Transcript Prednáška
ELEKROMIGRAČNÉ
METÓDY
Lucia Veizerová
ELEKROMIGRAČNÉ METÓDY
Teoretické základy
Planárna elektroforéza
CE - Kapilárna elektroforéza
Nové trendy v oblasti vývoja elektromigračných metód
Príklady aplikácií
TEORETICKÉ ZÁKLADY
Elektromigračné metódy: pohyb (migrácia) elektricky
nabitých častíc v dôsledku pôsobenia elektrického poľa
- kladne nabité ióny putujú ku katóde (záporne nabitá elektróda)
- záporne nabité ióny putujú k anóde (kladne nabitá elektróda)
TEORETICKÉ ZÁKLADY
Elektromigračné separačné techniky: separácia ionogénnych látok
v roztoku na základe ich rozdielnej rýchlosti pohybu v jednosmernom
elektrickom poli
v = u.E
v – rýchlosť akou sa daná častica pohybuje v homogénnom elektrickom poli
k elektróde s opačným nábojom (m.s-1)
priamo úmerná gradientu potenciálu a elektroforetickej pohyblivosti
u – elektroforetická pohyblivosť (m2.V-1.s-1)
E – intenzita elektrického poľa (V.m-1) (E = Unapätie na koncoch kapiláry /Ldĺžka kapiláry)
TEORETICKÉ ZÁKLADY
Výsledný rovnomerný pohyb iónov v roztoku výsledok pôsobenia 2 síl
Sila elektrostatického poľa
Brzdná (frikčná) sila prostredia
Fe = q.E
Ff = 6rv
– viskozita prostredia
r – polomer iónu
v – rýchlosť pohybu iónu
F – elektrostatická sila
q – náboj
E – intenzita elektrického poľa
Fe = Ff
q.E = 6rv
q.E = 6ruE
u = q/(6. .η.r)
Elektroforetická pohyblivosť
TEORETICKÉ ZÁKLADY
Elektroforetická pohyblivosť u: rýchlosť pohybu nabitých častíc v
kvapalnom prostredí v jednosmernom elektrickom poli s jednotkovou
intenzitou
u = q/(6. .η.r)
q – veľkosť náboja častice
r – polomer častice
η – viskozita okolitého prostredia (tlmivého roztoku)
Kvalitatívna charakteristika ionogénnych látok pre dané prostredie a
teplotu
Aktuálna pohyblivosť: el. pohyblivosť iónov silných elektrolytov vztiahnutá k danej
iónovej sile a teplote
Absolútna (limitná) pohyblivosť: el. pohyblivosť iónov v nekonečne zriedenom roztoku
TEORETICKÉ ZÁKLADY
Efektívna pohyblivosť:
ueff = α.β.γ.u0
u0 – absolútna pohyblivosť
γ – koeficient charakterizujúci brzdenie iónu
prechádzajúceho cez prostredie protiónov. Jeho
veľkosť je podmienená nábojom iónu a protiónov
γ.u0 – aktuálna pohyblivosť
α, resp. β – koeficienty charakterizujúce distribúciu
jednotlivých acidobázických, resp. komplexných
foriem
TEORETICKÉ ZÁKLADY
Výsledná celková pohyblivosť: súčet vektorov elektroforetickej a
elektroosmotickej rýchlosti
v = v + veo
ROZDELENIE ELEKTROFORETICKÝCH
TECHNÍK
Elektroforéza
Kapilárna
Planárna
(papierová, gélová)
Kontinuálny systém
Konštantné
zloženie
elektrolytu
CZE CGE
MEKC CEC
Diskontinuálny systém
Meniace sa
zloženie
elektrolytu
IEF
ITP
PLANÁRNA ELEKTROFORÉZA
vodivé prostredie (tlmivý roztok) na nosiči
- papier
- acetylcelulóza
- silikagél
-gél (škrobový, agarový, agarózový, polyakrylamidový)
papierová, gélová elektroforéza
1. Papierová elektroforéza
- rozdelenie analytov do zón podľa
veľkosti a náboja
- separácia liečiv, proteínov atď.
