Transcript Prezentace aplikace PowerPoint

Elektroosmotický tok EOF
Fyzický tok kapaliny kapilárou, který je vyvolaný vložením
stejnosměrného elektrického pole mezi elektrody a je důsledkem
vlastností fázového rozhraní mezi pohyblivou (kapalnou) částí a
nepohyblivou (vnitřní stěna kapiláry) částí kapiláry.
Objem kapiláry = několik ml
Průtokové rychlosti jsou velmi malé, řádově ve stovkách až
tisích nl/min.
Elektroosmotický tok zde plní podobnou úlohu jako pumpy v
HPLC, ale pro vlastní separaci je někdy výhodné EOF potlačit.
Základní výhodou EOF je plošný profil toku kapaliny v
kapiláře, který je dán malými vnitřními rozměry kapiláry
Plošný profil EOF
HPLC, CZE s
potlačeným EOF
CZE
Přibližný model vzniku EOF
Kapilára pro separaci je vyrobena z taveného křemene. Na vnitřním povrchu
kapiláry jsou situovány tzv. silanolové skupiny
1. Vodné prostředí (pracovní elektrolyt) hydratuje silanolové skupiny,
jejich „kyselý“ vodík může v závislosti na pH vodného prostředí
disociovat
-SiOH + H2O
-SiO- + H3O+
2. Disociací vznikne na vnitřní stěně kapiláry přebytek záporného
elektrického náboje, který je okamžitě kompenzován stejně velkým nábojem
kationtů přítomných v pracovním elektrolytu. Tyto kationty jsou k záporně
nabitým silanovým skupinám silně přitahovány, takže se stanou součástí
vnitřní stěny kapiláry a vzniká nepohyblivá Sternova elektrická dvojvrstva.
K této nepohyblivé dvojvrstvě jsou přitahovány ionty z volného pracovního
elektrolytu v těsné blízkosti dvojvrstvy uvnitř kapiláry, ale tyto již nejsou
poutány velkou elektrickou silou a mohou migrovat v elektrickém poli (tvoří
tzv. difuzní dvojvrstvu)
3. Vložením stejnosměrného elektrického pole mezi elektrody, začnou kationty
migrovat směrem ke katodě a zároveň budou odpuzovány od kationtů, které jsou
umístěny v nepohyblivé dvojvrstvě. Protože kationty migrují směrem ke katodě i se
svými solvatačními (hydratačními obaly) dochází k pohybu celé kapaliny uvnitř
kapiláry směrem od anody ke katodě.
Důsledky EOF na migraci iontů
 EOF se pohybuje směrem od anody ke katodě v případě klasické křemenné
kapiláry bez modifikace vnitřního povrchu.
 EOF je silně závislý na pH, složení a koncentraci pracovního elektrolytu,
dielektrické konstantě použitého rozpouštědla a viskozitě elektrolytu
 EOF unáší směrem ke katodě jak kationty, tak neutrální látky tak i anionty a
umožňuje tak provést separaci kationtů i aniontů zároveň. Neutrální látky
separovány nejsou tvoří společnou zónu.
 EOF může separaci urychlit
 příliš rychlý EOF může separaci zhoršit
 EOF zprostředkovává pohyb nenabitých neionizovaných aditiv pracovního
elektrolytu (např. nativní cyklodextriny).
