Slide 1

Využívanie ekotoxikologických
testov na hodnotenie kvality
životného prostredia
Prof. RNDr. Agáta Fargašová, DrSc.
Univerzita Komenského v Bratislave, Prírodovedecká
fakulta, Katedra ekosozológie a fyziotaktiky


Slide 2

Čo rozumieme pod pojmom „toxicita“ ?
Toxicita je stanovenie toxických účinkov
tekutých alebo tuhých odpadov,
kontaminovaných zemín, výluhov zo skládok,
látok z odpadov vstupujúcich do vodných
ekosystémov, závlahových vôd, odtokov
z čistiarní priemyselných a komunálnych
odpadových vôd, výluhov z tuhých odpadov,
biocídov, detergentov, náterových hmôt – napr.
zmyvov z náterových plôch nádrží


Slide 3

Kritériá, ktorými sa toxicita vyjadruje
EC50, EC10, EC90, LC50, LC10, LC90
s intervalmi spoľahlivosti,
NOEC, LOEC,
rastové krivky,

TU (toxical unit),
EC50/NOEL, EC50/LOEL, LC50/NOEL,
LC50/LOEL


Slide 4

Prečo sa používajú ekotoxikologické testy ?

 Znečistenie životného prostredia
 Sledovanie účinkov potenciálne toxických látok
na zvieratá alebo rastliny, nachádzajúce sa na
jednotlivých trofických úrovniach (v súčasnosti
žije na našej planéte viac ako 108 druhov)

 Vplyv iných faktorov – štruktúra molekuly

chemickej látky, jej vlastnosti, rozpustnosť,
penetrancia, a pod.

Ekotoxikologické testy sa dajú robiť na ktorejkoľvek
úrovni biologickej hierarchie – od molekúl až po
ekosystémy.


Slide 5

Čo poskytujú ekotoxikologické testy ?

 možnosť priameho posúdenia nepriaznivých
účinkov na životné prostredie bez ohľadu na
zloženie a charakter testovanej látky,
odpadovej vody resp. odpadu

 ďaleko vyššiu výpovednú hodnotu v spojení
s konvenčnými analytickými metódami,
pričom nízka cena umožňuje široké
uplatnenie v bežnej praxi


Slide 6

Kto rozhoduje o ekotoxikologických testov
a čo ovplyvňuje charakter týchto rozhodnutí ?

 O tom, ktoré testy sú najdôležitejšie pre kľúčovú prezentáciu určitých častí životného prostredia, musia rozhodnúť ekotoxikológovia.

 Títo rozhodujú aj o tom, či sa budú sledovať
len akútne alebo aj chronické účinky
(ktoré môžu byť často oveľa dôležitejšie)
sledovaných látok.

 Rozhoduje sa aj o tom, či sú potrebné
mnohodruhové testy.


Slide 7

Čo musia spĺňať ekotoxikologické testy ?

 Dajú sa robiť na ktorejkoľvek úrovni
biologickej hierarchie

 Môže sa do nich vybrať hociktorý
predstaviteľ trofickej úrovne

 Výsledky musia byť reprodukovateľné
a presné – musia spĺňať podmienky
GLP – Good Laboratory Practice


Slide 8

Trofické úrovne s uvedením najbežnejšie používaných
zástupcov v ekotoxikologických testoch

* nie je typickým konzumentom piatej trofickej úrovne, ale používa sa ako
reprezentant, lebo sa ľahko dochováva; predstavuje aj druh konzumovaný
človekom, čo je ďalším dôležitým hľadiskom


Slide 9

Štandardizácia testov
Z hľadiska požiadaviek na štandardizáciu sa
dnes už vytvorilo veľa testov, ktoré majú presne
definované medzinárodne odsúhlasené
protokoly a zahŕňajú presne definované
reprezentatívne druhy (European Commission
EC, U.S. Environmental Protection Agency US
EPA, Organization for Economic Co-operation
and Development OECD). U nás sú tieto normy
a predpisy prijímané ako STN EN ISO normy
a vychádzajú predovšetkým z OECD predpisov.


Slide 10

OECD Council od r. 1984 prijal pre testovanie
chemických látok približne 16 predpisov, ktoré
boli v roku 1993 upravené tak, že navrhujú pre
testovanie účinku chemických látok na biologické systémy osem špecifických zameraní pre
testy na piatich trofických úrovniach a umožňujú
zisťovanie údajov ako o akútnom tak aj chronickom toxikologickom účinku.


