
interakcie, pH < 2 – EOF blízky 0, bez interakcii, pH > 8 – aj steny aj
analyty sú negatívne nabité – repulzia nábojov)
e) Elektrodisperzia – (rozdiel vo vodivosti BGE a analytu) BGE musí
zabezpečiť, aby boli stále pohyblivosti (ak je stále pH) a E (zóna vzorky
– vyššia vodivosť – nižšie E – nižšia rýchlosť)
Metódy CE
1.
Kapilárna zónová elektroforéza (CZE)
Micelárna
elektrokinetická
chromatografia
(MEKC)
3. Kapilárna elektrochromatografia (CEC)
2.
4.
Kapilárna gélová elektroforéza (CGE)
5.
Kapilárna izoelektrická fokusácia (IEF)
6.
Kapilárna izotachoforéza (ITP)
1) Kapilárna zónová elektroforéza

Najčastejšie používaný typ CE

zóny, ktoré sa pohybujú rôznou rýchlosťou

Selektivita závisí na vlastnostiach BGE (pH - ionizácia analytu – zmena
pomeru náboj/hmotnosť a teda elektroforetickej pohyblivosti)

Pohyblivosť iónov – elektroforetická pohyblivosť a pohyblivosť EOF

Pokrývanie kapilár - polyakrylamid, polyetylénglykol

Elektroforeogram
◦
kvalita – migračný čas
◦
kvantita - plocha
2) Micelárna elektrokinetická chromatografia

1984 – Terabe

princíp elektroforézy a chromatografie

pre nabité ako ja elektroneutrálne látky

surfaktanty, ktoré pri kritickej micelárnej koncentrácii vytvárajú micely (hydrofóbna
časť – dnu, hydrofilná - von)

Micely – anionické, kationické, neiónové, zwitterionické

Micely interagujú počas analýzy s analytmi pomocou hydrofóbnych a
elektrostatických interakcii (čím je interakcia silnejšia tým dlhšie zostáva analyt v
micele a tým dlhšie s ňou migruje)

Selektivita môže byť ľahko ovplyvnená výmenou surfaktantu, okrem toho iónovou
silou BGE, pH, teplotou, aditívami
3) Kapilárna elektrochromatografia

Miniaturizovaná LC, ktorá využíva elektrické pole na
prenos kvapaliny (EOF) cez plnené chromatografické
kolóny

Kapiláry s ID 50-200 mm so stacionárnou fázou
(reverzná fáza, častice 1-5 mm)

Aplikácia napätia – EOF – pohyb analytov a mobilnej
fázy

Pre neutrálne látky, slabé kyseliny a zásady

Nenabité látky sa separajú na základe rozdelenia medzi
stacionárnu a mobilnú fázu

Plus navyše elektroforetický princíp pre nabité analyty

Lepší prenos kvapaliny pomocou elektrického poľa –
menšie rozširovanie zón, nie je spätný tlak, 3-10x lepšia
separačná účinnosť oproti LC
4) Kapilárna gélová elektroforéza

Molekulárna biológia – separácia makromolekúl (proteínov, nukleové kyseliny) na základe veľkosti (najskôr musia byť
denaturované -SDS)

Naplnenie kapiláry polymérom (agaróza, polyakrylamid, polydimetylakrylamid a metylcelulóza) - molekulárne sito separácia molekúl na základe ich veľkosti

Princíp rovnaký ako v planárnej – výhody kapilár – 10-100x vyššie elektrické pole, on-kapilárna detekcia, automatizácia

pokryté kapiláry na zabránenie EOF

môžu byť separované aj makromolekuly, ktoré sa líšia veľkosťou ale náboj majú rovnaký (bielkoviny vo väzbe s SDS, DNA
– každý nukleotid prináša rovnaký pomer hmotnosť a náboj - nemení sa pohyblivosť)

Koncentrácia gélu nepriamo úmerná veľkosti analytu
5) Kapilárna izoelektrická fokusácia

využíva gradient pH (BGEs obsahujúcich amfolyty), ktorý je vytvorený priamo v kapiláre a látky sa
potom delia na základe ich izoelektrických bodov

