Transcript Vegetativní množení in vitro

VYUŽITÍ EXPLANTÁTOVÝCH KULTUR
 Studium základních problémů fyziologie rostlin
 výživa rostlin
 působení fyzikálních faktorů
 působení růstových regulátorů
 organogeneze, embryogeneze
 Množení rostlin
 Ozdravování rostlinného materiálu
 Produkce sekundárních metabolitů
 Biotransformace
 Produkce umělých semen
 Šlechtění rostlin
 Studium základních problémů fyziologie rostlin
 Indukce tvorby elementů cévního systému
Elementy cévního
systému
bloček + auxin
 Tvorba xylémových buněk v suspenzních buněčných kulturách
(hrách, salát)
požadavek : auxin, cytokinin, cukr, nutná syntéza NA,
není nutné buněčné dělení !
Studium základních problémů fyziologie rostlin
 Rediferenciace mezofylových buněk (Zinnia elegans)
Mezofylové buňky
96 hod
Xylémové buňky
NAA + BA
A – izolované mezofylové buňky
B – kultivované buňky 96 h po
izolaci
C - diferencovaná xylémová
buňka
 Signální účinek hladiny sacharidů - buněčné kultury šeříku (IAA):
1% sacharózy ………………….. xylém
2% sacharózy …………………. xylém + floém
3% sacharózy………………….. xylém + floém
4% sacharózy………………….. xylém + floém
Lacayo et al., 2010
Lze studovat:
 povahu signálu, který proces spouští
 modulování signálu
 vliv na syntézu makromolekul
Groover and Jones, 1999
Studium základních problémů fyziologie rostlin

Kultury rostlinných explantátů vhodné pro studium procesů morfogeneze
 Diferenciace mikrospor = unikátní nástroj studia dělení buněk + diferenciace,
nezralý gametofyt  sporofyt (více než u 200 druhů zvládnuto: mikrospora  rostlina)
 Řízená morfogeneze na segmentech pomocí změn poměru auxin : cytokinin
 Studium kompetence buněk k navození organogeneze v závislosti na poloze
Systém tenkých vrstev
(TCL- thin cell layers)
 Ovlivnění morfogeneze působením fragmentů polysacharidů buněčné stěny
• inhibice auxinem stimulovaného prodlužování segmentů stonku
• inhibice tvorby kořenů na médiu indukujícím tvorbu kořenů (TLC)
• indukce vytváření květních pupenů
Oligosacharidy z buněčné stěny = signální molekuly
 Studium regulace buněčného cyklu
Cytokinin působí na buněčný cyklus:
v G1/S přechodu
KRP
cytokinin
CDK A
CDK A
CDK A
CYC D
CYC D
+
S
CYC D
v G2/M přechodu
P
P
P
P
P
P
P
CDK A/B
CDK
CDKA/B
A/B
CDK A/B
CYCA/B
CYCA/B
CYCA/B
CYCA/B
M
WEE1
?
cytokinin
Regulace G2/M u kvasinky S. pombe
CKI
CAK CAK
CKI
P
CDK
CDC25
G2
G2
cyklin
P
G2/M
M
Regulace G2/M u kvasinky S. pombe
CKI
P
CAK
CDK
CDC25
CDC25
G2
cyklin
P
G2
G2/M
M
Transformant s vneseným genem SPcdc25 z S. pombe
Organogeneze de novo na stonkových segmentech
Pupenů
Kořenů
 cytokinin  auxin
 cytokinin  auxin
2 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA
0,1 mg/l BAP + 3 mg/l NAA
kontrola
80
70
kontrola
transformant A
transformant B
transformant C
transformant F
7
6
b
b
60
b
50
40
30
kontrola
transformant A
transformant B
transformant C
transformant F
c
b
a
počet struktur
počet struktur na bazální polovině segmentu
90
5
4
B
3
b
2
20
1
10
B
ab
ab
B B
a
A
0
0
pupeny
kořeny
pupeny
transformant C
exprese genu cdc25 vede
 k posílení tvorby pupenů
 k omezení tvorby kořenů
Organogeneze na médiu bez růstových regulátorů
Exprese genu cdc25 vede:
 k tvorbě pupenů de novo bez
aplikace cytokininů
kontrola
transformant
Buněčné suspenzní kultury
G2/M
P
P
P
P
P
P
P
CDK
CDKA/B
A/B
CDK A/B
CYCA/B
CYCA/B
M
kontrola
cytokinin
transformant
Exprese genu
cdc25 vede:
 změně orientace
buněčného dělení a
tvaru buněk
„CDC 25“
cytokinin
 Množení rostlin
 Ozdravování rostlinného materiálu
 Produkce sekundárních metabolitů
 Biotransformace
 Produkce umělých semen
 Šlechtění rostlin
 Množení rostlin
 Ozdravování rostlinného materiálu
 Produkce sekundárních metabolitů
 Biotransformace
 Produkce umělých semen
 Šlechtění rostlin
 Množení rostlin
 Ozdravování rostlinného materiálu
 Produkce sekundárních metabolitů
 Biotransformace
 Produkce umělých semen
 Šlechtění rostlin

