Transcript Western blot - detekce a kvantifikace hsp70

systematické laboratorní vzdělávání studentů a pracovníků VaV
v oblasti Life Sciences s podporou e-learningu
reg. č. CZ.1.07/2.3.00/09.0018
Seminář o projektu AescuLab
Tento projekt je spolufinacován Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky
Název projektu:
AescuLab – systematické laboratorní
vzdělávání studentů a pracovníků VaV
v oblasti Life Sciences s podporou
e-learningu
Doba řešení:
1.9.2009 – 31.8.2012
Cíl projektu:
1. vypracování 100 laboratorních postupů
2. vytvoření 100 videosekvencí
3. uspořádání 300 workshopů
Imunologie
Laboratorní
metody
Biochemie
z oblasti
Molekulární
a buněčné
biologie
• GMO
Laboratorní
• Manipulace s laboratorními zvířaty
• ELISA analýza specifické protilátkové odpovědi experimentálních zvířat
• Inhibiční ELISA
metody
z oblasti
• Stanovení specifických protilátek ve vaginálním sekretu myší
• Analýza antigen specifické odpovědi T lymfocytů a jejich subpopulací
pomocí ELISPOT
• Analýza antigen specifické odpovědi T lymfocytů a jejich subpopulací
pomocí Flow Cytometry
•Test proliferační odpovědi subpopulací T lymfocytů po stimulaci antigenem
imunologie
• Indukce tvorby cystických forem B. burgdorferi za různých kultivačních
podmínek
• Analýza životnosti kvasinek pomocí Flow Cytometry
• Indukce morfologických změn Candida albicant
• Metody odstranění a průkazu endotoxinů (LPS)
• Analýza subpopulací splenocytů pomocí Flow Cytometry
• Analýza N-glykosylace gp120 proteinu pomocí lektinových blotů
• Analýza N-glykosylace gp120 proteinu pomocí štěpení endoglykasydasami
• Analýza sialyltransferasové aktivity Golgiho extraktu bb. populace
• Sledování dělení vybrané buněčné populace pomocí CFSE
• Transfekce tkáňových kultur savčích bb. linií liposomy, polyaminy
Laboratorní
metody
• Příprava cDNA - reverzní transkripce
• Izolace totRNA z vláknitých hub Chomczynki, lithium extrakce
• Separace vybrané buněčné populace pomocí magnetických partikulí; izolace
mRNA - magnetické partikule, kolonky
• Návrh primerů pro nested PCR a testování podmínek
• Kvantitativní PCR s použitím duálně BHQ1-FAM prób
z oblasti
• PCR klonování, izolace PCR produktu pro PCR klonování
• Klonování s použitím restrikčních enzymů a DNA ligasy, restrikční analýza
• Příprava rekombinantních proteinů v bakulovirovém expresním systému
stanovení MOI
imunologie
• Exprese rekombinantního proteinu - subklonování adherentních bb. linií
•Transfer DNA, RNA – blotování pomocí vakua
• Northern blot, Southern blot
• Dot Blot proteinů
• Stanovení koncentrace proteinu densitometriií proteinu separovaného pomocí
SDS PAGE
• Lektinová kolona – afinitní purifikace
• RACE
• Exprese rekombinantního proteinu - subklonování suspenzních bb. Linií
• Precipitační metody purifikace peptidů a proteinů
Laboratorní
• Digest proteinů v gelu a v roztoku
• 1D-ELFO a detekce proteinů v gelech
• 2D-ELFO příprava vzorku + separace + detekce + vyhodnocení
metody
• Identifikace proteinů MALDI-TOF MS
• Western blot - detekce a kvantifikace hsp70
• Slot blot a rychlý Western blot SNAP id
z oblasti
• Isoelektrická fokusace
• Nativní elektroforéza a detekce enzymů v gelu
biochemie
• Nízkotlaká iontoměničová kapalinová chromatografie
• Gelová chromatografie
• Kovalentní modifikace proteinu in vitro
• Analýza postranslačních modifikací proteinu
• Stanovení produkce NO a RNS
• Analýza metabolitů RNS – NO2/NO3, nitrosothioly
• Stanovení aktivity enzymů metabolismu RNS - NOS, NR, GSNOR
• Detekce proteinů modifikovaných ROS a RNS
• Histochemické detekce ROS/RNS, HR, fenoly
Laboratorní
• Detekce ROS a RNS konfokální mikroskopií
• Stanovení lipidické peroxidace
• Stanovení aktivity antioxidačních enzymů
metody
• Enzymy metabolismu polyaminů
• Nanočástice – metody immobilizace enzymů
• Konstrukce amperometrických biosenzorů – oxidasy a dehydrogenasy
• Stanovení polyaminů a GABA s využitím HPLC
z oblasti
• Purifikace tRNA a identifikace modif. bazí
• Metody purifikace a analýzy cytokininů
• Příprava protoplastů z rostlinného materiálu
biochemie
• Izolace organel – mitochondrie, peroxisomy, thylakoidy, vakuoly a jejich
charakterizace
