Transcript VSCHT Biomat 2010_Ulbrich

Transport léčiv na polymerních
nosičích
Kurz „Biomateriály“, VŠCHT Praha
Karel Ulbrich
Ústav makromolekulární chemie AV ČR
Obsah přednášky
• Úvod do problematiky polymerních nosičů
biologicky aktivních molekul
• Přehled systémů pro řízené uvolňování léčiv
• Polymerní konjugáty biologicky aktivních molekul
(léčiv), protinádorová terapie
• Polymery pro diagnostiku
• Polymery při přípravě vektorů pro genové terapie
• Závěr a výhledy
Proč polymery? Co umožní použití syntetických polymerů
při přípravě léčiv a lékových forem?
Klasické nízkomolekulární léčivo
Polymerní formy léčiv
Konc
řízené uvolňování
protrahovaný účinek
0
4
řízené uvolňování
8
čas [ hod]
dny - rok
cílený transport
• Paul Ehrlich, 1908 „Magic Bullet“
• Helmut Ringsdorf, 1976 model polymerního
léčiva
• Nový obor zabývající se systémy pro dopravu
léčiv „Drug delivery systems“
• Controlled Release Society
Advances in Drug Delivery Reviews
Crical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems
Journal of Controlled Release
Journal of Drug Targeting
Journal of Bioactive and Compatible Polymers
Biomacromolecules
Bioconjugate chemistry
Macromolecular Bioscience
Biomaterials
Požadavky na „ideální“ léčivo
 Biologicky aktivní látka (BAL, léčivo) je v lékové formě
neaktivní, bez jakéhokoliv vlivu na organizmus (buňky
imunitního systému, neukládá se v játrech, není vyloučeno
ledvinami)
 v této formě je specificky dopraveno do místa
požadovaného účinku (orgán, tkáň, buňka)
 aktivuje se pouze v místě požadovaného účinku, působí v
požadované koncentraci
 působí po dobu optimální pro dosažení maximálního
léčebného účinku
 léčivo, metabolity a všechny komponenty nosičového
systému jsou po dosažení efektu eliminovány z organizmu
Polymerní systémy umožňující řízené uvolňování
biologicky aktivních látek
Systémy s řízeným
uvolňováním BAL
Systémy pro cílený transport
a řízené uvolňování BAL
• olejové kapky
• nano- a mikročástice, nanokapsule
• kapsule a potahované systémy
• micely
• matricové systémy
• liposomy
• membránové systémy
• „prodrug“ systémy (ADEPT)
• mikroreservoáry
• rozpustné polymerní nosiče léčiv a
konjugáty polymeru s proteinem
• systémy s aktivovaným
uvolňováním
• polymerní systémy pro dopravu
genu (genová terapie)
Olejová kapka
léčivo
koncentrace
Olejové kapky
voda
čas
Rychlost uvolňování řízena difuzí
závisí na rozdělovacím koeficientu olej-voda a rozpustnosti léčiva
Materiál: sezamový olej, olivový olej, nízkomolekulární poly(orthoestery)
Aplikace: transdermální, orální, parenterální podání
Léčiva: léky nerozpustné nebo málo rozpustné ve vodě
Consumpren (Cyclosporine - cyklický dekapeptid), Taxol, Docetaxel v
oleji Lipidoil nebo Cremofor
Dispergované
léčivo
Polymerní
vrstva
koncentrace
Tablety, kapsule a potahované systémy
Polymerní
matrice
čas
Materiál:
Uvolňování léčiva:
- rychlost rozpouštění matrice
- rychlost rozpouštění potahu
- difuzí léčiva
Použití: orální podávání
Potah: želatina, polysacharidy, algináty,
síťovaný albumin, Eudragity - kopolymery
na bázi akrylátů a methakrylátů
Matrice: Poly(ethylen oxid),
Poly(vinylpyrrolidon)