- jednoduché usporiadanie
- pomalá
- problém automatizácie
- ťažká kvantifikácia
PLANÁRNA ELEKTROFORÉZA
2. Gélová elektroforéza
- funkcia sita (nie pri elektroforéze na papieri)
- typy gélov: agaróza (>200kDa), polyakrylamid (5-2000kDa), škrob
- separácia a analýza makromolekúl (proteíny, DNA, RNA)
na základe náboja a/aj veľkosti
- forenzná medicína, biochémia, molekulárna biológia, genetika, mikrobiológia
Nanášanie vzorky v
gélovej elektroforéze
Experimentálne usporiadanie GE
PLANÁRNA ELEKTROFORÉZA
Gélová elektroforéza
Nové aplikácie a moderné trendy
1. Separácia nanočastíc
- nanočastice (1nm-100nm), základná stavebná jednotka nanomateriálov
- vlastnosti závisia od veľkosti a tvaru častíc
- zníženie polydisperzity = materiály s dobre definovanými vlastnosťami a
funkciami
- elektronika (pamäťové média)
- zdravotníctvo (cielená doprava liečiv)
- strojárstvo (supertvrdé povrchy)
- chemický priemysel (selektívna katalýza)
- elektrotechnický priemysel (fotomateriály)
- optický priemysel (optické filtre)
- kozmický priemysel (povrch satelitov)
- životné prostredie (degradácia)
PLANÁRNA ELEKTROFORÉZA
Gélová elektroforéza
Nové aplikácie a moderné trendy
2. Automatizácia
- softvér: automatizácia výberu parametrov analýz, štatistika,
objektivizácia
- priama detekcia bez značenia
3. Kombinácia s modernými detekčnými technikami (MS)
- gélová elektroforéza: vizualizácia, separácia proteínov
- MS: identifikácia proteínov
KAPILÁRNA ELEKTROFORÉZA
- separácia prebieha v kapilárach (otvorený, zatvorený systém)
- sprievodný jav = elektroosmotický tok (najčastejšie kremenné kapiláry)
TEORETICKÉ ZÁKLADY
Elektroosmotický tok EOF:
jedna z hybných síl kapilárnych elektromigračných metód
vzniká pôsobením jednosmerného elektrického poľa na difúznu časť elektrickej
dvojvrstvy na rozhraní pevnej a kvapalnej fázy na vnútornej stene kapiláry (voľné
katióny sa pohybujú ku katóde a strhnú so sebou roztok v kapiláre)
neselektívna sila z hľadiska separácie (unáša všetky ióny rovnakou rýchlosťou)
smer katóda
významne ovplyvňuje výslednú migračnú rýchlosť analytov a tým dobu analýzy a
účinnosť separácie
pH>3 (ionizované silanolové skupiny), elektroosmotická
pohyblivosť>elektroforetická
KAPILÁRNA ELEKTROFORÉZA
Elektroosmotický tok EOF:
veo = ueo.E
veo – rýchlosť elektroosmotického toku (m.s-1)
ueo – elektroosmotická mobilita
E – intenzita elektrického poľa (V.m-1)
ueo =ε.ζ/(4. .η)
ε – dielektrická permitivita kvapaliny (tlmivého roztoku)
ζ – elektrokinetický potenciál (určený povrchovou hustotou náboja na vnútornej
stene kapiláry)
η – viskozita tlmivého roztoku
celková rýchlosť migrácie
v = vef + veo
ZÓNOVÁ KAPILÁRNA ELEKTROFORÉZA (CZE)
systém (kapilára, anódový, katódový priestor) vyplnený jedným
(základným) elektrolytom
zloženie elektrolytu rovnaké v celom migračnom prostredí, nemení sa v
priebehu separácie
separácia iónov podľa efektívnych pohyblivostí (veľkosť, náboj) do
diskontinuálnych zón
separácia katiónov a aniónov v jednom experimente
(1. katióny, 2. neseparované neutrálne látky, 3. anióny)
kapiláry z taveného kremeňa (vnútorný priemer 25-80 μm; dĺžka 25-100cm)
injektované množstvo vzorky malé (10-100 nl)
detekcia: vodivostný detektor, UV-VIS detektor, fluorescenčný detektor, MS)
aplikačná oblasť: farmácia, medicína, toxikológia, forenzná medicína
analýza zložiek životného prostredia, mikrobiológia,
potravinársky priemysel
ZÓNOVÁ KAPILÁRNA ELEKTROFORÉZA
(CZE)
Elektroforeogram
ZÓNOVÁ KAPILÁRNA ELEKTROFORÉZA
(CZE)
IZOTACHOFORÉZA (ITP)
diskontinuálny systém elektrolytov (vodiaci, zakončujúci elektrolyt)
vytvorenie ustáleného stavu: všetky ióny sa pohybujú rovnakou rýchlosťou
bezprostredne susediace zóny s ostrými rozhraniami (samozaostrujúci efekt)
v jednom experimente možné separovať len anióny alebo katióny
izotachoforeogram: stupňovitý priebeh (výška-kvalita, dĺžka-kvantita)
detekcia: vodivostný detektor
aplikačná oblasť: - analýza telesných tekutín (karboxylové kyseliny, proteíny,
nukleotidy)
- analýza liečiv
- analýza potravín (aditíva, konzervačné prísady atď.)
