Transcript Kovalentní modifikace

Strategie regulace (proteinové) enzymové
aktivity.
1. Reversibilní kovalentní modifikace. Katalytické vlastnosti řady
enzymů se mění po kovalentní vazbě nějaké skupiny na jejich
molekulu – nejčastěji fosforylace. Modifikující enzymy jsou
proteinkinasy a proteinfosfatasy.
2. Allosterická kontrola. Allosterické proteiny obsahují regulační
místa odlišná od substrátových. Allosterický z řečtiny „allos“ = další,
„steros“ = uspořádání. Skládají se z podjednotek (protomerů). Mají
schopnost kooperativity.
Jako příklady enzym aspartáttranskarbamoylasa (ATCasa)
a neenzymový kyslíkový přenašeč hemoglobin.
3. Mnohočetné formy enzymů. Isozymy – jsou homologní enzymy
katalyzující stejnou reakci, ale lišící se jemně ve struktuře a více v
Km a Vlim a regulačních vlastnostech.
• 4. Proteolytická aktivace. Mnoho proteinů je syntetizováno
v neaktivní formě. U enzymů jsou to zymogeny (proenzymy).
Po odštěpení části řetězce přechází zymogen na aktivní
enzym. Jako aktivující složky působí proteolytické enzymy
jako chymotrypsin, pepsin a trypsin. Aktivace je ireversibilní.
Kaspasy, proteolytické enzymy, účastnící se programové
buněčné smrti, jsou aktivovány z formy prokaspas. Dalším
příkladem je kaskáda enzymů při srážení krve.
5. Kontrola množstvím přítomného enzymu-kontrola na
úrovni transkripce. Modul 11, ibiochemie.upol.cz; Regulace
genové exprese. (P. Peč).
1. Regulace enzymové aktivity kovalentní modifikací.
• Nejčastější jsou fosforylace a defosforylace
• Dalším způsobem modifikace je např. acetylace.
Acetylovány jsou histony (pomocné proteiny
obalující DNA v chromosomech a při regulaci genů).
Vysoce acetylované histony spojené s geny jsou
aktivně přepisovány. Enzymy jsou
acetyltransferasa a deacetylasa a jsou regulovány
fosforylací.
• Modifikace není vždy reversibilní. Např. připojení
ubiquitinu k proteinu.
Kovalentní modifikace proteinů – acetylace vedlejšího
řetězce Lys
Sirtuiny: EC 3.5.1.98 histondeacetylasy nebo
histonamidohydrolasy.
Protipólem jsou histonacetylasy EC 2.3.1.48
• Sirtuiny (silent information regulator, SIRT) jsou enzymy
kódované skupinou vysoce konzervovaných genů přítomných v
genomech organismů počínaje archebakteriemi až po
eukaryota.
• Tyto enzymy patří do skupiny NAD+-dependentních
deacetylas katalyzujících deacetylaci různých proteinů
včetně histonů, p53, p300, acetyl-CoAsynthetasy a Rdeacetylacitubulin.
• Schopnost deacetylace širokého spektra substrátů určuje
klíčovou roli sirtuinů při různých biologických funkcích jako
je např. oprava DNA, umlčení transkripce, stabilita genomu,
apoptosa, signál insulinu a mobilizace tuků.
Sirtuiny
• Sirtuiny – regulace umlčování genů. Sirtuiny vyžadují pro
deacetylaci např. histonů NAD+. Tato skupina enzymů slouží
jako citlivý senzor energetického stavu buňky.
• Pokud je k dispozici dostatek živin a metabolismus pracuje na
plné obrátky, vzniká velké množství NADH (inhibitor
sirtuinů). Naopak, pokud nevzniká velké množství NADH nebo
je veškerý NADH převeden na NAD+, díky zvýšené aktivitě
dýchacího řetězce, sirtuiny nerušeně fungují.
• Co sirtuiny umějí ?
