Transcript Transkriptom a proteom

Transkriptom
Analýzy toku informací v buňce
• Genomové mapování
• Genomové sekvenování Strukturní
genomika
• Anotace genomu
Jádro
DNA (Genom)
pre-mRNA
Cytoplasma
• DNA arraye a čipy
• (semi) qRT-PCR
• Northern blot + hybrid.
• Transkripční fúze
mRNA
mRNA (Transkriptom)
Proteiny (Proteom)
Metabolity
(Metabolom)
• 2D elektroforéza
Hmotová spektrometrie
Proteinové sekvenování
• Translačí fůze
• Immunodetekce
• Enzymové aktivity, …
• Chromatografie
• Hmotová spektrometrie
• NMR
Funkční
genomika
Transkriptom
Transkriptom
- soubor všech mRNA přítomných v dané buňce, pletivu, …
- odráží míru transkripce genů, alt. sestřih a stabilitu transkriptů
Transkriptomika
– sledování exprese populací genů,
- hledání rozdílů v celkové genové expresi
(za různých podmínek, v různých stádiích vývoje,
v různých orgánech, …)
Sledování transkripce genů – hladiny mRNA
(nejen transkriptomicky)
Metody založené
na hybridizaci NK
(na pevné fázi)
Macroarrays
Hybridizace na
Northern blotu
Microarrays/Chips
Metody založené na PCR
mRNA
(Transkriptom)
Real time PCR
qRT-PCR;
Semikvant.
RT-PCR
DNA (Genome)
Proteiny
(Proteom)
Transkripční fúze promotoru
s reportérovým genem
reportérový gen
P
gen
T
qRT-PCR a Semikvantitativní RT-PCR
množství produktu (počet cyklů potřebných k dosažení určité koncentrace)
odráží množství výchozího templátu
Izolace celkové RNA (mRNA)
Semikvantitativní
RT-PCR
Reverzní transkripce
(oligoT či spec. reverze primer)
cDNA
qRT-PCR
omezený počet cyklů
- zastavení v exp. fázi
qReal Time - PCR
Detekce množství produktu – zpravidla detekce celkové dsDNA
- vyšší specifita při použití sond komplementárních k amplifikované sekvenci
R …reporter
Q …quencher (zhášeč)
D … donor
A … acceptor
Detekce nukleových kyselin hybridizací
(na pevné fázi x in situ, …)
sonda (proba) = vlákno NK o známé sekvenci využívané k
detekci přítomnosti komplementárních NK v analyzovaném
vzorku (směsi izolovaných NK)
Hybridizace – interakce komplementárních ssNK
– ssNK vázané na pevné membráně (skle)
tzv. imobilizovaná (vázaná) fáze
– ssNK v roztoku – tzv. mobilní fáze
Značené sond (směsí NK) pro
hybridizace
- vlákno se zpravidla značí při syntéze, inkorporací značeného
nukleotidu
Typy značení
- radioaktivní (nejčastěji 32P)
- fluorescenční značení
- digoxygenin, biotin apod. + následná
detekce protilátkou/streptavidinem
Hybridizace na Northern blotech
Imobilizovaná (vázaná) fáze – analyzovaná směs
nukleových kyselin
Mobilní fáze = značená sonda (detekce
přítomnosti/množství jedné sekvence + informace o
velikosti sekvence)
x hybridizace na DNA čipech (arrayích)
Imobilizovaná (vázaná) fáze – lokalizovaně vázané sondy
(úseky DNA o známé sekvenci)
Mobilní fáze = značená směs analyzovaných nukl. kyselin
(detekce přítomnosti/množství velkého počtu sekvencí)
Hybridizace na Northern blotu
Izolace RNA
Rozdělení na elektroforéze
Macroarrays
Přenos RNA z gelu na membránu - blotování
Hybridizace se značenou sondou v roztoku, detekce
DNA arraye a DNA čipy - princip
Hybridizace
FluorescenčníFluorescenčně
(RI) signál(RI)
značené analyzované NK
(mobilní fáze)
Pozice