Zásadité látky – pri katóde, kyslé pri anóde

bez EOF - pokryté kapiláry, ktoré zároveň zabraňujú adsorpcii látok

Po aplikácii elektrického poľa – pohyb amfolytov a proteínov až kým nedosiahnu pI

Rovnako nabité molekuly sa hromadia v ostrej zóne (dochádza k fokusácii – proteín, ktorý opustí
zónu dostáva náboj a bude migrovať naspäť)

Po fokusácii sa v kapiláre vytvorí rovnováha a kapilárou prestane prechádzať prúd

Vzniknuté zóny treba potom dopraviť do detektora (zvýšením tlaku, prídavkom soli)

Separácia proteínov a peptidov na základe pI (separácia látok, ktoré sa líšia ich pI 0,005 jednotiek)
alebo zisťovanie pI
6) Kapilárna izotachoforéza

Medzi dvoma elektrolytmi (vodiacim a zakončujúcim) sú zoradené zóny separovaných
analytov, ktoré sa všetky pohybujú rovnakou rýchlosťou (daná rýchlosťou vedúceho
iónu)

rovnovážny stav - elektrické pole má v jednotlivých zónach rozdielnu intenzitu (v = mE)

Medzi zónami sa vytvárajú veľmi ostré hranice - samozaostrujúci efekt – ak ión opustí
svoju zónu jeho rýchlosť sa zmení a opäť sa vráti do svojej zóny

zaostrenie zón môžeme dosiahnuť aj pridaním vysokej koncentrácie vedúceho alebo
koncového elektrolytu (prídavkom soli) do roztoku vzorky

Pri ITP je v zónach rovnaká koncentrácia iónov – koncentračný efekt.
Mikročipy


Veľmi rýchle analýzy
Minimálne nároky na vzorku a roztoku
Detekcia
Aplikácie

pôvodne biologické makromolekuly

Genomika
Metabolomika
Proteomika
Analýza celých buniek
Chirálna analýza







Farmaceutická analýza (BioPharma)
Environmentálna analýza
Analýza potravín
Predúpravné techniky v CE
Nízka citlivosť UV detektorov

nízka citlivosť fotometrických detektorov (cLOD za bežných podmienok:
10-5-10-6 mol/l)

krátka optická dráha svetla (najčastejšie v rozsahu 50-100 mm)

malý objem vzorky, ktorý je injektovaný do kapiláry (zamedzuje sa
predávkovaniu kapiláry)

riešenie problému s nízkou koncentračnou citlivosťou:
- zvýšenie množstva vzorky (koncentrácie analytu) injektovaného do
kapiláry
- zvýšenie citlivosti detekcie
Predúprava v bioanalýze
 Analyty prítomné na stopových koncentračných úrovniach
 Analyty prítomné v mnohozložkových matriciach
 rôzne koncentrácie látok
 interferencie – migračné, detekčné
•
Predúprava vzorky (off-line alebo on-line)
 zakoncentrovanie (nižšie LOD)
 Vyčistenie vzorky a izolácia analytov (odstránenie matrice vzorky)
 Derivatizácia – zlepšenie fyzikálnych a/alebo chemických vlastností
analytu
Off-line predúpravné metódy

úprava vzorky pred injektovaním vzorky do kapiláry

Dochádza k stratám analytu
časovo náročné
problematická manipulácia s malými množstvami vzorky
problematická automatizácia
znížená presnosť analýzy




1.
2.
3.
4.
extrakcia kvapalina-kvapalina (LLE)
extrakcia tuhou fázou (SPE)
mikrodialýza
ultrafiltrácia
On-line predúpravné metódy