Slide 11

Prehľad OECD postupov používaných na odhad toxicity
pre bioty v životnom prostredí


Slide 12

ŠTANDARDNÉ TESTY TOXICITY

RÝCHLE EKOTOXIKOLOGICKÉ TESTY


Slide 13

ŠTANDARDNÉ TESTY TOXICITY
Trofická úroveň 1 – primárni producenti



Riasy – test na inhibíciu rastu

 testovanie vo vode rozpustných látok

 druhy používaných rias – Selenastrum
capricornatum, Scenedesmus subspicatus,
Chlorella vulgaris
 kultúry musia byť v logaritmickom stave rastu

 EC50 hodnota je založená na porovnaní nárastu
biomasy v kontrolách a v kultúrach
s testovanými látkami


Slide 14

 Testy rastu suchozemských rastlín
 dá sa pri nich udávať aj postupná kontaminácia
pôdy testovanými látkami
 používajú sa na stanovenie účinku chemických
látok na tri rôzne kategórie suchozemských
rastlín. Kategórie sú odvodené na základe
intenzity rastlinnej produkcie, ale získané
výsledky sa dajú zovšeobecniť aj pre ostatné
suchozemské rastlinstvo. Vybrané rastliny sa
ľahko pestujú v laboratórnych podmienkach.


Slide 15

Tri kategórie rastlín používaných pri terestrických testoch
rastu rastlín odvodené na základe intenzity rastlinnej
produkcie


Slide 16

Testy rastu suchozemských rastlín sledujú:
klíčivosť semien (LC50)
rast koreňa a nadzemných výhonkov (EC50)
iné parametre, napr. sledovanie
fytotoxicity, ktorá sa prejavuje chlorózou


Slide 17

Trofická úroveň 2 – primárni konzumenti

 Testy na vodných organizmoch – testy na
vodnom planktónnom kôrovcovi Daphnia
magna
 akútny imobilizačný test (24 h) – LC50
 reprodukčný test (14-dňový) – EC50

 Testy na suchozemských organizmoch –
testy na suchozemských herbivoroch –
dážďovkách Eisenia foetida

 kontaktný papierový test – akútny (48 h) LC50
 test na umelej pôde – chronický (7-14 dní) LC50


Slide 18

Trofická úroveň 3 – 5 – úrovne konzumentov

 Testy na vodných organizmoch – sledovanie

akútnych aj chronických účinkov chemických
látok na ryby. Využiť sa dajú všetky druhy rýb –
záleží na zložení vodného prostredia, o ktorom sa
predpokladá, že by mohlo byť kontaminované
testovanými látkami

 akútne testy – sledovanie úmrtnosti v 24hodinových intervaloch po dobu 96 h – LC50
 chronický test – kontinuálny – 14 dní – LC50

Žiaľ, tieto testy nehodnotia sekundárnych vodných
konzumentov, lebo nepočítajú s potravným príjmom
testovaných látok vo forme reziduí koncentrovaných
v potravnom reťazci.


Slide 19

Druhy rýb používaných v ekotoxikologických testoch

lotické – tečúce vody; lentické – stojaté vody


Slide 20



Testy na vtákoch – konzumenti 3 a 4 trofickej
úrovne – riešia problémy súvisiace so zabudovávaním toxických látok do potravového
reťazca človeka. Chemické látky sa v týchto
prípadoch netestujú na skutočných (reálnych)
zástupcoch týchto trofických úrovní, lebo by si
vyžadovali veľký počet testovaných jedincov –
nemožné z hľadiska ochrany prírodného
prostredia (napr. testy na jastraboch) 
používanie iných druhov ako reprezentantov,
napr. kačice, japonské perličky, bažanty,
prepelice.

Problémy: rozdiely v metabolizme a tým aj v toxicite
testovaných látok pri karnivorných a herbivorných
vtákoch


Slide 21

 subakútny 5-dňový test




stanovuje sa pri ňom buď neúčinná hladina (NOEL)
po orálnom podaní látky, pričom sa sledujú niektoré
znaky toxicity – prírastok na telesnej hmotnosti,
spotreba krmiva, značené enzýmy
LC50 hodnota

 sledovanie reprodukcie – dodatok
k subakútnemu testu – testované látky sú
vtákom podávané orálne najmenej po dobu
20 dní. Nakladené vajcia sa inkubujú umelo
a vyliahnuté mláďatá sa ďalej sledujú
v priebehu 14 dní. Na stanovenie NOEL
hodnoty sa používajú také parametre ako
počet nakladených vajec, hrúbka vaječnej
škrupiny, úhyn vyliahnutých mláďat


Slide 22

Testy na sedimentoch
Hodnotia akútny toxikologický účinok látok na
organizmy bentosu – LC50

 bentické červy

Tubifex tubifex

 larvy hmyzu

Chironomus plumosus
(pakomár dúhový)

 testy na nematódach Panagrellus redivivus


Slide 23

RÝCHLE EKOTOXIKOLOGICKÉ TESTY
Prečo sa používajú rýchle ekotoxikologické
testy ?
Odhad ekotoxicity na rôznych trofických
úrovniach so sebou prináša niekoľko problémov:

 veľmi dlhá doba trvania
 testy sú drahé


potreba rýchlych screeningových testov


Slide 24

Výhody ekotoxikologických biotestov:

sú veľmi praktické
ekologicky signifikantné
lacné
nenáročné na prístrojové vybavenie
Aj napriek výhodám, ktoré tieto testy majú, nie
je na ich základe možné dať definitívnu odpoveď
o toxicite danej látky, ale dá sa z nich stanoviť
potenciálny účinok látky na životné prostredie.