Poly(vinylalkohol)
Eudragity
CH2
CH2
C
CH3
R1
CH3
C
CH2
C
CH3
R1
CH2
C
CH2
R1
C
CH2
C
CO
CO
CO
CO
CO
CO
OH
O
O
O
O
O
CH3
CH2
CH3
CH2
CH3
CH2
R1 = H, CH3
a)
N
CH3
CH2
CH3
CH3
b)
Eudradit L
Eudradit E
Stálý v kyselém prostředí
Rozpustný v alkalickém
prostředí
Rozpustný v žaludku
Maskování chuti léčiv
Ochrana proti vlhkosti
N
CH3
Cl-
CH3
c)
Eudradit RL
Nerozpustné, botnají,
zpožděné uvolňování
Matricové systémy
Řízená difuze
Uvolňování: řízeno difuzí
koncentrace
a) Nedegradovatelné
čas
Materiál: Silikony, Polymethakryláty, polyakryláty, kopolymery vinylacetátu
Aplikace: implantáty umožňující uvolňování léčiva po dobu i několika let
poševní kroužky (hormonální antikoncepce) NuvaRing®
silikonový kaučuk obsahující levonorgestrel, megestrol acetate,
progesterone (uvolňování po dobu 90 dnů s rychlostí uvolňování 20
μg/den
Matricové systémy
b) Degradovatelné – hydrofóbní polymer, povrchová erose polymeru
Materiály: PLA/PGA kopolymery, poly(anhydridy),
poly(orthoestery)
Uvolňování: kombinace difuze a degradace, podle
povahy léčiva
Atridox®
PLA
Doxycyclin
Onemocnění dásní
Nutropin Depot®
PLGA
růstový hormon
malý vzrůst
Lupron Depot®
PLA
leuropeptide
rakovina prostaty
Zoladex®
PLA
goserelin
rakovina prostaty
Gliadel® degradovatelný polymerní implantát na bázi polyanhydridů
léčivo – Carmustine, BCNU, léčbě mozkových nádorů
O
O
C
O
O
(CH2)3
bis-phenoxykarboxypropan
20 %
O
C
O
O
O
C
(CH2)10 C
anhydrid kyseliny sebakové
80 %
Matricové systémy
b) Degradovatelné – hydrofilní gely, botnání, které vede až k rozpuštění gelu
Materiál:
Hydrogely na bázi kopolymerů
(2-hydroxyetyl)methakrylátu
N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu
Uvolňování:
kombinace difuse a degradace gelu
Studovány gely obsahující kyselinu 5-aminosalicilovou,
degradovatelné azoreduktásami přítomnými v tlustém
střevě
„Smart systems“, řízené uvolňování inzulinu z
matrice s imobilizovanou glukosoxidásou
Membránové systémy pro dopravu léčiv
zásobník léčiva
membrána
léčivo uvolňováno difusí přes membránu
Poly(ethylenglykolmethakrylát)
kopolymer ethylen-vinylacetát,
silikonový kaučuk,
síť. albumin
Transdermální systémy - náplasti
Výhody:
•
•
•
•
•
•
•
Nezatěžuje GI trakt
Prodloužená doba účinku
Umožňuje aplikaci pacientem
Neinvazivní metoda
Zvyšuje pohodlí pacienta
Snižuje vedlejší účinky
Jednoduché odstranění zdroje
léčiva
Nevýhody:
•
Nízká prostupnost větších molekul přes
pokožku
Používání látek zlepšujících průnik léčiva
pokožkou (DMSO)
Dráždění pokožky
Malá kapacita léčiva
•
•
•
Typy transdermálních systémů - náplastí
Náplasti s polymerní matricí
Roztok nebo suspenze léčiva je dispergován v polymerní matrici
Náplasti s kapalným zásobníkem léčiva
Roztok nebo suspenze léčiva je umístěn mezi ochrannou vrstvou a membránou, která
řídí rychlost
Náplasti s několika vrtvami polymerní matrice
Léčivo dispergováno v adhezivní vrstvě i v polymerní matrici, oddělené membránou
Náplasti s léčivem v adhezivní části
Léčivo dispergováno v adhezivní vrstvě, v přímém kontaktu s pokožkou
Polymerní matrice
Zásobník léčiva
Několika vrstevnaté
Krycí
vrstva
Léčivo
Membrána
Léčivo v adhezivní vrstvě
