Transcript Reakční kinetika enzymových reakcí

Reakční kinetika enzymových reakcí;
regulace činnosti enzymů
Reakční kinetika enzymových reakcí
invertasa
sacharosa + H2O  glukosa + fruktosa
hexosafosfátisomerasa
D-glukosa-6-fosfát  D-fruktosa-6-fosfát
Reakční kinetika enzymových reakcí
Časová závislost koncentrace substrátu [S] a produktu [P]
monomolekulární přeměny S  P.
k1 = 0,01 s-1, k-1 = 0 s-1 pro případ 1 ("nevratná reakce")
k1 = 0,006 s-1 a k -1 = 0,00375 s-1 pro případ 2 (vratná reakce)
[S] a [P] [mol/l]
0,2
0,18
1[ P]
0,16
0,14
0,12
0,1
2[ P]
2[ S]
0,08
0,06
0,04
1[ S]
0,02
0
0
100
200
300
t [s]
400
500
600
Reakční kinetika enzymových reakcí
monomolekulární přeměna S  P
dci
v =
i. dt
Základní definice:
d [S ]
d[P]
v =
= dt
dt
pro náš případ:
Základní model:
k1
E+S
k2
ES(EP)
k -1
P+E
k -2
Zanedbat zpětnou reakci?
k1
E+S
k-1
k2
ES  P + E
Další důležité pojmy:
definice limitní rychlosti:
Vlim = k2 . [Eo]
když [E0] = [ES]
V lim
 k 2  kcat = číslo přeměny = molekulová (molární) aktivita enzymu
[ Eo ]
počet molů substrátu, které je 1 mol enzymu schopen přeměnit při saturaci
substrátem za jednotku času = kolik molekul substrátu je za stejných podmínek
schopna přeměnit 1 molekula enzymu za jednotku času
Katalytická aktivita enzymového preparátu
( množství aktivního enzymu)
K čemu to? - kupuji enzym (cena za jednotku)
- kolik potřebuji enzymu pro reakci
- koncentrace katalytické aktivity (kat/ml) - klin. biochemie
Katalytickou aktivitu 1 katalu (1 U) vykazuje enzymový preparát, který za
definovaných podmínek (pH, pufr, teplota) při nasycení substrátem přemění 1 mol
(1 mol) substrátu za 1 sec (1 min).
Číslo přeměny = molekulová (molární) aktivita enzymu
Reakční kinetika enzymových reakcí
Reakční kinetika enzymových reakcí
Jak určit hodnoty KM a Vlim?
metoda počátečních reakčních rychlostí: závislost vo na [S]
Metoda nelineární regrese:
Odhad KM = 1,8 mmol.dm-3 a Vlim = 2,5 mmol.dm-3.min-1
"Správné" hodnoty: KM = 2,04  0,43 mmol.dm-3,
Vlim = 2,04  0,16 mmol.dm-3.min-1
2
vo [mmol/l/min]
1,6
1,2
Michaelisovská závislost počáteční
reakční rychlosti na koncentraci
substrátu.
0,8
0,4
0
0
1
2
3
[S] [mmol/l]
4
5
6
Závislost počáteční reakční rychlosti na pH a teplotě
VÍCESUBSTRÁTOVÁ KINETIKA
- následný mechanismus (postupný, sekvenční)
A
- náhodný
- uspořádaný
E
E
B
P
EAB
- "ping-pongový"
E-P + S1  E-P* + P1
E-P* + S2  E-P + P
S1 + S2  P1 + P2
EPQ
E
Q
Q
"ping-pongový„ mechanismus
"NEMICHAELISOVSKÉ" ENZYMY
počáteční reakční rychlost
[mol/l/min]
1
3
0,8
2
0,6
1,5
1
0,4
0,2
0
0
5
V lim.[S ]
vo =
K + [S ]n
n
10
[S] [mmol/l]
- positivní homotropní allosterický efekt (allosterické
enzymy)
Alosterické enzymy
Regulace enzymové
aktivity
Regulace enzymové aktivity
• na úrovni transkripce a translace (konstitutivní a induktivní)
• pomocí změn kovalentní struktury (řízeno specifickými
enzymy)
- nevratné (aktivace štěpením peptidové vazby - proenzymy)
- vratné (fosforylace, adenylace...)
• efektory (aktivátory a inhibitory)
Regulace enzymové aktivity
INHIBICE:
- nevratná
- vratná:
a) substrátem
b) kompetitivní (competitive)
c) akompetitivní (acompetitive)
d) nekompetitivní (noncompetitive)
Kompetitivní inhibice
[ E ].[ I ]
KI =
[ EI ]
 [ I ]
KM´ = KM .1 +  ,