• U kvasinek bylo zjištěno, že větší množství sirtuinů vede
k prodloužení života. Omezený přísun potravy (glukosy) vede
k poklesu NADH, sirtuiny jsou aktivovány a deacetylují. Pustí
se do histonů a dalších substrátů, které se podílejí na délce
života.
Sirtuiny
• U savců (u laboratorních myší) je nejdůležitějším enzymem
SIRT1. K jeho substrátům patří proteiny p53 nebo MyoD,
které jsou zapojeny do programované buněčné smrti.
• Další cestou vlivu SIRT je tuková tkáň, kde interaguje
s transkripčním faktorem PPAR gama a touto cestou brání
tvorbě proteinů nutných k syntéze tuků. Tuky jsou místo
uskladňování odbourávány.
• SIRT brzdí programovou buněčnou smrt i diferenciaci,
mobilizuje zásoby tuků a. umožňuje jejich lepší spalování.
Větší počet mitochondrií produkuje méně ROS.
• Účinnost SIRT lze zvýšit podáním resveratrolu, což je
přírodní polyfenolická látka vyskytující se např. v hroznové
slupce a jadérkách. Francouzský paradox !!
Resveratrol
Vysvětlivky k tabulce: Common covalent modification
of protein activity
• Ras = onkogen – rat sarcoma viruses.
• Src = onkogen – Rous sarcoma viruses.
• Myristoyl-CoA = CH3 – (CH2)12 – CO-CoA
• Farnesylpyrofosfát (3 x prenyl, prenylace) –
O-P-O-P
H3C
H3C
CH3
CH3
Fosforylace je vysoce účinný způsob modifikace
regulující aktivitu cílového proteinu.
Pyruvátdehydrogenasakinasa (PDK) EC 2.7.11.2
• PDK inaktivuje pyruvátdehydrogenasu fosforylací za
účasti ATP.
• PDK se podílí na regulaci pyruvátdehdrogenasového komplexu
jehož je PD prvním enzymem. PDK a pyruvátdehydrogenasový
komplex jsou lokalizovány v matrix mitochondrií u eukaryot.
• Komplex převádí pyruvát, jako produkt glykolýzy
vzniklý v cytoplasmě, na acetyl CoA., který je posléze
oxidován v citrátovém cyklu za tvorby energie.
• PDK snižuje oxidaci pyruvátu v mitochondrii a zvyšuje převod
pyruvátu na laktát v cytoplasmě.
• Opačné působení PDK- defosforylace – a aktivace
pyruvátdehdrogenázového komplexu je katalyzováno
fofoproteinfosfatasou nazývanou
pyruvátdehydrogenasafosfatasa.
Regulace pyruvátdehydrogenasového
komplexu
Pyruvátdehdrogenasakinasa (PDK) EC 2.7.11.2
• PDK je stimulována ATP, NADH a acetyl CoA.
• PDK je inhibována ADP, NAD+ CoA-SH a pyruvátem.
•
• PDK je také inhibována farmakem
dichloroacetátem, který je sledován jako
prostředek k léčení několika metabolických
onemocnění – zvláště proti rakovině.
• PDK má čtyři isozymy – PDK1 až PDK4.
Složení pyruvátdehydrogenasového komplexu:
• Pyruvátdehydrogenasa (E1)
• Dihydrolipoyltransacetylasa (E2)
• Dihydrolipoyldehydrogenasa (E3)
• Např. komplex E. coli je 4 600 kD proteinový komplex.
Mitochondriální komplex je 10 000 kD protein, obsahující 20
E2 trimerů obklopených 30 E1 heterotetramery a 12 E3
dimerů.
• Pyruvátdehydrogenasový komplex katalyzuje sekvencí tří
reakcí, sumárně:
Pyruvát + CoA + NAD+ → acetyl CoA + CO2 + NADH
• Komplex využívá pěti různých koenzymů: Thiaminpyrofosfát
(TPP), koenzym A (CoA SH), NAD+, FAD a lipoamid.
17
Thiaminpyrofosfát – TPP, také thiamindifosfát
TDP.
