Transcript zde

Speciální světelná, fluorescenční
a konfokální mikroskopie
Dozvíte se něco o:
Speciální světelné mikroskopii
Zástin a fázový kontrast
 Nomarského diferenciální interferenční
kontrast (DIC)
 Hoffmanův modulační kontrast
 Fluorescenční mikroskopie
 Konfokální mikroskopie

Vyzkoušíte si přípravu preparátů
Vzor protokolu
Protokoly budou obsahovat
výsledky tří úloh, které si
společně provedeme.
Fotografie preparátů umístíme
po praktiku na web a pošleme
Vám odkaz.
Obrázky vytisknete barevně
nebo černobíle a dokreslíte
pastelkami nebo fixy. Opatříte
je popisky a krátkým
komentářem.
Mikroskopická technika - Blok 2
Foto
Datum
Úloha 1 – Autofluorescence plastidu
Organismus
Zvětšení
Nativní preparát
Krátký komentář……..
Foto
Úloha 2 – Značení mitochondrie
Organismus
Zvětšení
Nativní preparát
Krátký komentář……..
Úloha 3 – Imunofluorescence
Organismus
Zvětšení
Trvalý preparát
Krátký komentář……..
Foto
Foto
Foto
Foto
Skládání a ohyb světla
Skládání a ohyb světla
Typy preparátů

Amplitudové = zbarvené objekty absorbující
světlo - rovnoměrně, jeví se jako tmavé
- různě, jeví se jako barevné