- analýza zložiek životného prostredia (herbicídy, sírany atď.)
IZOTACHOFORÉZA (ITP)
IZOTACHOFORÉZA (ITP)
Izotachoforeogram
IZOELEKTRICKÁ FOKUSÁCIA (IEF)
elektrolyt: zmes amfolytov (polyaminopolykarboxylové kyseliny, pI)
migrácia v gradiente pH (najnižšie pH pri anóde, najvyššie pri katóde)
vytvoreného pôsobením el. poľa na komplexnú zmes amfolytov
delenie amfotérnych látok (bielkoviny, peptidy)
zastavenie analytu v pH=pI (neutrálna látka=nulová pohyblivosť)
ostré zóny
mobilizácia fokusovaných zón (elektroelúcia, EOF, pretlak resp. podtlak
na konci kapiláry)
detekcia: UV detektor
aplikačná oblasť: - separácia proteínov
- určenie pI proteínov
IZOELEKTRICKÁ FOKUSÁCIA (IEF)
vloženie
napätia
Zmes amfolytov (malých
amfotérnych molekúl) s
vysokou tlmivou
kapacitou vytvoria pH
gradient
IZOELEKTRICKÁ FOKUSÁCIA (IEF)
Vysoké pH
Nízke pH
NaOH
H3PO4
ELEKTROKINETICKÁ CHROMATOGRAFIA (EKC)
najmladšia technika (r. 1984)
kombinovaná separačná technika (mobilná fáza, pseudostacionárna fáza)
separácia: rozdielna distribúcia látok medzi pseudofázu (napr. micely) a
nosný elektrolyt (kde je pseudofáza homogénne rozptýlená)
pseudofázy: micely (MEKC), cyklodextríny, olejové mikroemulzie atď.
pohyb pseudofázy: elektroosmotický tok (dvojfázový systém ako celok)
elektroforetický pohyb (nabitá pseudofáza)
nabité, neutrálne molekuly
aplikačná oblasť: - analýza liečiv, potravín
- forenzná analýza
- analýza zložiek životného prostredia
- bioanalytické separácie
ELEKTROKINETICKÁ CHROMATOGRAFIA (EKC)
KAPILÁRNA ELEKTROCHROMATOGRAFIA (CEC)
hybridná technika CE+HPLC
separačný priestor: kapilárna kolóna - stacionárna fáza
pohyb mobilnej fázy nie hydrodynamickým tokom (tlak), ale
elektroosmotickým (el. poľom)
separácia: rozdielna afinita k stacionárnej a mobilnej fáze+pohyblivosť
pravouhlý profil elektroosmotického toku (hydrodynamický tok parabolický
profil)
absencia spätného tlaku = menšie častice sorbentu =
účinnosť separácie
aj neutrálne molekuly
aplikačná oblasť: - liečivá (steroidy, benzodiazepíny atď.)
- biomolekuly (proteíny, peptidy, NK, AK)
- prírodné látky (polyfenoly atď.)