• Expesní systémy E.coli a P.pastoris a purifikace afinitní chromatografií
• Transformace rostlin mikroprojektilovým přenosem DNA + vizualizace
chimerního proteinu
• BY-2 buňky – kultivace, transformace, synchronizace, stanovení mitotického
indexu
• Transformace rostlin Agrobacteriem
• „Tomato hairy root transformation“ s detekcí GFP značeného transgenního
proteinu
• Genotypizace odrůd vinné révy
Laboratorní
metody
z oblasti
molekulární
a buněčné
biologie
• Digitální fotografie v biologii
• Kvantitativní a kvalitativní analýza digitálního obrazu
• Práce v aseptickém prostředí
• Morfologie živočišné buňky
• Kultivace živočišných buněčných linií
• Sledování viability a proliferace
• Transfekce buněk, selekce a detekce
• Colony formation assay
• Synchronizace živočišných buněčných kultur
• Modely angiogeneze in vitro
• Příprava buněk pro mikroskopickou analýzu
• Průkaz poškození DNA v buňkách
• FISH
• Průtoková cytometrie – buněčný cyklus (DNA)
• Průtoková cytometrie – detekce intracelulárních proteinů
• Průtoková cytometrie – detekce apoptózy
• Imunoprecipitace jako nástroj pro analýzu protein-proteinových interakcí
• Měření aktivity proteinkinas
• Biochemická detekce aktivity caspas
• Ligandová specifita cytokininového receptoru (kvalitativní test)
Laboratorní
metody
z oblasti
molekulární
a buněčné
biologie
• Interakce nízkomolekulárních látek s cytokinin oxidázou/dehydrogenázou
(substrátová specifita a inhibice)
• Vazebný test ligand-receptor s živými buňkami – vsádková metoda
• Vazebný test ligand-receptor s buněčným lyzátem – rovnovážná dialýza
• Comet assay
• Analýza homologní rekombinace a NHEJ
• Mitotic spreads
• Sterilizace semen
• Homogenizace rostlinného materiálu
• Kořenový test
• Amarantový cytokininový biotest
• Senescenční cytokininový biotest s listy pšenice
• Kalusový cytokininový biotest
• ARR5:GUS cytokininový biotest
• Ligandová specifita cytokininového receptoru (kvantitativní test)
• Lokalizace exprese markerového genu v rostlinném pletivu
• Transformace E. coli elektroporací
• Kvantitativní real-time PCR
• Imunofluorescenční detekce DNA a proteinů v buňce
• Indukce poškození DNA
1. Textová část
2. Obrazová dokumentace (rovnice, grafy…)
Struktura
modulu
3. Fotodokumentace
4. Videosekvence
5. Přednáška v PowerPointu
1. Stručný popis metody (anglicky a česky)
2. Klíčová slova
3. Teoretická část
4. Experimentální vybavení (biologický
materiál, chemikálie, roztoky, přístroje)
Struktura
textové
části
5. Postup
6. Fotodokumentace
7. Vyhodnocení
8. Příklady výsledků
9. Možné problémy
10.Literární odkazy
11.Seznam zkratek
12.Zkrácená verze postupu (česky, anglicky)
www.aesculab.cz
www.aesculab.portal.cz
Možnost
- plná elektronická verze modulu
Portál
projektu
- stažení informací v pdf souboru
- účastnit se diskuse
- vkládat dotazy
- přihlásit se na workshopy
Western blot - detekce a kvantifikace hsp70
Zvolený rostlinný
materiál
Homogenizace,
příprava vzorku
Western blot - detekce a kvantifikace hsp70
Nastavení
experimentu
Western blot - detekce a kvantifikace hsp70
Příprava gelu
na SDS
elektroforézu
Western blot - detekce a kvantifikace hsp70
Skládání
komůrky
Western blot - detekce a kvantifikace hsp70
Nanášení
vzorku
Western blot - detekce a kvantifikace hsp70
Zapojení
komůrky ke
zdroji
Western blot - detekce a kvantifikace hsp70
Příprava
membrány a
gelu na
blotování
Western blot - detekce a kvantifikace hsp70
Skládání
komůrky na
Western blot
Western blot - detekce a kvantifikace hsp70
Western blot
Western blot - detekce a kvantifikace hsp70
Vkládání gelu
do 3% želatiny
Western blot - detekce a kvantifikace hsp70
B)
A)
10% gel
7% gel
A)
300000
y = 71088x - 477.79
2
R = 0.9924
Band density
Příklady
výsledků
200000
100000
0
0
B)
2
Hsp70 [ m g]
4
Western blot - detekce a kvantifikace hsp70
1. Při skládání jednotlivých vrstev do blotovací kazety
dodržuj jejich správné pořadí!
2. Nezapomeň odstranit vzduchové bubliny mezi
membránou a gelem ještě před začátkem blotování.
Možné
problémy
3. Do blotovací komůrky vkládej kazety vždy černou
stranou k černé!
4.
Při
uzavírání
blotovací
pozornost orientaci elektrod!
komůrky víkem
věnuj