KI 
V lim.[S ]
vo =
 [ I ]
KM . 1 +   [S ]

KI 
V´lim = Vlim
Kompetitivní inhibice
Akompetitivní inhibice
V lim
.[S ]
 [ I ]
1 + 

KI 
vo =
KM
 [S ]


[ I ]

1
+


KI 

KI =
[ ES ].[ I ]
[ ESI ]
Akompetitivní inhibice
Nekompetitivní inhibice
[ E ].[ I ] [ ES ].[ I ]
KI =

[ EI ]
[ ESI ]
KS =
V lim.[S ]
vo =
 [ I ]
 1 +  .  KS + [S ]

KI 
[ E ].[S ] [ EI ].[S ]

[ ES ]
[ ESI ]
V lim
V´lim =
[I ]
(1 )
KI
Nekompetitivní inhibice
Regulace enzymové aktivity
Allosterická inhibice (aktivace)
Příklad
Při studiu enzymové reakce byly pro následující výchozí
koncentrace
substrátu změřeny počáteční rychlosti reakce:
S [mol/dm3]
vo [nmol/dm3 . min]
6,25 .10-6
15
7,5 . 10-5
56,25
1,0 .10-4
60
1,0 .10-3
74,9
1,0 .10-2
75
a) Odhadněte hodnoty Km a Vlim.
b) Jaká bude počáteční rychlost při koncentracích substrátu
2,5 . 10 –5 a 5 . 10-5 mol/dm3 ?
Imobilizované enzymy
Definice IUPAC - enzymy, které jsou fyzicky ohraničeny nebo lokalizovány,
zachovávají si svoji aktivitu a mohou být použity opakovaně a kontinuálně
Imobilizace enzymů
Vazba na nosič
sorpcí
Kovalentní vazbou
Zachycení (entrapment)
V matrici gelu
Opouzdření
(encapsulation)
Biotechnologie
Definice?
Aplikace biologických vědních oborů a inženýrských disciplin k přímému
nebo nepřímému využití živých organismů nebo jejich součástí v jejich
přirozené nebo modifikované podobě.
Přednosti:
surovinová základna, energetická nenáročnost, šetrnost k životnímu
prostředí
Nevýhody:
Vysoké náklady na V a V, malá efektivnost?
Biotechnologické směry
1. Průmyslová mikrobiologie
a) Fermentační (ethanol, kyselina citronová)
b) Produkty biosynthes (primární a sekundární metabolity,
biopolymery),
c) Biotransformace
d) Biomasa
2. Průmyslové biotechnologie
3. Biotechnologie životního prostředí (bioremediace)
4. Živočišné biotechnologie
5. Biotechnologie užitkových rostlin
6. Veterinární a medicínské biotechnologie
Využití enzymů → aplikovaná enzymologie
využití enzymů, resp. enzymových systémů, včetně celých buněk:
 průmysl potravinářský a nepotravinářský
 klinická biochemie (diagnostika a stanovení analytů)
 farmaceutika
Technologicky významné enzymy
 Hydrolasy (80%) – 50% proteasy, 50% glykosidasy
 Isomerasy GI (12% !)
 Oxidoreduktasy – (GOD - analytika)
 Ostatní (5 - 7%)
Zdroje technických preparátů enzymů:
Mikrobiální (bakterie a plísně) - extremofilní MO
rekombinantní technologie
živočišné a rostlinné
Příklady
 Biodetergenty
(proteasy, amylasy, lipasy, celulasy, peroxidasy)
 Hydrolýza škrobu (amylasy, GI, transferasy)
 Mlékárenství (chymosin)
 Hydrolýza proteinů
……. až po „biostoning“ (celulasy)