- chirálne zlúčeniny
- škodlivé látky (pesticídy)
KAPILÁRNA ELEKTROCHROMATOGRAFIA (CEC)
NOVÉ SMERY VO VÝVOJI ELEKTROMIGRAČNÝCH
TECHNÍK
výhody CE: vysoká účinnosť, vodné roztoky, univerzálnosť, flexibilita,
malá spotreba elektrolytov, malá spotreba vzorky
nevýhody CE: nízka koncentračná citlivosť (dávkovanie malých objemov,
nízky limit detekcie, off-line predúprava komplexnej vzorky
pokročilé techniky:
- rýchla, jednoduchá analýza s čo najmenším počtom operácií so
vzorkou (on-line zakoncentrovanie a prečistenie)
- snaha zvýšiť citlivosť stanovenia (zvýšiť koncentráciu analytu v
kapiláre)
A. on-line prekoncentrácia (môže sa dať viac vzorky)
B. spájanie kolón
C. moderné detekčné techniky (LIF, MS)
D. miniaturizácia (skrátenie času analýzy)
E. chirálne separácie
ON-LINE PREKONCENTRÁCIA
1. zakoncentrovanie vzorky zosilnením poľa
(Field amplified sample stacking FASS)
interakcia silového elektrického poľa a koncentračného poľa (generované
rozdielnymi vodivosťami, koncentráciami, vzorky a elektrolytu)
rozdielne vodivosti zón elektrolytu a vzorky = iná hodnota intenzity el. poľa
(vyššia v zóne vzorky) = rozdielna rýchlosť migrácie analytov v zónach =
zakoncentrovanie na rozhraní zón v dôsledku spomalenia rýchlosti migrácie
zmena pH
(prídavok kyseliny, hydroxidu)
10-1000 x zosilnený signál
(10−7−10−8 mol.l−1)
ON-LINE PREKONCENTRÁCIA
2. prechodná izotachoforéza (transient isotachophoresis t-ITP)
najprv izotachoforézou zakoncentrovať, potom analýza napr. CZE
vhodná kombinácia dvoch alebo viacerých elektrolytov
základný elektrolyt (ko-ión) s vyššou vodivosťou ako analyt = za zónou vzorky
zóna koncového elektrolytu (ko-ión preberá úlohu vodiaceho elektrolytu) =
prechodný ITP stav po vložení elektrického poľa = po zakoncentrovaní
koncový elektrolyt vymenený za základný = separácia CZE
základný elektrolyt s ko-iónom s nižšou vodivosťou = vzorka obohatená
o vodiaci ión (K+, Na+)
biologické vzorky vysoký obsah vedúcich iónov
možnosť injektovať veľké objemy vzoriek
iba nabité analyty, nie opačne nabité ióny
(selektívne odstránenie neutrálnych látok)
ON-LINE PREKONCENTRÁCIA
3. namätenie (sweeping)
interakcia analytu a pseudostacionárnej fázy (micely)
prídavok micelotvorných látok (dodecyl sulfát sodný SDS) do základného
elektrolytu (v elektrolytovej nádobke na dávkovacej strane kapiláry)
kapilára, druhá elektrolytová nádobka ani vzorka neobsahujú činidlo
pseudostacionárna fáza prenikne do širokej zóny vzorky, na rozhraní
zakoncentrovanie vzorky
efektívne odstránenie matricových nečistôt
nízky detekčný limit 10-9 mol.l-1
ON-LINE PREKONCENTRÁCIA
SPÁJANIE ELEKTROFORETICKÝCH TECHNÍK
systémy s komplementárnymi dimenziami: spájanie odlišných
separačných princípov
odstránenie niektorých nedostatkov jednokolónovej CE, zvýšenie
účinnosti, zvýšenie aplikačného potenciálu
spájanie: v jednej analýze predúprava a separácia, dávkovanie
väčších množstiev, vyššia reprodukovateľnosť úpravy a prečistenie
vzorky
komerčne dostupné CE-CE zariadenia: vysoká flexibilita v usporiadaní
CE modulov = možnosť vytvoriť požadovanú kombináciu
ITP-ITP, ITP-CZE, CZE-CZE, ITP-CZE-CZE, IEF-CZE, ITP-CEC
