Transcript Metoda kalibrační křivky

Kvantitativní analýza
1.
Metoda kalibrační křivky
2.
Metoda interního standardu
Metoda kalibrační křivky – vyžaduje konstantní nástřik vzorku i standardů.
Změří se závislost plochy na koncentraci standardu v koncentračním rozmezí, které je
očekáváno ve vzorku. Sestrojí se kalibrační graf a z něho po změření plochy
stanovovaného analytu odečteme koncentraci.
Metoda interního standardu – používá se interní standard (IS)
IS = látka, která se určitě ve stanovaném vzorku nevyskytuje a zároveň migruje blízko
zóny analytu. IS se přídá jak do kalibračních roztoků tak do vzorku tak, aby jeho
koncentrace byla všude stejná.
Do kalibrační závislosti se pak vznáší poměr plochy analytu a IS.
Metoda IS je přesnější, protože eliminuje chyby při nástřiku
Pro kvantitativní analýzu se nástřik provádí téměř výhradně
hydrodynamicky.
Elektrokinetický nástřik diskriminuje analyty ve vzorku podle
jejich klesající mobility, tj. ionty s vyšší pohyblivostí se nadávkují
ve vyšším množství oproti iontům méně pohyblivějším.
Charakteristiky účinnosti
Vycházejí z kolonové chromatografie a z teorie tzv. teoretického patra.
Ideální = Gaussovský pík
Reálný pík se gaussovskému pouze
blíží!
Šířka píku při základně
Účinnost vyjádřená jako
počet TP
Vztah pro výpočet N z
elektroforegramu
Pro CE techniky lze předpokládat, že k rozmytí píků (a tím ke ztrátě účinnosti a
separace) dochází pouze díky podélné difúzi.
Pak platí:
D…difúzní koeficient
analytu.
Toto je ovšem značně idealizovaný popis, který neplatí
na reálné systémy = N bude vždy menší než udává
tento vztah.
Příspěvky všech faktorů ovlivňující rozmytí píků (injekce,
teplota, adsorpce, detekce, elektrodisperze)
Micelární elektrokinetická chromatografie – MEKC
Elektromigrační technika umožňující separaci neutrálních (hydrofóbních,
nepolárních) látek v elektrickém poli. MEKC může být použitá i pro separaci
látek nabitých.
Separace probíhá v křemenných kapilárách v pracovním
elektrolytu (pufru) s přídavkem tenzidu
TENZID – látka, která snižuje a ovlivňuje povrchové napětí, mezipovrchové
napětí a smáčivost.
Molekula tenzidu se vždy skládá z hydrofóbní části (nepolární) a z hydrofilní
částí (polární).
Hydrofilní
část
Hydrofóbní část
Tenzidy umožňují rozpouštění (solubilizaci) nepolární,
hydrofóbních látek, které jsou bez přádavku tenzidů špatně
rozpustné ve vodě (polárním rozpuštědle), nebo jsou úplně ve vodě
nerozpustné.
Aniontové
Kationtové
Tenzidy
Neiontov
é
Amfoterní
Nejpoužívanější tenzidy v MEKC
SDS je nejvyužívanější tenzid pro separace
neionogenních látek pomocí MEKC
CMC – kritická micelární
koncentrace
Koncentrace tenzidu nad, kterou za daných podmínek (T, typ
rozpouštědla, iontové síle…) vytvářejí molekuly (monomery) tenzidů v
roztoku tzv. nadmolekulární útvary - MICELY
Příklad micely aniontového a
kationtového tenzidu
Hydrofóbní jádro
Hydrofilní „obal“ micely
Hydrofóbní jádro interaguje s nepolárními
(hydrofóbními) látkami, hydrofilní obal interaguje s
polárními látkami nebo s ionty opačného znaménka.
Agregační číslo N
Počet monomerů tenzidu tvořící za daných podmínek strukturu
tenzidy (typicky pro iontové tenzidy jsou to řádově desítky molekul).
SEPARACE POMOCÍ MEKC se odehrává v pracovních elektrolytech o
neutrálním až alkalickém pH (nejčastěji 7 až 9) za přítomnosti silného
(rychlého) elektroosmotického toku, který napomáhá separaci uskutečnit.
Nenabité látky se elektrickém poli bez přítomnosti tenzidů pohybují
stejnou rychlostí jako se pohybuje EOF, ale nedochází k jejich separaci.