A.
B.
C.
D.
vlastný separačný priestor
vo väčšine prípadov automaticky

eliminácia potenciálnych nežiaducich strát analytu

ušetrenie času


zlepšenie reprodukovateľnosti oproti manuálnej práci
eliminácia náhodných a systematických chýb

zjednodušenie postupu

Automatizácia a miniaturizácia

drahšie z hľadiska počiatočných nákladov
dynamické spojenie pH (dynamic pH junction)
„zametanie“ (sweeping)
zakoncentrovanie založené na nahromadení elektrickým poľom (Field
amplified sample stacking – FASS) – nie veľmi pre reálne vzorky
(vysoká vodivosť vzoriek – moč, krv- obsah solí)
prechodná izotachoforéza (transient isotachophoresis)
Dynamic pH junction
(A) Kapilára plnená s BGE o vysokom pH
a roztok vzorky (pripravený v elektrolyte
s nízkym pH)
(B) je aplikované pozitívne vysoké napätie,
vytvorí sa diskontinuálna elektrolytová
zóna
(C) anionický analyt je zakoncentrovaný na
rozhraní pH spojenia
(D) nastáva separácia analytov pomocou
CZE
Lin & Kaneta, 2004
Sweeping
(A) BGE pozostáva zo surfaktantu
(napríklad negatívne nabitého SDS)
vytvárajúceho micely, ale vzorka je
rozpustená v nemicelárnom elektrolyte
(B) po nainjektovaní BGE a roztoku vzorky
sa aplikuje negatívna polarita na
posilnenie CE separácie
(C) katióny a anióny sa pohybujú oproti
vstupu alebo výstupu a anionické SDS
micely vstupujú do kapiláry „zametajúc“
analyty
(D) analyty sú kompletne „pozametané“
pomocou SDS, nasledujúca separácia sa
uskutočňuje pomocou MEKC
Lin & Kaneta, 2004
Field amplified sample stacking
(A) kapilára je naplnená BGE (vysoko
vodivý elektrolyt), roztok vzorky
pripravený v rozpúšťadle s nízkou
vodivosťou je potom injektovaný do
kapiláry a je aplikované pozitívne
vysoké napätie
(B) zakoncentrovanie analytov nastáva v
blízkosti hranice medzi zónou vzorky
a BGE kvôli zmenám v pohyblivosti
(C) zakoncentrované analyty sa pohybujú
a sú separované pomocou CZE
Lin & Kaneta, 2004
Transient Isotachophoresis
(A) kapilára je naplnená BGE, vodiaci
elektrolyt, roztok vzorky a
zakončujúci elektrolyt sú potom
injektované do kapiláry, a je
aplikované pozitívne vysoké
napätie
(B) zakoncentrovanie analytov nastáva
medzi vodiacimi a zakončujúcimi
iónmi počas t-ITP migrácie
(C) zakoncentrované zóny analytov sú
potom separované pomocou CZE
Lin & Kaneta, 2004
On-line predúpravné metódy
Prekoncentračná
metóda
Faktor
zakoncentrovania
dynamic
pH-junction
100
sweeping
1000
FASS
1000
tITP
10 000
On-line spájanie metód kapilárnej
elektroforézy
On-line kombinácie v bioanalýze
Tekeľ & Mikuš, 2005
ITP-CZE
 Hydrodynamicky uzavreté systémy (bez
EOF) - lepšia reprodukovateľnosť a presnosť

ITP a CZE separácie (vysoká selektivita)

ITP zakoncentrovanie analytov

ITP vyčistenie vzorky (až 99%)

ITP zvýšenie separačnej kapacity a teda aj
injektovaného množstva vzorky v porovnaní
s bežnou jednokolónovou CZE

výrazné zníženie koncentračných limitov detekcie (cLOD)

zjednodušenie celého
predúprava vzorky)

