Transcript Prednáška

ELEKROMIGRAČNÉ
METÓDY
Lucia Veizerová
ELEKROMIGRAČNÉ METÓDY


Teoretické základy
Planárna elektroforéza

CE - Kapilárna elektroforéza

Nové trendy v oblasti vývoja elektromigračných metód

Príklady aplikácií
TEORETICKÉ ZÁKLADY
Elektromigračné metódy: pohyb (migrácia) elektricky
nabitých častíc v dôsledku pôsobenia elektrického poľa
- kladne nabité ióny putujú ku katóde (záporne nabitá elektróda)
- záporne nabité ióny putujú k anóde (kladne nabitá elektróda)
TEORETICKÉ ZÁKLADY
Elektromigračné separačné techniky: separácia ionogénnych látok
v roztoku na základe ich rozdielnej rýchlosti pohybu v jednosmernom
elektrickom poli
v = u.E
v – rýchlosť akou sa daná častica pohybuje v homogénnom elektrickom poli
k elektróde s opačným nábojom (m.s-1)
priamo úmerná gradientu potenciálu a elektroforetickej pohyblivosti
u – elektroforetická pohyblivosť (m2.V-1.s-1)
E – intenzita elektrického poľa (V.m-1) (E = Unapätie na koncoch kapiláry /Ldĺžka kapiláry)
TEORETICKÉ ZÁKLADY
Výsledný rovnomerný pohyb iónov v roztoku výsledok pôsobenia 2 síl
Sila elektrostatického poľa
Brzdná (frikčná) sila prostredia
Fe = q.E
Ff = 6rv
 – viskozita prostredia
r – polomer iónu
v – rýchlosť pohybu iónu
F – elektrostatická sila
q – náboj
E – intenzita elektrického poľa
Fe = Ff
q.E = 6rv
q.E = 6ruE
u = q/(6. .η.r)
Elektroforetická pohyblivosť
TEORETICKÉ ZÁKLADY
Elektroforetická pohyblivosť u: rýchlosť pohybu nabitých častíc v
kvapalnom prostredí v jednosmernom elektrickom poli s jednotkovou
intenzitou
u = q/(6. .η.r)
q – veľkosť náboja častice
r – polomer častice
η – viskozita okolitého prostredia (tlmivého roztoku)
Kvalitatívna charakteristika ionogénnych látok pre dané prostredie a
teplotu
Aktuálna pohyblivosť: el. pohyblivosť iónov silných elektrolytov vztiahnutá k danej
iónovej sile a teplote
Absolútna (limitná) pohyblivosť: el. pohyblivosť iónov v nekonečne zriedenom roztoku
TEORETICKÉ ZÁKLADY
Efektívna pohyblivosť:
ueff = α.β.γ.u0
u0 – absolútna pohyblivosť
γ – koeficient charakterizujúci brzdenie iónu
prechádzajúceho cez prostredie protiónov. Jeho
veľkosť je podmienená nábojom iónu a protiónov
γ.u0 – aktuálna pohyblivosť
α, resp. β – koeficienty charakterizujúce distribúciu
jednotlivých acidobázických, resp. komplexných
foriem
TEORETICKÉ ZÁKLADY
Výsledná celková pohyblivosť: súčet vektorov elektroforetickej a
elektroosmotickej rýchlosti
v = v + veo
ROZDELENIE ELEKTROFORETICKÝCH
TECHNÍK
Elektroforéza
Kapilárna
Planárna
(papierová, gélová)
Kontinuálny systém
Konštantné
zloženie
elektrolytu
CZE CGE
MEKC CEC
Diskontinuálny systém
Meniace sa
zloženie
elektrolytu
IEF
ITP
PLANÁRNA ELEKTROFORÉZA
 vodivé prostredie (tlmivý roztok) na nosiči
- papier
- acetylcelulóza
- silikagél
-gél (škrobový, agarový, agarózový, polyakrylamidový)
 papierová, gélová elektroforéza
1. Papierová elektroforéza
- rozdelenie analytov do zón podľa
veľkosti a náboja
- separácia liečiv, proteínov atď.