Adhezivní
vrstva
Pokožka
Název
Ochranná
vrstva
Zásobník nebo
matrice s
léčivem
Membrána
Adhezivní
vrstva
Transderm
Scop®
Aluminizovaný
polyester
scopolamine
light mineral oil
polyisobutylene
mikroporézní
polypropylén
light mineral oil
polyisobutylene
Nicorette®
polyester
Nikotin
polyisobutylene
polyisobutylen
polybutylen
Deponit®
polypropylén
nitroglycerin
polyakrylát
polyisobutylen
E-Trans® systém umožňuje dopravu širšího spektra léčiv s terapeuticky
dostatečnou rychlostí
Zvýšení průniku léčiva přes pokožku – iontoforéza, elektroporace, ultrazvuk
Systémy s aktivovaným uvolňováním
Orálně aplikovatelné systémy pro řízené uvolňování léčiv OROS® a OROS® Push-PullTM
Uvolňování léčiva je řízeno osmotickým tlakem
roztok
léčiva
roztok
léčiva
jádro s roztokem
léčiva
Zásobní
roztok léčiva
pružná
diafragma
polopropustná
membrána
polopropustná
membrána
OROS®
osmotické jádro,
osmoticky
aktivní sůl
OROS® Push-PullTM
Systémy s aktivovaným uvolňováním
Implantáty - uvolňování léčiva je řízeno osmotickým tlakem
Osmotická pumpa
„Alzet“
Protilátky, chemotherapeutika, cytokiny, růstové
faktory, hormony a peptidy
Nano a mikročásticové systémy
Nanočástice: 5 – 1000 nm, mikročástice: 1 - 250 mm
pasivní směrování: 10 - 1 000 nm játra, RES
4 - 200 mm
plíce
aktivní směrování: magnetit Fe3O4
Původně: Polymethylmethakrylát, polystyren
poly(2-hydroxyethyl)methakrylát
mikrosféry
Biodegradovatelné: polykyanoakryláty,
polyestery (PLA, PGA a jejich kopolymery),
polyanhydridy, polyfosfazény.
Albumin, želatina, ethylcelulosa, algináty
mikrokapsule
Materiály pro přípravu nanočástic a nanokapsulí
Syntetické hydrofobní polymery
•
Biodegradovatelné – polyestery (PLA, PGA, PLGA), polyanhydridy,
poly(ortho estery), polykyanoakryláty
O
CH2
C
O
CH3
O
CH
C
O
•
O
O
O
C
O
O
O
O
(CH2)4
O
C
O
R
Nebiodegradovatelné – silikonový kaučuk, polymethylmethakrylát,
kopolymer ethylén - vinylacetát
CH3
Si
CH3
CH3
O
CH2
C
CH2
CH2
CH2
CH
CO
O
O
CO
CH3
CH3
Přírodní hydrofilní materiály (hydrogely)
albumin, želatina, karboxymethyl celulóza, dextrany, chitosan, algináty, hyaluronová
kyselina
Hyaluronová kyselina
Skládá se z disacharidických jednotek
glukoronové kyseliny a N-acetylglukosaminu
Algináty: inearní kopolymer s
homopolymerními bloky (1-4)-vázaného
ß-D-mannuronátu (M) a jeho C-5
epimeru α-L-guluronátu (G)
Chitosan: lineární polysacharid
skládající se z náhodně
distribuovaných ß-(1-4)-vázáných Dglukosaminových a N-acetyl-Dglukosaminových jednotek
Syntetické hydrofilní materiály, rozpustné polymery a
hydrogely
hydrofilní polymery
• vodorozpustné poly(ethylén oxid), poly(α-aminokyseliny),
poly(vinylpyrrolidon), poly[N-(2-hydroxypropyl)methakrylamid] (HPMA, )
CH3
CH2
CH2
O
NH
CH
R
CO
CH2
O
CH
N
CH2
C
CO
NH
CH2
CH
CH3
•
hydrogely poly(2-hydroxyehtylmethakrylát) (HEMA), HPMA atd.
Požadavky na polymery: netoxické, biokompatibilní a neimunogenní
OH
Micelární systémy
blokové kopolymery typu A-B nebo A-B-A
hydrofilní řetězec, PEG, PVP, PHEGlu
hydrofobní řetězec, PMM, PS, PBzGlu, PBzAsp, PLA, PGA
CH3 O
(CH2 CH2 O)n
CH2 CO
(NH
CH
CH2
kritická micelární koncentrace
pro polymery 10-6 – 10-7 mol/L.