Vliv proměnných parametrů na EOF
Proměnná
Elektrické pole
Důsledek
úměrná změna EOF
poznámky
- při snížení el. pole se snižuje účinnost a rozdělení
- při zvýšení el. pole roste Jouleovo teplo
pH pufru
EOF klesá při nízkém pH
- vhodný pro změnu EOF
a vzrůstá při vysokém pH
- může měnit náboj nebo strukturu analytu
Iontová síla pufru zvýšením koncentrace pufru
- vysoká iontová síla generuje vysoký proud a Jouleův ohřev
dochází k stlačení elektrické
- nízká iontová síla může způsobovat adsorpci vzorku
- při rozdílné vodivosti pufru a vzorku může docházet k deformaci
dvojvrstvy a k poklesu 
píků
potenciál (pokles EOF)
- nízká koncentrace omezuje zakoncentrování
Teplota
dochází ke změně viskozity
- odtud vyplývá nutnost termostatování
(2-3% na 1K)
Organická aditiva mění  potenciál a viskozitu
- experimentálně snadno proveditelné
- změna ovlivňuje selektivitu
(modifikace EOF), změna
změna permitivity prostředí
solvatace analytu
Tenzidy
adsorpcí na stěnu kapiláry
- aniontové tenzidy zvyšují EOF (v závislosti na koncentraci)
mění povrchový náboj
- kationtové tenzidy snižují EOF, nebo dokonce mění jeho směr
- mohou významně měnit selektivitu
Neutrální hydrofilní
adsorbuje se na povrch
- klesá EOF stíněním povrchového náboje a změnou viskozity
polymery
kapiláry, zvyšuje viskozitu
Kovalentní pokrytí změna povrchového náboje
- možné mnohé modifikace pokrytí
stěny kapiláry
v důsledku odstínění vlivu
- problematická stabilita, nereprodukovatelnost
silanolových skupin
Radiální elektrické
- obtížná instrumentace
ovlivnění  potenciálu
pole
Měření mobility EOF

Měření EOF probíhá nejčastěji s využitím tzv. „EOF markerů“
1.
Neutrální molekula rozpustná v prostředí pracovního elektrolytu.
2.
Neměla by interagovat pokud možno s analyty ani se složkami
pracovního elektrolytu.
3. Měla by být snáze detekovatelná.
Benzen, mesityloxid (4-methyl-3-penten-2-on), aceton, močovina,
krotonaldehyd (2-butenal) = všechny tyto markery jsou použitelné pro
UV detekci případně pro vodivostní detekci.
Marker migruje stejnou rychlostí jako se kapilárou pohybuje EOF
a unáší všechny neutrální látky, proto musí být marker EOF rovněž
neutrální.
V některých případech postačí jako EOF marker voda obsažená
v dávkovaném vzorku která se v UV oblasti projeví jako negativní pík
na základní linii
Z elektroforegramu se odečte migrační čas EOF markeru a mobilita se
vypočítá.
Hydrodynamické dávkování
P.d 4 .  . t
V
128. L
P  . g. h
Běžně se v kapilární CE technikách dávkuje řádově
v nanolitrech = CE by mohla být poměrně velmi
citlivou metodou.
ALE: Např. pro on-line UV detekci platí Lambert-Beerův
zákon
A = .l.c
…. Molární dekadický absorpční koeficient
l…. Délka optické dráhy
c…látková koncentrace
„Sample
overloading“ = v
praxi se nastřikuje
zóna vzorku ne
delší než 1-2%
celkové délky
kapiláry
Pro on-line UV-Vis detekci je délka
optické dráhy rovná průměru kapiláry
tedy pouze desítky mm
Spojení CE-MS
Citlivá detekční a identifikační technika, univerzální detekce
Technické problémy při spojení a rutinních analýzách.
Schéma komerčního spojení CE s ortogonálním ESI-MS
CE lze on –line spojit s MS jako kapalinovou separační techniku s
měkkými ionizačními technikami:
ESI = ionizace elektrosprejem
APCI = chemická ionizace za atmosférického tlaku
CE lze off-line spojit s ionizací desorpcí laserem (MALDI ionization)
pro analýzu biomakromolekul.
CE-ESI, CE-APCI – analýza nízkomolekulárních látek a látek se
střední molekulovou hmostností (fragmenty peptidů, fragmenty
DNA)
CE-MALDI – analýza vysokomolekulárních látek a látek se střední
molekulovou hmostností.
Analýza drog CE-ESI-MS
Elektroferogram, kvantitativní a kvalitativní analýza
Rozlišení, kvantitativně popisuje míru separace dvojice analytů. Čím je rozlišení
větší, tím budou od sebe dvě složky lépe separovaný.
V praxi se snažíme dosháhnout rozlišení
1,5 nebo většího
V CE technikách je separace primárně řízena účinností nikoli selektivitou jak je
tomu u chromatografických technik. Postačí tedy velmi malá diference v
mobilitách (<0,05% v mnoha případech), pokud máme dostatečně velkou
účinnost píků (tj. řádově 104 až 105.
Rozlišení vyjádřené pomocí mobilit
separovaných částic
Migrační čas odpovídá kvalitativní charakteristice analytu
Plocha (výška) píku odpovídá kvantitativní charakteristice