- jednoduché usporiadanie
- pomalá
- problém automatizácie
- ťažká kvantifikácia
PLANÁRNA ELEKTROFORÉZA
2. Gélová elektroforéza
- funkcia sita (nie pri elektroforéze na papieri)
- typy gélov: agaróza (>200kDa), polyakrylamid (5-2000kDa), škrob
- separácia a analýza makromolekúl (proteíny, DNA, RNA)
na základe náboja a/aj veľkosti
- forenzná medicína, biochémia, molekulárna biológia, genetika, mikrobiológia
Nanášanie vzorky v
gélovej elektroforéze
Experimentálne usporiadanie GE
PLANÁRNA ELEKTROFORÉZA
Gélová elektroforéza
Nové aplikácie a moderné trendy
1. Separácia nanočastíc
- nanočastice (1nm-100nm), základná stavebná jednotka nanomateriálov
- vlastnosti závisia od veľkosti a tvaru častíc
- zníženie polydisperzity = materiály s dobre definovanými vlastnosťami a
funkciami
- elektronika (pamäťové média)
- zdravotníctvo (cielená doprava liečiv)
- strojárstvo (supertvrdé povrchy)
- chemický priemysel (selektívna katalýza)
- elektrotechnický priemysel (fotomateriály)
- optický priemysel (optické filtre)
- kozmický priemysel (povrch satelitov)
- životné prostredie (degradácia)
PLANÁRNA ELEKTROFORÉZA
Gélová elektroforéza
Nové aplikácie a moderné trendy
2. Automatizácia
- softvér: automatizácia výberu parametrov analýz, štatistika,
objektivizácia
- priama detekcia bez značenia
3. Kombinácia s modernými detekčnými technikami (MS)
- gélová elektroforéza: vizualizácia, separácia proteínov
- MS: identifikácia proteínov
KAPILÁRNA ELEKTROFORÉZA
- separácia prebieha v kapilárach (otvorený, zatvorený systém)
- sprievodný jav = elektroosmotický tok (najčastejšie kremenné kapiláry)
TEORETICKÉ ZÁKLADY
Elektroosmotický tok EOF:
 jedna z hybných síl kapilárnych elektromigračných metód
 vzniká pôsobením jednosmerného elektrického poľa na difúznu časť elektrickej
dvojvrstvy na rozhraní pevnej a kvapalnej fázy na vnútornej stene kapiláry (voľné
katióny sa pohybujú ku katóde a strhnú so sebou roztok v kapiláre)
 neselektívna sila z hľadiska separácie (unáša všetky ióny rovnakou rýchlosťou)
 smer katóda
 významne ovplyvňuje výslednú migračnú rýchlosť analytov a tým dobu analýzy a
účinnosť separácie
 pH>3 (ionizované silanolové skupiny), elektroosmotická
pohyblivosť>elektroforetická
KAPILÁRNA ELEKTROFORÉZA
Elektroosmotický tok EOF:
veo = ueo.E
veo – rýchlosť elektroosmotického toku (m.s-1)
ueo – elektroosmotická mobilita
E – intenzita elektrického poľa (V.m-1)
ueo =ε.ζ/(4. .η)
ε – dielektrická permitivita kvapaliny (tlmivého roztoku)
ζ – elektrokinetický potenciál (určený povrchovou hustotou náboja na vnútornej
stene kapiláry)
η – viskozita tlmivého roztoku
celková rýchlosť migrácie
v = vef + veo
ZÓNOVÁ KAPILÁRNA ELEKTROFORÉZA (CZE)
 systém (kapilára, anódový, katódový priestor) vyplnený jedným
(základným) elektrolytom
 zloženie elektrolytu rovnaké v celom migračnom prostredí, nemení sa v
priebehu separácie
 separácia iónov podľa efektívnych pohyblivostí (veľkosť, náboj) do
diskontinuálnych zón
 separácia katiónov a aniónov v jednom experimente
(1. katióny, 2. neseparované neutrálne látky, 3. anióny)
 kapiláry z taveného kremeňa (vnútorný priemer 25-80 μm; dĺžka 25-100cm)
 injektované množstvo vzorky malé (10-100 nl)
 detekcia: vodivostný detektor, UV-VIS detektor, fluorescenčný detektor, MS)
 aplikačná oblasť: farmácia, medicína, toxikológia, forenzná medicína
analýza zložiek životného prostredia, mikrobiológia,
potravinársky priemysel
ZÓNOVÁ KAPILÁRNA ELEKTROFORÉZA
(CZE)
Elektroforeogram
ZÓNOVÁ KAPILÁRNA ELEKTROFORÉZA
(CZE)
IZOTACHOFORÉZA (ITP)
 diskontinuálny systém elektrolytov (vodiaci, zakončujúci elektrolyt)
 vytvorenie ustáleného stavu: všetky ióny sa pohybujú rovnakou rýchlosťou
 bezprostredne susediace zóny s ostrými rozhraniami (samozaostrujúci efekt)
 v jednom experimente možné separovať len anióny alebo katióny
 izotachoforeogram: stupňovitý priebeh (výška-kvalita, dĺžka-kvantita)
 detekcia: vodivostný detektor
 aplikačná oblasť: - analýza telesných tekutín (karboxylové kyseliny, proteíny,
nukleotidy)
- analýza liečiv
- analýza potravín (aditíva, konzervačné prísady atď.)