CO
DOX
CO)n
Liposomální systémy
uměle připravené sférické částice o průměru okolo 0,1 – 1 μm tvořené membránou
z fosfolipidové dvojvrstvy, podobné buněčné membráně
hydrofilní hlava
O
O-
hydrofobní „ocas“
P
O
CH2
O
CO
CH
CH
CH
CH
CH
(CH2)12 CH3
CH
O
CO
CH
CH
CH
CH
CH
(CH2)12 CH3
CH2
O-
hydrofilní léčivo
Příklad:
Myocet®, Doxil®
Doxorubicin.HCl
hydrofobní léčivo
AmBisome®
amphotericin B
poly(ethylen oxid)
Druhy liposomů
klasický
imunoliposomy
+
+
+
+
+
„Stealth“ dlouhocirkulující
kationtové
+
Myocet® – liposomální doxorubicin,
Doxil® – pegylovaný liposomální doxorubicin, pro léčbu metastázující rakoviny prsu
N-(carbonyl-methoxypolyethylene glycol 2000)-1,2-distearoyl- sn -glycero3-phosphoethanolamine sodium salt (MPEG-DSPE), 3.19 mg/mL; fully
hydrogenated soy phosphatidylcholine (HSPC), 9.58 mg/mL; and
cholesterol, 3.19 mg/mL.
O
O
HSPC
CH3
H3C
N+
CH2CH2O
CH3
H2C
OC(CH2)nCH3
O-
HC
OC(CH2)mCH3
P
OCH2
O
O
H2C
OC(CH2)16CH3
O-
HC
OC(CH2)16CH3
P
OCH2
MPEG-DSPE
CH3[OCH2CH2]nOCNHCH2CH2O
n = 45
O
O
O
m, n = 14 nebo 16
O
O
OH
C
CH2
OH
H3C
O
O
OH
O
O
CH3
HO
NH2. HCl
Doxorubicin.hydrochlorid
OH
více než 90 % DOX.HCl
je v liposomu
rozměr 100 nm
„Prodrug“ systémy (ADEPT)
„antibody-directed enzyme prodrug therapy“
E
AlaAla--DOX
E
Ab
Ab
E
E
Ab
Ab
nádorová buňka
AlaAla--DOX
DOX
neaktivní
průnik do buňky
zánik buňky
aktivní
E
E
E
Ab
Ab
Ab
Enzym
Alkalická fosfatáza
Karboxypeptidáza A
Neaktivní léčivo
Doxorubicin fosfát
Methotrexát-alanin
Aktivní léčivo
Doxorubicin
Methotrexát
Vodorozpustné polymerní konjugáty
s léčivy, polymerní diagnostika
Požadavky na „ideální“ léčivo
 Biologicky aktivní látka (BAL, léčivo) je v lékové formě
neaktivní, bez jakéhokoliv vlivu na organizmus (buňky
imunitního systému, neukládá se v játrech, není vyloučeno
ledvinami)
 v této formě je specificky dopraveno do místa
požadovaného účinku (orgán, tkáň, buňka)
 aktivuje se pouze v místě požadovaného účinku, působí v
požadované koncentraci
 působí po dobu optimální pro dosažení maximálního
léčebného účinku
 léčivo, metabolity a všechny komponenty nosičového
systému jsou po dosažení efektu eliminovány z organizmu
Schéma klasického polymerního léčiva
Léčivo
Biodegradovatelná spojka
(fosfát, cukr, oligopeptid,
hydrolyticky štěpitelná spojka)
Směrující struktura: sacharid, lektin, protilátka
(IgG a fragmenty), hormon, specifický oligopeptid
Schéma struktur polymerních konjugátů založených na
multivalentním prekurzoru
(a) Gd (MRI)
(b) Radionuklid
(c) Fluorescenční
značka
Lipofilní
substituent
HPMA
kopolymer
Reaktivní
skupina
Dedegradovatelná
spojka