Použijeme-li nepř. aniontový tenzid (SDS) o koncentraci rovnou jeho CMC
nebo vyšší v daném pracovním elektrolytu, můžou nenabité látky
interagovat s hydrofóbními jádry micely a budou se tedy pohybovat
stejnou rychlostí jako je rychlost pohybu micely a vzájemná separace
neutrálních látek je řízena rozdílnými hodnotami tzv. rozdělovacích
koeficientů popisující míru interakce mezi micelou a neutrální látkou.
V případě použití SDS migrují micely proti směru EOF!
Vztah kapacitního faktoru (má stejný význam jako v
kapalinové chromatografii) a rozdělovacího koeficientu.
Příklad separace zneužívaných drog pomocí MEKC
8,5 mM borát, 8,5 mM fosfát, 85 mM SDS, 15% acetonitril, pH 8,5
Kapilární gelová elektroforéza (CGE)
Elektromigrační technika kombinující výhody separací v
křemenných kapilárách a separací v gelových médiích v
plošném uspořádání.
Vhodná pouze pro separace makromolekul (oligomerů a
peptidů, fragmentů nukleových kyselin, polysacharidů apod.)
Pracuje se v pokrytých kapilárách (kovalentně se na Si-OH
skupiny navážou derivatizací např. trimethylsilylskupiny)
-Si-O-Si(CH3)3 V takto pokrytých kapilárách není EOF !!!
Kapiláry pro CGE jsou navíc ještě vyplněny gelem a pracovním elektrolytem, tak
aby mohlo docházet k průchodu elektrického proudu.
Používají se buď chemické gely nebo fyzikální gely
Chování gelů v
závislosti na
koncentraci v
roztoku
K separaci CGE dochází na základě rozdílné rychlosti pohybu
molekul v elektrickém poli a na základě různé schopnosti
procházet přes póry v gely – tj. separace především založena na
rozdílné velikosti (hydrodynamickém poloměru).
Používané gelové média:
• polyakrylamidový gel,
• agarosový gel,
• alkylcelulózové gely (hydroxyethylcelulosa,
hydroxymethylcelulosa, hydroxymethylpropylcelulosa)
• Polyethylenglykoly,
Nástřik se v případě CGE provádí elektrokineticky, jinak by
došlo k vytlačení gelu z kapiláry ven!
Nejčastější gely pro CGE a jejich aplikace
Pro detekci se nejčastěji používá fluorescenční detekce, případně
UV spektrofotometrická detekce.
Separace
polydeoxythymidylových
kyselin v polyakrylamidovém
gelu (PAGE)
Kapilární elektrochromatografie (CEC)
Kombinace elektromigračních technik s kapalinovou chromatografií.
• Pro separaci se uplatňují mechanismy migrace nabitých částic v elektrickém poli a
interakce se stacionární fází
Uspořádání typické pro CEC – pro separaci se používají
křemenné kapiláry, které navíc obsahují stacionární fází
podobně jako v kapalinové chromatografii.
CEC nepotřebuje vysokotlakou pumpu pro zajištění pohybu mobilní fáze (MF) přes
kapiláru, pumpou je v tomto případě generovaný EOF.
Profil průtoku MF přes
kapiláru v případě LC
Profil průtoku MF přes
kapiláru v případě CE
K vytvoření EOF přispívá jak náboj vnitřní stěny kapiláry tak
náboj na částicích stacionární fáze.
Pro CEC se nejčastěji využívají kapiláry o vnitřním průměru 100
mm, které jsou vyplněny částicemi stacionární fáze o průměr 3 až 5
mm.
Nejčastější typ SF je C8 a C18 fáze – tzv. reversní fáze.
Stacionární fáze je v kapiláře umístěna mezi dvě polopropustné
frity (zadrženy jsou částice SF nikoliv molekuly MF)
Detekční okénko následuje ve „volné části kapiláry“ za fritou
tak, aby mohlo docházet k on-column detekci.
EOF v kapilárách s C8 a C18 stacionární fázi v kyselé a
bazické oblasti
Jako mobilní fáze se vždy používá vodný pufr s přídavky
organických rozpouštědel (methanol, acetonitril,
dimetylformamid, dimethylsulfoxid).
Separace aromatických uhlovodíků CEC na C18 stacionární
fázi.