ITP-ITP – menšia rozlišovacia schopnosť ako ITP-CZE (spacery,
komplexujúce činidlá)
analytického
postupu
(minimálna
Aplikácie
•
Rastlinné materiály – flavonoidy, fenolické kyseliny (ITP-CZE)
•
Telesné tekutiny (CZE-CZE, ITP-CZE, ITP-ITP):
• Kyselina orotová v moči
• Kyselina hipurová v sére
• Antiepileptiká (kyselina valproová, lamotrigin) v sére
• Kyselina L-askorbová v sére, moči, žalúdočnom obsahu
• 5-metyltetrahydrofolát v plazme a sére
•
•
CZE-MEKC – sérový albumín
CIEF-CGE – hemoglobín
•
ITP-ITP-MS – vitamíny B v krvi, cytochróm C
ITP-CZE-DAD
ITP-CZE-DAD.
Chirálny selektor: 5 mg/mL CE-b-CD
cLOD: 9,3 ng/ml
cLOQ: 28,3 ng/ml
Curr. Pharm. Anal. 5 (2009) 171-178
ITP-CZE-LIF
Electrophoresis 34 (2013) 1223-1231
ITP-CZE-LIF.
cLOD: 89 pg/ml
cLOQ: 297 pg/ml
ITP-ITP-CZE
Talanta 2013
On-line spojenie CE-MS
CE-MS
•1988 – Smith R.D. – prvá publikácia (Nature)
•Navzájom sa tieto dve dopĺňajú (molekuly s rovnakými hmotnosťami, ko-migrujúce analyty)
•Najmä ESI – dobrá ionizácia a citlivosť
•ESI - biomolekuly, viacnásobne nabité ióny (nižší pomer m/z - v rámci rozsahu)
•Problémy
• príliš nízky prietok základného elektrolytu separačnou kapilárou
• realizácia vodivého spojenia (aj CE aj ESI – elektrické pole)
http://orion.sci.muni.cz/virtuallab/dokumenty/pdf/CZE.pdf
Vodivé spojenie
1.
- na konci separačnej kapiláry – prúd, ktorý nesie BGE (vysokonapäťový zdroj CE) - m A
- plynné ióny v ESI zdroji tiež prenášajú prúd – nA
- ESI napätie ovplyvňuje aj napätie v CE a tým aj separáciu
2.
- Koncová časť separačnej kapiláry – uzemnená
- ESI napätie: negatívne – pozitívny mód (katióny vstupujú do MS)
pozitívne – negatívny mód (anióny vstupujú do MS)
Sheath-flow CE-ESI-MS interface

sústava troch koncentrických kapilár:
- vlastná separačná kapilára
- kapilára pre prívod pomocného roztoku (tá je uzemnená)
- kovová kapilára privádzajúca inertný plyn (spojená cez redukčný ventil so zásobnou tlakovou
nádobou)

prietok základného elektrolytu (EOF v kremennej separačnej kapiláre) - niekoľko nl/min –
neposkytuje dostatočné objemové množstvo pre vytvorenie stabilného spreja v ESI zdroji

V niektorých metódach EOF úplne potlačený

chýbajúci objem kvapaliny - z externého zdroja - pomocný roztok (sheath liquid) - celkový objem
privádzanej kvapalnej fázy (nosného elektrolytu a pomocného roztoku) - μl/min (1-10 μL/min
koncentračne citlivý - odozva sa znižuje, keď sa zvyšuje prietok)

SL: voda+ metanol/ACN/ISP + kyselina octová, kyselina mravčia, amónne soli

Výhody
 Aj keď nie je EOF
 Robustnosť
 dobrý elektrický kontakt (SL)
 Ionizácia (SL)
Sheathless CE-MS interface

Alternatívna technika
pomocnej kvapaliny
bez
prídavného
toku
 spočíva v pokovaní konca separačnej kapiláry
priamo privedenej do priestoru ionizácie
 Kovový povlak slúži ako uzemňujúca elektróda
elektroforetického zdroja
 Podmienkou realizácie je dostatočne rýchly EOF
 Ako problém sa môžu javiť produkty elektrolýzy
zložiek nosného elektrolytu, ktoré kontaminujú
vzorku a spôsobujú upchatie ústia kapiláry