Adenovirus
(genová
terapie)
Léčivo
Protilátka (peptid)
(směrující skupina)
Roubovaný
polymer (pasivní
směrování)
Multivalentní HPMA kopolymery používané pro syntézu polymerních
konjugátů (příklad nejpoužívanějších struktur)
Příprava klasickou a nebo řízenou (RAFT) radikálovou polymerizací
CH3
CH2
C
CH2
CO n
NH
CH3
C
C=O
O
CO
C=O
m
NH2
O
CH2
CH OH
N
O
N
CH3
O
NO2
S
S
CH3
CH2
C
C
CH3
CH2 C
CH3
x
CH2 C
CH3
y
CH2 C
z
CO
CH
NH
NH
CH3
CH2
CH2 5
CO
Gly
Gly
CH3
x
C
O
b
OH
NH
NH
NH
CO
NH
NH
CH2
(CH2)2
CO
NH2
CH2
C
CH2
SH
(CH2)2
S
NH
R-C=O
O
CH2
CO
OH
CH2 C
NH
CO
HC
CH3
+
NH2
S
SH
Cl
N
3
O
N
O
Semitelechelické reaktivní polymerní prekursory syntézy
polymerních konjugátů léčiv (HPMA kopolymery)
S
(a)
(a) Bifunkční iniciátor
(b) Polymerizace s přenosem
(c) Řízená polymerizace (RAFT)
S
CH3
S
N
CH2
CH3
N
CN
O
S
CH2
N
CN
N
O
S
(b)
HS-(CH2)2-COOH
CH3
CH2 C
CH2
CH3
x
CO
CH2 C
NH
CH2
CH2
CH3
CN
C
C
CO
CO
CH3
NH
Gly
N
CH2
Phe
y
S
CH
S
CH2
C
OH
Leu
CH3
OH
CO
NH
NH2
NH
HO
CH3
5
Polymer s
funkčními
skupinami
O
(CH2 )2
C
O
CH3
O
O
OH
O
O
C
OH
O
OH
N
S
Polymer s
navázaným léčivem
a koncovou funkční
skupinou
Gly
CO
NH
HC
CH3
CH3
CH2
OH
Možnosti uvolňování léčiva z polymerního
nosiče
(b)
(c)
(a)
Cévy
a)
b)
c)
Uvolnění v krevním řečišti
Uvolnění ve tkáni po extravazaci
Specifické uvolnění v cílových buňkách po
endocytose
Cévy
Interakce polymerních léčiv s buňkami
Uvolnění léčiva (a) hydrolýza v endosomech,
(b) enzymolýza v sekundárních lysosomech
lysosom
primární endosom
pH 5 - 6
Jádro
sekundární lysosom,
pH 5, enzymy
Hlavní požadavky kladené na polymerní
nosiče léčiv
• Stabilita v průběhu transportu = chemická vazba
léčiva na nosič
• Řízené uvolnění léčiva z nosiče (chemická
hydrolýza, enzymolýza)
• Cílený transport k nádoru, nádorovým buňkám
(pasivní směrování pomocí EPR efektu, aktivní
směrování směrující strukturou)
• Eliminace nosiče z organizmu (degradovatelný
nosič, micelární nosič)
Schéma klasického konjugátu poly(HPMA) s
kancerostatikem doxorubicinem
(enzymatická aktivace léčiva)
CH3
CH2
CH3
C
C
CH2 C
O
C
x
O
a
NH
CH2
CH
OH
HO
CH3
NH
CH3
O
O
OH
O
OH
O
OCH3
HO
HO
CH2
C
O
Enzymaticky degradovatelný
oligopeptid: -GlyPheLeuGly-
Místo enzymatického štěpení
Schéma hydrazonového konjugátu poly(HPMA) s
kancerostatikem doxorubicin (pH závislá
hydrolytická aktivace léčiva)
CH 3
CH 2
CH 3
C
C
CH 2
O
C
C
x
O
a
NH
CH 2
CH
OH
NH
CH 3
N
O
OH
C
CH 2
OH
OH
O CH
3
O
H
OH
O
O
CH
3
OH
NH 2 . HCl
Jednoduchá vazba nebo spacer
Místo hydrolytického štěpení
Hlavní požadavky kladené na polymerní
nosiče léčiv
• Stabilita v průběhu transportu (chemická vazba