- analýza zložiek životného prostredia (herbicídy, sírany atď.)
IZOTACHOFORÉZA (ITP)
IZOTACHOFORÉZA (ITP)
Izotachoforeogram
IZOELEKTRICKÁ FOKUSÁCIA (IEF)
 elektrolyt: zmes amfolytov (polyaminopolykarboxylové kyseliny, pI)
 migrácia v gradiente pH (najnižšie pH pri anóde, najvyššie pri katóde)
vytvoreného pôsobením el. poľa na komplexnú zmes amfolytov
 delenie amfotérnych látok (bielkoviny, peptidy)
 zastavenie analytu v pH=pI (neutrálna látka=nulová pohyblivosť)
 ostré zóny
 mobilizácia fokusovaných zón (elektroelúcia, EOF, pretlak resp. podtlak
na konci kapiláry)
 detekcia: UV detektor
 aplikačná oblasť: - separácia proteínov
- určenie pI proteínov
IZOELEKTRICKÁ FOKUSÁCIA (IEF)
vloženie
napätia
Zmes amfolytov (malých
amfotérnych molekúl) s
vysokou tlmivou
kapacitou vytvoria pH
gradient
IZOELEKTRICKÁ FOKUSÁCIA (IEF)
Vysoké pH
Nízke pH
NaOH
H3PO4
ELEKTROKINETICKÁ CHROMATOGRAFIA (EKC)
 najmladšia technika (r. 1984)
 kombinovaná separačná technika (mobilná fáza, pseudostacionárna fáza)
 separácia: rozdielna distribúcia látok medzi pseudofázu (napr. micely) a
nosný elektrolyt (kde je pseudofáza homogénne rozptýlená)
 pseudofázy: micely (MEKC), cyklodextríny, olejové mikroemulzie atď.
 pohyb pseudofázy: elektroosmotický tok (dvojfázový systém ako celok)
elektroforetický pohyb (nabitá pseudofáza)
 nabité, neutrálne molekuly
 aplikačná oblasť: - analýza liečiv, potravín
- forenzná analýza
- analýza zložiek životného prostredia
- bioanalytické separácie
ELEKTROKINETICKÁ CHROMATOGRAFIA (EKC)
KAPILÁRNA ELEKTROCHROMATOGRAFIA (CEC)
 hybridná technika CE+HPLC
 separačný priestor: kapilárna kolóna - stacionárna fáza
 pohyb mobilnej fázy nie hydrodynamickým tokom (tlak), ale
elektroosmotickým (el. poľom)
 separácia: rozdielna afinita k stacionárnej a mobilnej fáze+pohyblivosť
 pravouhlý profil elektroosmotického toku (hydrodynamický tok parabolický
profil)
 absencia spätného tlaku = menšie častice sorbentu =
účinnosť separácie
 aj neutrálne molekuly
 aplikačná oblasť: - liečivá (steroidy, benzodiazepíny atď.)
- biomolekuly (proteíny, peptidy, NK, AK)
- prírodné látky (polyfenoly atď.)
