Vysoké učení technické v Brně Laboratoře – Ústav fyziky KONFOKÁLNÍ MIKROSKOPIE KONFOKÁLNÍ MIKROSKOP LEXT 3100 Aplikace: Lomové plochy Vodivé i nevodivé materiály (polovodiče, keramika, plasty, povlaky, vrstvy a kovy) Analýza: Drsností Profilů Částic Objemová analýza přímo ve 3D.

Transcript Vysoké učení technické v Brně Laboratoře – Ústav fyziky KONFOKÁLNÍ MIKROSKOPIE KONFOKÁLNÍ MIKROSKOP LEXT 3100 Aplikace: Lomové plochy Vodivé i nevodivé materiály (polovodiče, keramika, plasty, povlaky, vrstvy a kovy) Analýza: Drsností Profilů Částic Objemová analýza přímo ve 3D.

Vysoké učení technické v Brně

Laboratoře – Ústav fyziky

KONFOKÁLNÍ MIKROSKOPIE

2009

Aplikace: Lomové plochy Vodivé i nevodivé materiály (polovodiče, keramika, plasty, povlaky, vrstvy a kovy) Analýza: Drsnost í P rofilů Částic Objemov ve á analýza přímo 3D zobrazení

KONFOKÁLNÍ MIKROSKOP LEXT 3100

Optické prvky jsou uzpůsobené vlnové délce laseru o λ = 408 nm: Zdroj Objektiv Konf. opt. clonka Fotonásobič Detektor CCD (snímání barevného obrazu-RGB) fotoefekt

PR VKY KONFOKÁLNÍHO MIKROSKOPU

Osvětlení: Bodový zdroj světla (laserový paprsek fokusovaný na clonku) Clonka: Je objektivem mikroskopu zobrazena na vzorek, do bodu o průměru rovnajícím difrakční mezi mikroskopu Objektiv: Sbírá světlo vzorkem odražené nebo rozptýlené Zpětný průchod objektivem: Obraz bodové clonky => fotonásobič (blokující) => druhá konfokální bodová clonka

PR INCIP KONFOKÁLNÍHO MIKROSKOPU

čárkovaně: paprsky jdoucí z mimoohniskových rovin, zachycené clonkou.

HISTORIE KONFOKÁLNÍ MIKROSKOPIE

Marvin Minsky 1957 – patentoval nápad na konfokální mikroskopii, ale nenašel vhodný zdroj světla M. Petráň a M. Hadravský 1967 – Tandem Scanning Confocal Microscope Koncem 70. let – první spolehlivý konfokální mikroskop s rozmítaným laserovým paprskemm laserovým paprskem

SROVNÁNÍ S „KLASICKOU“ MIKROSKOPIÍ

„Klasická“ mikroskopie:

Předpokládá nekonečně malou tloušťku preparátu (vzorku) Při zkoumání silných vzorků je kvalita zobrazení nepříznivě ovlivňována překrýváním obrazu roviny, do níž je mikroskop právě zaostřen, s neostrými obrazy rovin ležících nad ní a pod ní. Lze zkoumat jen vzorky o objektivu, která závisí na jeho numerické apertuře (Z min = 0,25 nλ/NA 2 ).

tloušťce menší, než je hloubka ostrosti Obrazem bodu není bod, ale tzv. Airyho kroužky Difrakční obrazec vzniká ohybem zobrazujícího se světla na čočkách objektivu. Při zobrazení blízkých bodů se mohou jejich Airyho kroužky překrývat, až se stanou téměř nerozlišitelnými.

SROVNÁNÍ S „KLASICKOU“ MIKROSKOPIÍ

Konfokální mikroskopie

navíc výhody i nevýhody: tyto nevýhody odstraňuje nicméně má Výhody: Potlačení mlhavého pozadí obrazu Optická tomografie Není limitována Rayleighovým kriteriem: (Obraz vzniká skládáním z jednotlivých bodů, které jsou navíc pozorovány přes clonku, jejíž rozměry bývají menší než průměr Airyho kroužků.) Nevýhody: Zatíženost statistickým šumem, jehož velikost je úměrná √N/N, kde N je počet detekovaných fotonů. Nelze snadno řešit zvýšením intenzity záření (Interakce s /fluorescenčním/ preparátem)

Rastrující konfokální mikroskop: U něj skenující zařízení zařizuje posun ohniska excitujícího laserového paprsku – velmi efektivní pro sestavování 3D modelů Rastrování (obraz celé zaostřené roviny se získává bod po bodu následovně): Rozmítáním laserového paprsku Příčným posuvem vzorku před objektivem Posuvem objektivu nad vzorkem Optické řezy: Optické řezy se pohybují v řádech mikrometrů (lze numerické apertury a využitého laseru)

SROVNÁVACÍ SNÍMKY

Nekonfokální mikroskop Konfokální mikroskop

PRACOVIŠTĚ ÚSTAVU FYZIKY

Lomová plocha hydratované cementové pasty: Zvětšení 120 x Rastrů 250

MĚŘENÍ A MODELOVÁNÍ

Lomová plocha hydratované cementové pasty: Zvětšení 480 x Rastrů 250

MĚŘENÍ A MODELOVÁNÍ