Fázové = nebarevné objekty, lišící se
indexem lomu a tloušťkou
Jejich kontrast lze zvýšit
- barvením preparátů
- optickými metodami
Preparát č. 2:
Entamoeba invadens (fázový kontrast)
Koehlerovo osvětlení
1
(ideální nastavení světla v mikroskopu)
2
• V dráze světelných paprsků v mikroskopu existuje
několik rovin, které si jsou vzájemně zaostřené (skrze
čočky) - konjugované.
• Pokud pozorujeme objekt v preparátu, tak k naší
sítnici (1) je konjugovaná obrazová rovina objektivu
(2), rovina preparátu (3). Aby byl preparát ideálně
osvětlen, je potřeba, aby s těmito rovinami byla
konjugovaná rovina povrchu zdroje světla (4).
• Nastavení se provádí posunem kondenzoru nahoru a
dolů. Zároveň je potřeba světlo vycentrovat.
• Při takovém nastavení obraz neovlivňuje vlákno
žárovky (nerovnoměrný zdroj světla), ale promítá se
do něj povrch zdroje světla, ze kterého vychází
rovnoměrné odvětlení. Preparát je tak rovnoměrně
osvětlen.
3
Povrch
zdroje
světla
4
Nastavení Koehlerova osvětlení
1
2
2
1
3
http://www.youtube.com/watch?feature=player_detailpage&v=fNTNZ8nWPd4
Metody zvýšení kontrastu
Zástin: clona
zachycuje paprsky
procházející přímo
do objektivu,
preparát je
osvětlen z boku
Metody zvýšení kontrastu
Fázový kontrast:
rozdíly v posunu
fáze světla,
které neumíme
vnímat, převádí
na rozdíly v jeho
intenzitě
Fázový kontrast
Preparát č. 2:
Entamoeba invadens (fázový kontrast)
Preparát č. 1:
Tritrichomonas foetus (fázový kontrast)
Nomarského
diferenciální
interferenční
kontrast
(DIC):
zobrazuje optický
reliéf, který je u
biologických
objektů
zpravidla shodný s
reálným
prostorovým
reliéfem
Metody zvýšení kontrastu
Hoffmanův
modulační
kontrast (HMC):
podobný výsledek jako
DIC, levnější,
nevyžaduje
polarizované světlo –
proto jím lze
pozorovat i objekty na
dvojlomných
podložkách (plastikové
misky)
Preparát č. 4:
Trypanoplasma borreli (DIC)
DIC (Nomarského kontrast)
Imunofluorescenční barvení
Giardia intestinalis
• Odkápnout blokovací roztok a přidat 500 µl
roztoku s protilátkami.
• Inkubovat ve vlhké komůrce
30’
Luminiscence
Chemiluminiscence
luciferáza – luciferin
Excitace zářením:
fosforescence
fluorescence
Fluorochromy
Přirozená luminisence
chlorofyl
Fluorochromy
Přirozená luminisence
chlorofyl
Přímá vazba fluorochromu
DAPI, ethidiumBr, propidium jodid
Fluorochromy
Přirozená luminisence
chlorofyl
Přímá vazba fluorochromu
DAPI, ethidiumBr, propidium jodid
Nepřímá vazba fluorochromu
pacific blue, alexa fluor 488, FITC, TRITC, alexa
fluor 635
Imunofluorescence
vazba sekundární protilátky s
konjugovaným fluorochromem
(FITC apod.)
vazba primární
protilátky s
konjugovaným
fluorochromem
(FITC apod.)
F
vazba primární
protilátky
F
F
F
F
F
Imunofluorescence
F
F
F
Imunofluorescence
HA (hemaglutinin tag): YPYDVPDYA
F
F
F
Imunofluorescenční barvení
Giardia intestinalis
• Odkápnout blokovací roztok a přidat 500 μl
roztoku s protilátkami.
• Inkubovat ve vlhké komůrce
30’
Imunofluorescence
HA (hemaglutinin tag): YPYDVPDYA
IscU
(mitochondriální
protein)
α-tubulin
Fluorochromy
Vložení genu pro
fluorochrom přímo
do genomu
GFP, RFP, YFP, CFP
Mitotracker
Mitotracker
Naegleria gruberi
• Do kultury přidat 1 μl mitotrackeru.
• Inkubovat při pokojové teplotě 30’ i více.
Filtry: excitační a bariérový
Filtry: excitační a bariérový
Filtry: excitační
a bariérový &
dichroické zrcátko
Filtry: excitační a
bariérový &
dichroické zrcátko
Fluorescenční mikroskop
Co znamená „konfokální“?
Konfokální
mikroskop
Obraz je
rekonstruován
počítačem
Zdrojem světla
je laserový
paprsek
Je snímán jen
obraz ze zaostřené
roviny preparátu
Využití fluorescenční a
konfokální mikroskopie
imunologie – lokalizace epitopů
FITC, DAPI…
Imunolokalizace
Imunolokalizace
Imunolokalizace
FISH
Fluorescence In Situ Hybridization
Využití fluorescenční a
konfokální mikroskopie
Imunologie: lokalizace epitopů
FITC, DAPI…
Genomika: exprese a funkce genů
GFP, RFP, YFP, CFP
Využití GFP
Využití fluorescenční a
konfokální mikroskopie
Imunologie: lokalizace epitopů
FITC, DAPI…
Genomika: exprese a funkce genů
GFP, RFP, YFP, CFP
Proteomika:
sledování pohybů a
interakcí proteinů in situ
PA-GFP, FRAP, FRET
Exkurze do laboratoře konfokální
mikroskopie
Autofluorescence plastidů
Zygnema sp.
Euglena gracilis
• Kápneme na sklíčko a pozorujeme 1000x
zvětšeno s immerzním olejem. Plastidy emitují
červené světlo.
Mitotracker
Naegleria gruberi
• Kápneme na sklíčko a pozorujeme 1000x
zvětšeno s imerzním olejem. Mitotracker
emituje červené světlo.
Imunofluorescenční barvení
Giardia intestinalis
IscU
(mitochondriální
protein)
α-tubulin
Imunofluorescenční barvení
Giardia intestinalis
• Odkápnout roztok s protilátkami
• Přidat 750 μl PBS
• Inkubovat 5’
• Odkápnout a opakovat ještě 2x od bodu 2
Imunofluorescenční barvení
Giardia intestinalis
• Odkápnout PBS a přidat 500 μl roztoku se
sekundárními protilátkami.
• Inkubovat ve vlhké komůrce
30’
Imunofluorescence
HA (hemaglutinin tag): YPYDVPDYA
F
F
F
IscU
(mitochondriální
protein)
α-tubulin
Imunofluorescenční barvení
Giardia intestinalis
• Odkápnout roztok s protilátkami
• Přidat 750 μl PBS
• Inkubovat 5’
• Odkápnout a opakovat ještě 2x od bodu 2
Imunofluorescenční barvení
Giardia intestinalis
• Montovat médiem Vectashield s DAPI (barví
DNA modře)
• Zafixovat lakem na nehty
• Pozorovat 1000x zvětšeno s imerzním olejem.
Vzor protokolu
Protokoly budou obsahovat
výsledky tří úloh, které si
společně provedeme.
Fotografie preparátů umístíme
po praktiku na web a pošleme
Vám odkaz.
Obrázky vytisknete barevně
nebo černobíle a dokreslíte
pastelkami nebo fixy. Opatříte
je popisky a krátkým
komentářem.
Mikroskopická technika - Blok 2
Foto
Datum
Úloha 1 – Autofluorescence plastidu
Organismus
Zvětšení
Nativní preparát
Krátký komentář……..
Foto
Úloha 2 – Značení mitochondrie
Organismus
Zvětšení
Nativní preparát
Krátký komentář……..
Úloha 3 – Imunofluorescence
Organismus
Zvětšení
Trvalý preparát
Krátký komentář……..
Foto
Foto
Foto
Foto