Slide 25

Ekotoxikologické biotesty zaraďujeme do 4 skupín:
I.BATÉRIE EKOTOXIKOLOGICKÝCH BIOTESTOV
VYVINUTÝCH NA UNIVERZITE V GENTE

1.Toxkity využívajúce kľudové štádiá zooplanktónu
a) Thamnotoxkit (kôrovec Thamnocephalus platyurus)
b) Rotoxkit (vírnik Brachionus calyciflorus)
c) Ceriotox (Ceriodaphnia dubia)

2. Toxkity využívajúce riasy a prvoky
a) Algatox (riasa Raphidocelis subcapitata)
b) Test s prvokom Spirostomum ambiguum


Slide 26

II. TOXICHROMOTEST a SOSCHROMOTEXT –
bakteriálne testy na stanovenie toxických látok
vo vodách, pôdach a sedimentoch – využívajú
bakteriálne kultúry E. coli , v ktorej toxikant
inhibuje de-novo syntézu -galaktozidázy


Slide 27

III. BAKTERIÁLNE TESTY TOXICITY – založené na

1. aktivite enzýmov
2. biosyntéze enzýmov
3. rastovej rýchlosti (inhibícia kultúry
a meranie fyziologicých procesov – väčšinou
ATP a CO2)
4. Nitrobacter-test (meranie inhibície
oxidácie nitritov na nitráty)
5. niektoré ďalšie – Polytoxkit – využíva
zmes baktérií z aktivačných nádrží, meria
produkcia CO2;


Slide 28

MetPADTM – využíva mutanta E. coli
špecificky citlivého na ťažké kovy, ktorý
nereaguje na organické látky. Vyhodnotenie sa
robí na základe intenzity purpurového
zafarbenia, ktoré udáva enzymatickú aktivitu
kultúry pod vplyvom testovanej látky
IV. ALTERNATÍVNE BIOTESTY
S FLUORESCENČNE ZNAČENÝMI MARKÉRMI
MUF (metylumbeliferyl-beta-D-galaktozidáza)
aktivita galaktozidáz; FDA (fluoresceidiacetát) –
aktivita proteáz a ďalšie


Slide 29

Dnes aj u nás najčastejšie používaným
screeningovým testom je Microtox
(Microbics UK Ltd. Hitchin, Hertz, UK), ktorý
používa fluoreskujúcu morskú baktériu
Photobacterium phosphoreum. Ak tento
organizmus fluoreskuje je živý a intenzita
fluorescencie klesá pri nepriaznivom účinku
chemickej látky. Test sa využíva pri odhade
možnej toxicity nových chemických látok na
životné prostredie a je veľmi výhodný aj pri
sledovaní účinkov kombinácií látok.


Slide 30

Na použitie rýchlych ekotoxikologických
testov je veľa sporných názorov. Je však
zrejmé, že sa dajú použiť len na základný
screening a nemôžu nahradiť konvenčné
testovacie metódy.
Pokiaľ ide o finančné porovnanie zmienených
biotestov, tak sú o 25 – 30% lacnejšie ako
konvenčné biotesty (napr. na rybách, dafniách,
riasach, horčici). Dôležité je aj to, že pri použití
týchto testov odpadá potreba udržiavania
materskej kultúry experimentálnych
organizmov v období, keď sa nevyužívajú.


Slide 31

ZÁVER
Toxický účinok daného polutanta je do značnej miery závislý od toho, cez aké biomembrány musí penetrovať, akým
spôsobom je testovaným organizmom prijímaný, a pod.
Predpovedná hodnota udávajúca uvažovaný vplyv danej
látky na procesy prebiehajúce v ekosystéme vzrastá
s výpovednou hodnotou použitého biotestu. Výpovedná
hodnota použitej metódy rastie s množstvom informácií,
ktoré boli zahrnuté do kalkulácie predpovede. To sú hlavné
dôvody, prečo sa vždy zapája do batérie niekoľko špecifických biotestov. Sada ekotoxikologických biotestov by mala
zahŕňať orga-nizmy umiestnené na rôznych trofických
úrovniach (vírniky, kôrovce, riasy, baktérie, a pod.). Takáto
batéria potom poskytuje výsledky, z ktorých sa dá predpovedať účinok polutantov ako na človeka (vysoký korelačný
koeficient s testami na hlodavcoch) tak aj na zmeny
v pôdnom alebo vodnom ekosystéme.