Množení rostlin v podmínkách in vitro
Množení rostlin : 1) generativní
in vivo
2) vegetativní
Generativní množení
Nevýhody
 malé nasazení semen
 dlouhý generativní cyklus
 rychlá ztráta klíčivosti
 dormance semen
 genetická heterogenita
Výhody
in vitro




pomalé množení
často obtížné
u řady druhů nemožné
infekce
 semena bez patogenů
 rychlý cyklus množení
 snadné skladování, transport,
manipulace
 genetická uniformita
Výhody
Vegetativní
množení
Vegetativní množení
 velký počet jedinců v krátkém čase
 genetická uniformita




u druhů, kde in vivo není možné
bez patogenů
nezávislost na vegetačním období
možnost množení: haploidi, sterilní,
mutanti, aneuploidi, zachování
specifické genové kombinace
Nevýhody
 slabá genetická stabilita
 postupná ztráta regenerační kapacity
 aseptická kultivace, pracnost
 problémy s přenosem do ex vitro
Pečlivým výběrem podmínek a postupů
lze minimalizovat
Vegetativní množení in vitro
Zahrnuje:
 meristemové kultury (kultury vzrostných vrcholů)
 úžlabní odnožování
 regeneraci odventivních orgánů na řízcích
 tvorbu adventivních orgánů v tkáňových kulturách
George, 1993
Množení rostlin v podmínkách in vitro
 somatickou embryogenezi
 regeneraci z buněčných kultur
 regeneraci z protoplastových kultur
Vegetativní množení in vitro
Zahrnuje:
 meristemové kultury (kultury vzrostných vrcholů)
 úžlabní odnožování
 regeneraci odventivních orgánů na řízcích
 tvorbu adventivních orgánů v tkáňových kulturách
George, 1993
Množení rostlin v podmínkách in vitro
 somatickou embryogenezi
 regeneraci z buněčných kultur
 regeneraci z protoplastových kultur
Vegetativní množení in vitro
Zahrnuje:
 meristemové kultury (kultury vzrostných vrcholů)
 úžlabní odnožování
 regeneraci odventivních orgánů na řízcích
 tvorbu adventivních orgánů v tkáňových kulturách
George, 1993
Množení rostlin v podmínkách in vitro
 somatickou embryogenezi
 regeneraci z buněčných kultur
 regeneraci z protoplastových kultur
Vegetativní množení in vitro
Zahrnuje:
 meristemové kultury (kultury vzrostných vrcholů)
 úžlabní odnožování
 regeneraci odventivních orgánů na řízcích
 tvorbu adventivních orgánů v tkáňových kulturách
George, 1993
Množení rostlin v podmínkách in vitro
 somatickou embryogenezi
 regeneraci z buněčných kultur
 regeneraci z protoplastových kultur
Vegetativní množení in vitro
Zahrnuje:
 meristemové kultury (kultury vzrostných vrcholů)
 úžlabní odnožování
 regeneraci odventivních orgánů na řízcích
 tvorbu adventivních orgánů v tkáňových kulturách
George, 1993
Množení rostlin v podmínkách in vitro
 somatickou embryogenezi
 regeneraci z buněčných kultur
 regeneraci z protoplastových kultur
Vegetativní množení in vitro
Zahrnuje:
 meristemové kultury (kultury vzrostných vrcholů)
 úžlabní odnožování
 regeneraci odventivních orgánů na řízcích
 tvorbu adventivních orgánů v tkáňových kulturách
George, 1993
Množení rostlin v podmínkách in vitro
 somatickou embryogenezi
 regeneraci z buněčných kultur
 regeneraci z protoplastových kultur
Vegetativní množení in vitro
Zahrnuje:
 meristemové kultury (kultury vzrostných vrcholů)
 úžlabní odnožování
 regeneraci odventivních orgánů na řízcích
 tvorbu adventivních orgánů v tkáňových kulturách
George, 1993
Množení rostlin v podmínkách in vitro
 somatickou embryogenezi
 regeneraci z buněčných kultur
 regeneraci z protoplastových kultur
 Množení rostlin
 Ozdravování rostlinného materiálu
 Produkce sekundárních metabolitů