Array, Čip
(imobilizovaná sonda)
Identita
Síla signálu
Množství
Definice pojmů: array, čip
Příprava
Podklad
Hustota
[probes/cm2]
Macroarray
(High Density
Array)
Nanášení oligonucleotidů nebo
PCR fragmentů
Membrána
např. sklo
až 10
Microarray
Nanášení oligonucleotidů nebo
PCR fragmentů
např. sklo
až 2.5 *10
Chip
Přímá syntéza na
podkladu
(fotolitografie)
max. 64
4
5
Arraye
Próby
Mobiní fáze
(nejčastěji značená cDNA)
Imobilizovaná fáze (array)
cDNA (EST)
Próby
Genomové sekvence
Oligonukleotidy, …
Příprava mikroarrayí nanášením - contact printing
MicroGrid II (Biorobotics)
až 64 jehlový nástavec (Telechem)
Hustota: až 6400 prób na cm2
na až 108 sklíčkách
oligonukleotidy a DNA fragmenty až 12 kb
4.5 mm
Porovnávání genové exprese
na mikroarrayích pomocí diferenciálního značení
vzorek I
Hybridizace se směsí
Izolace RNA
Značení (např. při syntéze cDNA)
vzorek II
Alternativa: nezávislé hybridizace a porovnání arrayí
Identifikace diferenciálně exprimovaných genů
- statistické hodnocení odlišnosti
Problémy při použití arrayí
1. Nespecifické (cross-) hybridizace, pozadí
2. Absolutní intenzita signálu závislá i na sekvenci (účinnosti
hybridizace), nejen na množství komplementární NK
3. Reprodukovatelnost
Řešení:
• každá próba na více pozicích na čipu
• více prób od každého genu
• čipy Affimetrix
Oligonukleotidový čip Affymetrix
-více prób na každý gen (např. 20 párů) – složitá pravidla pro navrhování,
složení a výběr sekvencí, syntéza přímo na čipu
- próby z 3' konce genů (vhodné pro Eukaryota)
Syntéza – využívá fotolithografii
Oligonukleotidový čip Affymetrix
- každý oligonukleotid v přesné verzi a
s jedním změněným nukleotidem
mRNA sekvence
3‘
5‘
Páry DNA prób
Sekvence genu
Dokonale párující oligo
Chybně párující oligo
Buňky s dokonalým párováním
Záznam intenzity fluorescence
Buňky s chybným párováním
Rozdíl v intenzitě fluorescence mezi „dokonale párující buňkou” a „chybně
párující buňkou” je analyzován pro všechny dvojice prób
- páry s nízkou informační hodnotou
Značení sondy pro čipy Affymetrix
Celková RNA nebo polyA mRNA je reverzně transkribována na cDNA a lineárně
amplifikována in vitro transkripcí do cRNA (za současného naznačení biotinem)
reverzní
transkripce
mRNA
AAAAAAAAA
cDNA s T7 promoterem
AAAAAAAAA
TTTTTTTTTT- T7 promoter
AAAAAAAAA
AAAAAAAAA
AAAAAAAAA
připojení T7
promotoru
in vitro transkripce
RNA pro hybridizaci s čipem
B B
B
B
B B
B
B
B
B
B
B
B
B
fragmentace
B
B
B
B
UUUUUUUUU
B B
UUUUUUUUU
B
B B
UUUUUUUUU
B
B
B
B
B
B B
B
B
B
biotinem značená cRNA
B
B
UUUUUUUUU
Čipy Affymetrix - hybridizace a analýza výsledku
Po hybridizaci je na biotin navázán konjugát streptavidinu s phycoerythrinem a
je nasnímána a analyzována intenzita fluorescence
BB B
B
B
B
B
analýza obrazu
B B
B
značení streptavidinphycoerythrinem
BB B
B
B
B
B
B B
B
pseudokolorovaný obraz
detector
promytí a
nasnímání
emise při 570 nm
BB B
B
B
B
B
B B
excitace
při 488 nm
B
monochromatický obraz
Genevestigator
https://www.genevestigator.com
přístup k čipovým datům
- analýzy exprese
jednotlivých genů
např. Arabidopsis
- výběr organismu
- výběr genu(ů)
- výběr čipů
(experimentů)