spájanie elektroforetickej a inej techniky LC-CE, SPE-CE, dialýza-CE
(rôzne separačné mechanizmy, ale zvýšené nároky na inštrumentáciu)
SPÁJANIE ELEKTROFORETICKÝCH TECHNÍK
On-line kombinácia ITP a CZE (ITP-CZE)
ITP v prvej kapiláre, CZE v druhej kapiláre
ITP: vysoká zádrž kolóny (väčší nástrek), zjednodušenie vzorky (cleanup), pripraviť prečistenú a izotachoforeticky zakoncentrovanú vzorku na
vstup do druhej kapiláry
CZE: vzájomné odseparovanie zložiek vzorky a ich citlivá detekcia
možnosť zvýšenia nástreku vzorky s c 10-6 mol.l-1 a nižšou o 4 rády
oproti CZE
predĺženie migračných časov
analýza stopových látok v zložitých matriciach najmä biologického
pôvodu (analýza proteínov, liečiv, environmentálna analýza, analýza
potravín, analýza obsahových látok rastlín)
dávkovanie vzorky
makrozložky z ITP kroku
ITP krok
CZE krok
SPÁJANIE ELEKTROFORETICKÝCH TECHNÍK
On-line kombinácia ITP a ITP (ITP-ITP)
prvá kapilára: prekoncentračná (širšia)
druhá kapilára: analytická (užšia)
jeden elektrolyt alebo rozdielne elektrolyty (dodatočná separačná selektivita)
rýchla predúprava zložitých alebo zriedených vzoriek
uplatnenie najmä v kombinácii s MS detekciou: čisté zóny analytu
(maximálna odozva MS detektora)
ITP-ITP-MS sľubná metóda pre aplikácie v biomedicíne (metabolomika,
farmakokinetické štúdie)
ITP-ITP – vodivostný detektor (najčastejšie)
SPÁJANIE ELEKTROFORETICKÝCH TECHNÍK
On-line kombinácia CZE a CZE (CZE-CZE)
prvá kapilára = separačný krok
odlíšenie analytu od makrozložiek vzorky – in column clean up
druhá kapilára = detekčný krok
udržať separáciu z prvého kroku, pripraviť podmienky na optimálnu detekciu
nižšia citlivosť oproti ITP-CZE (chýba prekoncentračná schopnosť ITP)
kompatibilita s detekčnými technikami
SPÁJANIE ELEKTROFORETICKÝCH TECHNÍK
On-line kombinácia IEF a CZE
prvá kapilára IEF: – prekoncentrácia
- príprava zóny elektrolytu na nástrek do druhej kolóny
- separácia amfolytov podľa pI
druhá kapilára CZE: - dodatočná separácia analytov podľa m/z (dodatočná
selektivita)
podobnosť s ITP-CZE
vyššia separačná účinnosť ako samostatné stupne
analýza amfolytov (proteíny, peptidy atď.)
ELEKTROFORÉZA NA MIKROČIPOCH
(miniaturizácia, skrátený čas analýzy)
separácia prebieha v kanálikoch vyleptaných do mikročipu (kremíková doštička)
výhody oproti CE: - minimálny objem vzorky potrebný pre analýzu (pikoliter)
- menšia spotreba reagentov, elektrolytov
- skrátenie času separácie (vysoké vkladané napätie
vďaka lepšej disipácii tepla a malá dĺžka kanálikov)
- jednoduché prevedenie a obsluha
nevýhody: - menšie rozlíšenie (krátke kapiláry)
vhodná pre elektroforetické aj elektrochromatografické techniky
možnosť kombinovať elektroforetické techniky (ITP-ZE, ITP-ITP, ITP-GE...)
najčastejšie používaný detektor: LIF (Laserom indukovaná fluorescencia)
detekcia, separácia DNA, RNA, proteínov, separácia enentiomérov,
analýza zriedených vzoriek (vôd)
ELEKTROFORÉZA NA MIKROČIPOCH
SPÁJANIE CE S MODERNÝMI DETEKČNÝMI TECHNIKAMI
(zvýšenie LOD, LOQ)
LIF (Laserom indukovaná fluorescenčná) detekcia
- využíva laser (excitácia analytu), pri de-excitácii emitované fluorescenčné ž.