 Biotransformace
 Produkce umělých semen
 Šlechtění rostlin
 Množení rostlin
 Ozdravování rostlinného materiálu
 Produkce sekundárních metabolitů
 Biotransformace
 Produkce umělých semen
 Šlechtění rostlin
 Ozdravování rostlin
 Většina rostlin – systematická infekce, rostlina nemusí zahynout --- omezení růstu 
snížení výnosu, snížení kvality plodů.
--- infekce bakteriemi, houbami, viry
 Odstranění patogenů důležité pro:
 zvýšení výnosu, kvalitu produktů
 možnost pohybu rostlinného materiálu přes hranice
 semeno viruprostá rostlina, ale sexuálně množené rostliny -- genetická variabilita
 někdy není napadena celá populace  výběr zdravých jedinců  vegetativní množení
 často napadena celá populace  problém č. 1 : získat zdravou rostlinu  vegetativní množení
 Nerovnoměrné rozložení patogena
Apikální meristémy často zcela viruprosté či s nízkou koncentrací
Koncentrace obvykle vzrůstá se vzdáleností od apexu
Důvody nerovnoměrného rozšíření virů v rostlině:
• pohyb virů po rostlině cévním systémem
• vysoká metabolická aktivita apexu nedovoluje replikaci virů
• vysoká hladina endogenních auxinů v apexu inhibuje multiplikaci virů
Termoterapie -
Ozdravování rostlin
eliminace teplem
zabití patogena
 poškození
Poškození patogena
Zóna terapie
Zóna terapie
Zóna růstu
Zóna růstu
??!!
°C
Nevýhody termoterapie
Necitlivost virů k vyšším teplotám X citlivost rostlin
Způsoby aplikace
• horkou vodou – dormantní pupeny
• horkým vzduchem - aktivně rostoucí výhony
• teploty 35-40°C, trvání několik min až několik měsíců, pomalé zvyšování
teploty, střídání nízkých a vysokých teplot
Ozdravování rostlin
Ozdravení pomocí kultivace explantátů
 Kultivace vzrostných vrcholů (apikální meristem + 1-3 listová primordia)  větší šance na přežití
 Kultivace meristemových kultur  větší šance na získání bezvirózní rostliny,
 Kryoprezervace vzrostných vrcholů  precizní „výběr“ meristematických buněk
Ne vždy je meristem viruprostý  kombinace metod termoterapie a kultivace apikálních
meristemů
• působit na mateřskou rostlinu
• působit na explantát
• postup opakovat
 Chemoterapie
Chemoterapie celých rostlin často nevede k cíli … ošetření explantátových kultur in vitro
lepší výsledky
Přítomnost R.R. snižuje výskyt virů
 Eliminace virů kultivací tkáňových kultur
Ne všechny buňky tkáňové kultury nesou virus
• replikace virů nestačí držet krok s dělením buněk
• některé buňky jsou rezistentní (mutace, rezistentní buňky již v mateřské rostlině)
Ozdravování rostlin
Testování úspěšnosti eliminace
 sledování příznaků choroby
 indikátorové rostliny
 sérologické testy
 elektronmikroskopické sledování
Uchovávání bezvirózních rostlin
• Nebezpečí nové infekce - množení ve sklenících nebo v oblastech
s  výskytem patogena
• Zvýšená citlivost, křížová ochrana, řízená reinfekce
Viry
X
X
Ozdravení
Cílená infekce
X
X
Rostlinná buňka
Význam eliminace virů
• Materiál pro studium interakce virus-rostlina
• Zlepšení výnosu a kvality potravin
• Splnění požadavku pro vývoz plodin
Př.: Bezvirózní rostliny- česnek
Riziko : vegetativní množení
Ozdravování: ozdravení in vitro
meristemové kultury

30-40% přežití , 65 % bezvirózní
chemoterapie
205 µM Ribavirin

termoterapie
100% přežití , 20-30% bezvirózní
32°C - 1 týden + 36°C dva týdny + 38°C tři týdny


20-30 % přežití
Po 4 vegetačních obdobích o 20 % vyšší výnos
Perotto et al., 2010
Soliman et al., 2011
Ramírez-Malagónet al., 2006
60-70 % přeživších – bezvirózní