Nezrieďuje sa vzorka - vyššia citlivosť

nie sú komerčne dostupné
Liquid junction CE-MS interface

V usporiadaní s vodivým kvapalným spojením
 separačná kapilára ukončená pred vstupom do ESI v nádobke s nosným elektrolytom
 Proti jej ústiu je orientovaná pomocná kapilára, ktorá vstupuje do elektrospreja
 V nádobke s nosným elektrolytom je umiestnená elektróda, ktorá slúži na uzavretie obvodu
vysokonapäťového zdroja pre elektroforézu a zároveň poskytuje napätie pre tvorbu elektrospreja
CZE-ESI-QqQ
a)
CTN
PHM
M-PHM
b)
CTN
A1-PHM
A1-PCM
A2-PHM
PHE
PCM,
M-PCM
A2-PCM
CZE-ESI-QqQ
A)
M-PHM
M-PCM
D)
B)
PHM
A2-PCM
A1-PHM
A2-PHM
PCM
PHE
C)
A1-PCM
E)
Single cell analysis

Bunky ako skúmavky:
◦ Dôležité molekuly:
 Maximálne koncentrácie
 Už separované (v bunkových štruktúrach)
 V biologicky relevantných pozíciách

Aplikácie:
◦ Systémová biológia
◦ Genomika
◦ Proteomika
◦ Metabolomika
◦ Metabolické inžinierstvo
◦ Optimalizácia bioprocesov
Single cell proteomika
Mellors et al., Anal. Chem. 2010
Single cell proteomika
A replaceable microreactor for on-line protein digestion in a two-dimensional capillary electrophoresis
system with tandem mass spectrometry detection
Prvá kapilára – separácia zmesi proteínov
Enzymatický mikroreaktor – trypsín immobilizovaný na magnetických časticiach zachytených na koniec
kapiláry pomocou magnetu – on-line digescia proteínov počas separácie peptidov
Druhá kapilára – vytvorené peptidy sú postupne vkladané cez interface do druhej kapiláry
30 min – 30 frakcii
Liet al., J. Chromatogr. A, 2011
Single cell proteomika
Single-Shot Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis− Electrospray Ionization-Tandem Mass
Spectrometry with Production of More than 1 250 Escherichia coli Peptide Identifications in a 50 min
Separation
Zhu et al., Anal. Chem. 2013
Single cell metabolomika
Microfluidic device for the selective chemical stimulation of neurons and characterization of peptide
release with MALDI MS
Croushore et al., Anal. Chem. 2012
CESI -MS
Ultra-low flow separation-ESI
•Minimalizácia iónovej supresie
•Maximalizácia ionizácie
•Zvýšenie citlivosti
Nové analyty - objavené, identifikované, kvantifikované
•Vysoká separačná účinnosť
•Vysoké rozlíšenie
AB SCIEX – CESI
CESI -MS
AB SCIEX – CESI
CESI -MS
AB SCIEX – CESI
CESI -MS
AB SCIEX – CESI
CESI –MS - bioterapeutiká
Problémy:
•Agregácia – vedľajšie efekty
•Modifikácia AK (oxidácia, deaminácia)
•Proteolýza
•glykozylácia
Top 10 farmaceutických produktov
2008:
•1 – top 5
•5 – top 10
•28% - top 100
AB SCIEX – CESI
2014
5 – top 5
7 – top 10
50% - top 100
ITP-ITP-MS
Zmes vitamínov B v krvi
Tomáš et al., 2010
ITP-ITP-MS
Cytochróm C
Tomáš et al., 2010
ITP-CZE-MS
Piešťanský et al., 2014
ITP-CZE-MS
Piešťanský et al., 2014
ITP-CZE-MS
Reálna vzorka
Piešťanský et al., 2014
CE v analýze chirálnych liečiv
Chiralita

Chirálne látky – obsah stereogénneho centra (alebo viacerých) v molekule – optické izoméry
(enantioméry)

Otáčanie roviny polarizovaného svetla

Enantioméry – zhodné vlastnosti len v achirálnom prostredí

Látky prírodného pôvodu – najmä chirálne

Enantioselektívne rozlišovanie – základná vlastnosť živých systémov
Chirálne liečivá