- vlastnosti laserového lúča kompatibilné s CE. Laserový lúč je úzky
usporiadaný zväzok s minimálnou divergenciou a dá sa ho zaostriť tak,
že prechádza vnútornými stenami kapiláry
- nie všetky látky vykazujú fluorescenciu (potrebná derivatizácia, nepriama
detekcia)
- detekcia fluoreskujúcich látok vo veľmi nízkych c (10-8-10-12 mol/l)
- dosiahnutie nízkeho limitu detekcie vďaka účinnej excitácii (zaostrenie
výkonu lasera do kapiláry), citlivej detekcii (účinný zber emitovaného
žiarenia), redukcii šumu
- priame stanovenie fluoreskujúcich látok: riboflavín, chinín, aromatické AK,
proteíny, peptidy
SPÁJANIE CE S MODERNÝMI DETEKČNÝMI TECHNIKAMI
Detekcia hmotnostným spektrometrom
- detekcia látok podľa pomeru m/z
- koncentračná citlivosť je v intervale 10-6-10-9 mol/l
- hmotnostné spektrá sú vhodné na štruktúrnu charakterizáciu látky
- CE-MS kompatibilita?
neprchavé tlmivé roztoky nekompatibilné s ESI-MS
nízky prietok kapilárou (problém pri splyňovaní látky)
- CZE-MS; MEKC-MS; IEF-MS; CEC-MS, ITP-MS
- alternatíva k HPLC-MS pre analýzu polárnych a nabitých analytov
- analýza peptidov, liečiv a ich metabolitov, proteínov, pesticídov,
nukleových kyselín atď.
CHIRÁLNE SEPARÁCIE
nie najnovší trend, ale vysoko aktuálny
rozvoj: potreby medicíny, farmakológie a farmaceutického priemyslu
enantioméry rovnaká elektroforetická mobilita v achirálnom
prostredí
separácia pomocou chirálneho selektora: komplex
selektor- enantiomér = rozdiely v mobilite (rozdielna stabilita)
priama separácia (pridanie chirálneho selektora do elektrolytu)
nepriama separácia (interakcia s chirálnym derivatizačným
činidlom pred separačným systémom)
chirálne selektory: cyklodextríny, lineárne polysacharidy,
(dextran, heparin), makrocyklické ATB (rifamycín), crown-étery
VYUŽITIE ELEKTROMIGRAČNÝCH SEPARAČNÝCH METÓD
pevná pozícia elektroforézy a kapilánej elektroforézy vo
farmaceutickom a biotechnologickom priemysle, čo dokazujú
všeobecné články a monografie v európskom liekopise
Biomedicínska analýza (analýza liečiv a biomarkerov v klinických
vzorkách)
ITP-CZE: k.hippurová v sére, stanovenie antiepileptík v sére, folát
koenzým v moči
ITP-ITP: stanovenie vitamínov v krvi
CZE-CZE: analýza k. orootvej v moči
Analýza proteínov
ITP-CZE: modelový analyt angiotenzínové peptidy
CZE-MEKC: separácia albumínu hovädzieho séra (štiepeni trypsínom)
IEF-CGE: analýza variant hemoglobínu (rôzne pI)
VYUŽITIE ELEKTROMIGRAČNÝCH SEPARAČNÝCH METÓD
Farmaceutická analýza
ITP-CZE: kontrola enantiomérnej čistoty dexbrómfeniramínu v prípravkoch
ITP-ITP: analýza nízkomolekulových nečistôt (nitrát, sulfát...) v glycerole
separácia alkylsulfonátov, stanovenie metansulfonátu v liečive
Environmentálna analýza
ITP-CZE: stanovenie železa vo vodách, stanovenie oxyhalidov v pitnej vode,
stanovenie brómovaných polyfenolov vo vodách
ITP-ITP: prekoncentrácia a stanovenie herbicídov (glyfosfát....)
CZE-MEKC: stopová analýza kardiovaskulárnych liečiv v odpadových vodách
VYUŽITIE ELEKTROMIGRAČNÝCH SEPARAČNÝCH METÓD
Analýza potravín
ITP-CZE: stanovenie EDTA v majonéze, stanovenie glycyrizínu v extrakte
sladkého drievka, separácia a stanovenie polyfenolov vo vínach
ITP-ITP: stanovenie organických a anorganických kyselín (k. benzoová,
k. mliečna v aditívach krmív, stanovenie k. pantoténovej v kukuričných
lupienkoch
Analýza rastlín
ITP-CZE: separácia a stanovenie flavonoidov v extraktoch ľubovníka
bodkovaného, atď.
Analýza na mikročipoch
ITP-ZE: priame stanovenie antiepileptika valproátu v sére, analýza
beta-blokátorov v ľudskom moči