- chirálne zlúčeniny
- škodlivé látky (pesticídy)
KAPILÁRNA ELEKTROCHROMATOGRAFIA (CEC)
NOVÉ SMERY VO VÝVOJI ELEKTROMIGRAČNÝCH
TECHNÍK
 výhody CE: vysoká účinnosť, vodné roztoky, univerzálnosť, flexibilita,
malá spotreba elektrolytov, malá spotreba vzorky
 nevýhody CE: nízka koncentračná citlivosť (dávkovanie malých objemov,
nízky limit detekcie, off-line predúprava komplexnej vzorky
 pokročilé techniky:
- rýchla, jednoduchá analýza s čo najmenším počtom operácií so
vzorkou (on-line zakoncentrovanie a prečistenie)
- snaha zvýšiť citlivosť stanovenia (zvýšiť koncentráciu analytu v
kapiláre)
A. on-line prekoncentrácia (môže sa dať viac vzorky)
B. spájanie kolón
C. moderné detekčné techniky (LIF, MS)
D. miniaturizácia (skrátenie času analýzy)
E. chirálne separácie
ON-LINE PREKONCENTRÁCIA
1. zakoncentrovanie vzorky zosilnením poľa
(Field amplified sample stacking FASS)
 interakcia silového elektrického poľa a koncentračného poľa (generované
rozdielnymi vodivosťami, koncentráciami, vzorky a elektrolytu)
 rozdielne vodivosti zón elektrolytu a vzorky = iná hodnota intenzity el. poľa
(vyššia v zóne vzorky) = rozdielna rýchlosť migrácie analytov v zónach =
zakoncentrovanie na rozhraní zón v dôsledku spomalenia rýchlosti migrácie
 zmena pH
(prídavok kyseliny, hydroxidu)
 10-1000 x zosilnený signál
(10−7−10−8 mol.l−1)
ON-LINE PREKONCENTRÁCIA
2. prechodná izotachoforéza (transient isotachophoresis t-ITP)
 najprv izotachoforézou zakoncentrovať, potom analýza napr. CZE
 vhodná kombinácia dvoch alebo viacerých elektrolytov
 základný elektrolyt (ko-ión) s vyššou vodivosťou ako analyt = za zónou vzorky
zóna koncového elektrolytu (ko-ión preberá úlohu vodiaceho elektrolytu) =
prechodný ITP stav po vložení elektrického poľa = po zakoncentrovaní
koncový elektrolyt vymenený za základný = separácia CZE
 základný elektrolyt s ko-iónom s nižšou vodivosťou = vzorka obohatená
o vodiaci ión (K+, Na+)
 biologické vzorky vysoký obsah vedúcich iónov
 možnosť injektovať veľké objemy vzoriek
 iba nabité analyty, nie opačne nabité ióny
(selektívne odstránenie neutrálnych látok)
ON-LINE PREKONCENTRÁCIA
3. namätenie (sweeping)
 interakcia analytu a pseudostacionárnej fázy (micely)
 prídavok micelotvorných látok (dodecyl sulfát sodný SDS) do základného
elektrolytu (v elektrolytovej nádobke na dávkovacej strane kapiláry)
 kapilára, druhá elektrolytová nádobka ani vzorka neobsahujú činidlo
 pseudostacionárna fáza prenikne do širokej zóny vzorky, na rozhraní
zakoncentrovanie vzorky
 efektívne odstránenie matricových nečistôt
 nízky detekčný limit 10-9 mol.l-1
ON-LINE PREKONCENTRÁCIA
SPÁJANIE ELEKTROFORETICKÝCH TECHNÍK
 systémy s komplementárnymi dimenziami: spájanie odlišných
separačných princípov
 odstránenie niektorých nedostatkov jednokolónovej CE, zvýšenie
účinnosti, zvýšenie aplikačného potenciálu
 spájanie: v jednej analýze predúprava a separácia, dávkovanie
väčších množstiev, vyššia reprodukovateľnosť úpravy a prečistenie
vzorky
 komerčne dostupné CE-CE zariadenia: vysoká flexibilita v usporiadaní
CE modulov = možnosť vytvoriť požadovanú kombináciu
 ITP-ITP, ITP-CZE, CZE-CZE, ITP-CZE-CZE, IEF-CZE, ITP-CEC