Enantioméry chirálnych liečiv – rozdielne farmakodynamické a
farmakokinetické vlastnosti
rozdielne terapeutické a prípadne aj
nežiadúce účinky

použitie liekov s obsahom len jedného enantioméru - bezpečnejšia
a/alebo účinnejšia farmakoterapia

FDA a EMA - poznatok o stereochémii, stanovenie stereochemického
zloženia a čistoty, farmakologické a toxikologické štúdie pre
racemáty/čisté enantioméry
Chirálne CE techniky
nepriame separácie - tvorba stálych diastereoizomérov s chirálnym
derivatizačným reagentom

◦
diastereoizoméry separované na základe ich rozdielnych fyzikálnochemických vlastností
použitím achirálneho elektrolytového systému
◦
Nevýhody




nutnosť prítomnosti funkčných skupín, ktoré majú byť derivatizované
derivatizačné činidlo – enantiomérne čisté
ďalší časovo náročný krok
možnosť racemizácie počas reakcie
priame chirálne separácie - chirálny selektor sa pridáva do
elektrolytového systému

◦
medzi analyzovanými enantiomérmi a chirálnym selektorom sa vytvoria reverzibilné
diastereoizomérne komplexy
Princíp chirálnej separácie

Rozdiel v stabilite vytvorených komplexov

Rôzna pohyblivosť komplexov

A rôzna pohyblivosť voľného a viazaného selektora

Pri separácii existujú v rovnováhe neviazané enantioméry s viazanými do komplexu so
selektorom

Výsledná efektívna pohyblivosť je daná vektorovým súčtom pohyblivosti voľného a do
komplexu viazaného enantioméru

Miera interakcie E a selektor ako aj koncentrácia selektoru určujú výsledný rozdiel v
efektívnych pohyblivostiach separovaných E
Chirálne selektory
Separačné mechanizmy:

Inklúzna komplexácia (cyklodextríny, crown étery)

Afinitné interakcie (makrocyklické antibiotiká)

Micelárna solubilizácia (žlčové soli)

Ligandová výmena (kovy)

Polymerická komplexácia (sacharidové polyméry)

Ioń-párová výmena (iónové látky v nevodnom médiu)

Nabité chirálne selektory – separácia nenabitých enantiomérov,
protiprúdna migrácia – lepšie rozlíšenie
Cyklodextríny
Oligosacharidy

◦
Neutrálne
◦
Nabité (anionické kationické)
◦
polymérne

UV transparentné

Dostupnosť

Široký rozsah použitia (nepolárne, polárne analyty)

Rozpustnosť vo vode
Analýza chirálnych liečiv

Analyty prítomné vo vzorke vo veľmi vysokom
koncentračnom pomere - kontrole enantiomérnej
čistoty

Analyty prítomné na veľmi nízkych koncentračných
úrovniach oproti zložkám matrice - analýza zložitých
multikomponentných vzoriek

Štruktúrne podobné látky (jednotlivé enantioméry a
metabolity liečiv)
Vysoko účinné, selektívne a citlivé analytické
metódy
ITP-CZE-DAD
Chirálny selektor: 50 mg/mL HP-b-CD
cLOD: 9,3 (AML1) a 10,4 (AML2) ng/ml
cLOQ: 28,2 (AML1) a 31,5 (AML2) ng/ml
J. Chromatogr. B 875 (2008) 266-272
ITP-CZE-DAD
Chirálny selektor:
5 mg/mL CE-b-CD
cLOD: 5,2 (E1) a 6,8 (E2) ng/ml
cLOQ: 7,7 (E1) a 10,1 (E2) ng/ml
Electrophoresis 28 (2007) 2738-2747
ITP-CZE-DAD
Electrophoresis 28 (2007) 2738-2747
Protiprúdny mechanizmus
T=0
T=i
-
+
T = det
+
Electrophoresis 28 (2007) 2738-2747
-
Ďakujem za pozornosť 