Váže se pevně, ale nekovalentně na
pyruvátdekarboxylasu. Prekurzorem je vitamin
B1 – thiamin.
Nekovalentní vazba TPP na pyruvátdekarboxylasu.
Pyruvátdehydrogenasa (E1)
Pyruvát dekarboxyluje za tvorby
hydroxyethyl-TPP meziproduktu
H3C
R1
R2
N
+
C-
H3C
S E1
R1
TPP E1
+
-
O
C
C
O
O
Pyruvát
20
.
CH3
H
+
CO2
H
R2
N
O
+
C
C
-
S E1
CH3
Hydroxyethyl-TPP E1
Lipoamid a dihydrolipoamid. Lipoová kyselina je
vázána na E2 amidovou vazbou přes e-aminoskupinu
Lys.
Lipoová kyselina
S
S
Lysin
CH2
CH2
CH2
NH
O
CH
CH2
CH2
CH2
C
NH
(CH2)4
CH
C
Lipoamid
O
2H+ + 2eHS
CH2
CH2
HS
CH2
CH2
CH2
CH2
C
Dihydrolipoamid
21
NH
O
CH
NH
(CH2)4
CH
C
O
Hydroxyethylová skupina je přenesena
na dihydrolipoyltransacetylasu (E2).
Hydroxyethylový karbanion je současně oxidován na
acetyl a lipoamid redukován na disulfid.
H3C
H3C
R1
H
R2
N
O
+
C
C
-
S E1
CH3
H3C
+
H
R1
H
R2
N
O
+
C
C
S
S
S
HS
E2
Lipoamid-E2
S E1
R1
H+
R2
N
+
C
-
S E1
TPP E1
+
CH3
O
C
CH3
S
E2
HS
E2
Acetyl-dihydrolipoamid-E2
22
E2 (Dihydrolipoyltransacetylasa) poté katalyzuje
transesterifikací, při které se acetyl přenese na CoA
za tvorby acetyl-CoA.
O
CoA
O
CoA
SH
C
CH3
HS
HS
HS
Acetyl-dihydrolipoamid-E2
C
CH3
Acetyl-CoA
S
E2
23
S
+
E2
Dihydrolipoamid-E2
Regenerace lipoamidu na E2.
Reoxidace probíhá přes kovalentně vázaný FAD.
FAD
S
HS
+
S
E3 (oxidovaná forma)
24
FAD
SH
HS
E2
S
+
SH
E3 (redukovaná forma)
S
E2
Reoxidace redukovaného E3
(Dihydrolipoyldehydrogenasa ).
Elektrony z FADH2 se přenáší na NAD+ za tvorby NADH.
FAD slouží spíše jako vodič elektronů !!!
FAD
FADH2
FAD
SH
S
S
SH
S
S
+
NAD
E3 (redukovaná forma)
25
+
NADH + H
E3 (oxidovaná forma)
Aktivní místo dihydrolipoamiddehydrogenasy.
FAD
NAD+
Cys43
Cys48
Tyr 181
Lipoyllysylové raménko E2 (2x)
S
• Raménko přenáší
meziprodukty
reakce mezi
jednotlivými
enzymy.
HC
S
CH2
CH2
H2C
CH2
H2C
CH2
140 nm
O
C
NH
H2C
CH2
H2C
CH2
HC
C
O
27
N
H
Lipoyllysylové raménko
(plnì roztažené)
Animace PD
•
http://www.brookscole.com/chemistry_d/templates/student_resources/shared_r
esources/animations/pdc/pdc.html
Toxicita arsenitanu a organických sloučenin arsenu.
Inhibují pyruvátdehydrogenasu
a 2-oxoglutarátdehydrogenasu a tím i respiraci.
OH
-
O
As
OH
+
HS
S
-
O
HS
As
S
R
Arsenitan
R1
As
O
2 H2O
+
H2O
R
Dihydrolipoamid
+
Organická
slouèenina arsenu
29
+
HS
S
R1
HS
As
S
R
R