 spájanie elektroforetickej a inej techniky LC-CE, SPE-CE, dialýza-CE
(rôzne separačné mechanizmy, ale zvýšené nároky na inštrumentáciu)
SPÁJANIE ELEKTROFORETICKÝCH TECHNÍK
On-line kombinácia ITP a CZE (ITP-CZE)
 ITP v prvej kapiláre, CZE v druhej kapiláre
 ITP: vysoká zádrž kolóny (väčší nástrek), zjednodušenie vzorky (cleanup), pripraviť prečistenú a izotachoforeticky zakoncentrovanú vzorku na
vstup do druhej kapiláry
 CZE: vzájomné odseparovanie zložiek vzorky a ich citlivá detekcia
 možnosť zvýšenia nástreku vzorky s c 10-6 mol.l-1 a nižšou o 4 rády
oproti CZE
 predĺženie migračných časov
 analýza stopových látok v zložitých matriciach najmä biologického
pôvodu (analýza proteínov, liečiv, environmentálna analýza, analýza
potravín, analýza obsahových látok rastlín)
dávkovanie vzorky
makrozložky z ITP kroku
ITP krok
CZE krok
SPÁJANIE ELEKTROFORETICKÝCH TECHNÍK
On-line kombinácia ITP a ITP (ITP-ITP)
 prvá kapilára: prekoncentračná (širšia)
 druhá kapilára: analytická (užšia)
 jeden elektrolyt alebo rozdielne elektrolyty (dodatočná separačná selektivita)
 rýchla predúprava zložitých alebo zriedených vzoriek
 uplatnenie najmä v kombinácii s MS detekciou: čisté zóny analytu
(maximálna odozva MS detektora)
 ITP-ITP-MS sľubná metóda pre aplikácie v biomedicíne (metabolomika,
farmakokinetické štúdie)
 ITP-ITP – vodivostný detektor (najčastejšie)
SPÁJANIE ELEKTROFORETICKÝCH TECHNÍK
On-line kombinácia CZE a CZE (CZE-CZE)
 prvá kapilára = separačný krok
odlíšenie analytu od makrozložiek vzorky – in column clean up
 druhá kapilára = detekčný krok
udržať separáciu z prvého kroku, pripraviť podmienky na optimálnu detekciu
 nižšia citlivosť oproti ITP-CZE (chýba prekoncentračná schopnosť ITP)
 kompatibilita s detekčnými technikami
SPÁJANIE ELEKTROFORETICKÝCH TECHNÍK
On-line kombinácia IEF a CZE
 prvá kapilára IEF: – prekoncentrácia
- príprava zóny elektrolytu na nástrek do druhej kolóny
- separácia amfolytov podľa pI
 druhá kapilára CZE: - dodatočná separácia analytov podľa m/z (dodatočná
selektivita)
 podobnosť s ITP-CZE
 vyššia separačná účinnosť ako samostatné stupne
 analýza amfolytov (proteíny, peptidy atď.)
ELEKTROFORÉZA NA MIKROČIPOCH
(miniaturizácia, skrátený čas analýzy)
 separácia prebieha v kanálikoch vyleptaných do mikročipu (kremíková doštička)
 výhody oproti CE: - minimálny objem vzorky potrebný pre analýzu (pikoliter)
- menšia spotreba reagentov, elektrolytov
- skrátenie času separácie (vysoké vkladané napätie
vďaka lepšej disipácii tepla a malá dĺžka kanálikov)
- jednoduché prevedenie a obsluha
 nevýhody: - menšie rozlíšenie (krátke kapiláry)
 vhodná pre elektroforetické aj elektrochromatografické techniky
 možnosť kombinovať elektroforetické techniky (ITP-ZE, ITP-ITP, ITP-GE...)
 najčastejšie používaný detektor: LIF (Laserom indukovaná fluorescencia)
 detekcia, separácia DNA, RNA, proteínov, separácia enentiomérov,
analýza zriedených vzoriek (vôd)
ELEKTROFORÉZA NA MIKROČIPOCH
SPÁJANIE CE S MODERNÝMI DETEKČNÝMI TECHNIKAMI
(zvýšenie LOD, LOQ)
 LIF (Laserom indukovaná fluorescenčná) detekcia
- využíva laser (excitácia analytu), pri de-excitácii emitované fluorescenčné ž.
- vlastnosti laserového lúča kompatibilné s CE. Laserový lúč je úzky
usporiadaný zväzok s minimálnou divergenciou a dá sa ho zaostriť tak,
že prechádza vnútornými stenami kapiláry
- nie všetky látky vykazujú fluorescenciu (potrebná derivatizácia, nepriama
detekcia)
- detekcia fluoreskujúcich látok vo veľmi nízkych c (10-8-10-12 mol/l)
- dosiahnutie nízkeho limitu detekcie vďaka účinnej excitácii (zaostrenie
výkonu lasera do kapiláry), citlivej detekcii (účinný zber emitovaného
žiarenia), redukcii šumu
- priame stanovenie fluoreskujúcich látok: riboflavín, chinín, aromatické AK,
proteíny, peptidy
SPÁJANIE CE S MODERNÝMI DETEKČNÝMI TECHNIKAMI
 Detekcia hmotnostným spektrometrom
- detekcia látok podľa pomeru m/z
- koncentračná citlivosť je v intervale 10-6-10-9 mol/l
- hmotnostné spektrá sú vhodné na štruktúrnu charakterizáciu látky
- CE-MS kompatibilita?
neprchavé tlmivé roztoky nekompatibilné s ESI-MS
nízky prietok kapilárou (problém pri splyňovaní látky)
- CZE-MS; MEKC-MS; IEF-MS; CEC-MS, ITP-MS
- alternatíva k HPLC-MS pre analýzu polárnych a nabitých analytov
- analýza peptidov, liečiv a ich metabolitov, proteínov, pesticídov,
nukleových kyselín atď.
CHIRÁLNE SEPARÁCIE
 nie najnovší trend, ale vysoko aktuálny
 rozvoj: potreby medicíny, farmakológie a farmaceutického priemyslu
 enantioméry rovnaká elektroforetická mobilita v achirálnom
prostredí
 separácia pomocou chirálneho selektora: komplex
selektor- enantiomér = rozdiely v mobilite (rozdielna stabilita)
 priama separácia (pridanie chirálneho selektora do elektrolytu)
 nepriama separácia (interakcia s chirálnym derivatizačným
činidlom pred separačným systémom)
 chirálne selektory: cyklodextríny, lineárne polysacharidy,
(dextran, heparin), makrocyklické ATB (rifamycín), crown-étery
VYUŽITIE ELEKTROMIGRAČNÝCH SEPARAČNÝCH METÓD
 pevná pozícia elektroforézy a kapilánej elektroforézy vo
farmaceutickom a biotechnologickom priemysle, čo dokazujú
všeobecné články a monografie v európskom liekopise
Biomedicínska analýza (analýza liečiv a biomarkerov v klinických
vzorkách)
ITP-CZE: k.hippurová v sére, stanovenie antiepileptík v sére, folát
koenzým v moči
 ITP-ITP: stanovenie vitamínov v krvi
CZE-CZE: analýza k. orootvej v moči
Analýza proteínov
 ITP-CZE: modelový analyt angiotenzínové peptidy
 CZE-MEKC: separácia albumínu hovädzieho séra (štiepeni trypsínom)
 IEF-CGE: analýza variant hemoglobínu (rôzne pI)
VYUŽITIE ELEKTROMIGRAČNÝCH SEPARAČNÝCH METÓD
Farmaceutická analýza
 ITP-CZE: kontrola enantiomérnej čistoty dexbrómfeniramínu v prípravkoch
 ITP-ITP: analýza nízkomolekulových nečistôt (nitrát, sulfát...) v glycerole
separácia alkylsulfonátov, stanovenie metansulfonátu v liečive
Environmentálna analýza
 ITP-CZE: stanovenie železa vo vodách, stanovenie oxyhalidov v pitnej vode,
stanovenie brómovaných polyfenolov vo vodách
 ITP-ITP: prekoncentrácia a stanovenie herbicídov (glyfosfát....)
 CZE-MEKC: stopová analýza kardiovaskulárnych liečiv v odpadových vodách
VYUŽITIE ELEKTROMIGRAČNÝCH SEPARAČNÝCH METÓD
Analýza potravín
 ITP-CZE: stanovenie EDTA v majonéze, stanovenie glycyrizínu v extrakte
sladkého drievka, separácia a stanovenie polyfenolov vo vínach
 ITP-ITP: stanovenie organických a anorganických kyselín (k. benzoová,
k. mliečna v aditívach krmív, stanovenie k. pantoténovej v kukuričných
 lupienkoch
Analýza rastlín
 ITP-CZE: separácia a stanovenie flavonoidov v extraktoch ľubovníka
bodkovaného, atď.
Analýza na mikročipoch
 ITP-ZE: priame stanovenie antiepileptika valproátu v sére, analýza
beta-blokátorov v ľudskom moči