léčiva na nosič)
• Řízené uvolnění léčiva z nosiče (chemická
hydrolýza, enzymolýza)
• Cílený transport k nádoru, nádorovým buňkám
(pasivní směrování pomocí EPR efektu, aktivní
směrování směrující strukturou
• Eliminace nosiče z organizmu (degradovatelný
nosič, micelární nosič)
Princip enzymaticky řízeného uvolňování léčiva z
polymerního nosiče
polymer
Gly-Phe-Leu-Gly--- NAp
Model léčiva, léčivo (DOX)
Spojka (oligopeptid)
P4
P3
P2
P1
P1´ P2´ P3´
S4 S3 S2 S1 S1´ S2´ S3´
Aktivní místo enzymu (proteázy)
ENZYM
Substrát (oligopeptid)
Uvolňování DOX z polymerů při inkubaci PHPMA-X-DOX
konjugátů se směsí lysosomálních enzymů - tritosomů
70
60
GLFG
% volného DOX
50
GFLG
GLG
GFG
GG
40
30
20
10
0
0
10
20
30
40
50
60
čas, h
STRUKTURA
% UVOLNĚNÉHO DOXORUBICINU V SÉRU
3h
6h
24 h
-GFLG-
0.7
0.8
1.9
-GLFG-
0.5
0.5
1.5
-GG-
0
0.1
0.2
Uvolňování DOX z hydrazonových polymerů
inkubovaných ve fosfátových pufrech o různém pH
100
pH 5.5
90
80
DOX released, %
70
60
GFLG
GLG
50
Gly-Gly
Gly
40
Aminobenzoic
Acap
30
pH 7.4
20
10
0
0
10
20
30
Time, h
40
50
Hlavní požadavky kladené na polymerní
nosiče léčiv
• Stabilita v průběhu transportu (chemická vazba
léčiva na nosič)
• Řízené uvolnění léčiva z nosiče (chemická
hydrolýza, enzymolýza)
• Cílený transport k nádoru, nádorovým buňkám
(pasivní směrování pomocí EPR efektu, aktivní
směrování směrující strukturou)
• Eliminace nosiče z organizmu (degradovatelný
nosič, micelární nosič)
Princip pasivního směrování – akumulace
polymerů v pevných nádorech (EPR efekt)
(H. Maeda a kol.)
Normální tkáň
Málo propustný
endothel
Fungující lymfatický
systém
Nádorová tkáň
Porézní kapilární
systém
Těsné kapiláry nebo chybějící
lymfatický systém
Distribuce poly(HPMA) v myších (EPR efekt),
Sarkom 180 (melanom B16F10)
(i.v. injekce polymeru)
20
18
556 000
Accumulated Polymer, %/g of mice
16
148 000
14
78 000
40 000
12
22 000
10
8
6
4
2
0
Tumour
Spleen
Kidney
Muscle
Liver
Skin
Blood
Konjugáty umožňující pasivní směrování
do nádorů
Nedegradovatelné polymerní nosiče
(limit Mw ~ 50 000 g/mol)
PEG
PEG
Micelární nosiče léčiv
PEG
Multiblokové biodegradovatelné nosiče
Biodegradovatelné vysokomolekulární
polymerní nosiče
Syntéza roubovaných konjugátů s řízeným
uvolňováním Dox a řízenou biodegradací
NH
NH2
A)
CH 3
S
CH 3
CH 3
CH 2 C
CH 2 C
x
y
CO
CO
NH
NH
CH 2
CH 2
HC
CH 3
CH 2 C
5
+
x
x
CH 2 C
CO
NH
NH
Gly
CH 2
CH 2
OH
CH 3
NH
CH 2
CH 2
HC OH
CO
CH 3
NH
5
CO
Leu
NH
Gly
NH
NH
Boc
CH 2
CH 2
Boc
NH 2
CH 3
N
y
S
CH 2 C
S
+
CH 2 C
y
CH 2 C
CO
CO
NH
NH
Gly
CH 2
CH 2
OH
CH 3
NH
G
F
L
G
5
Dox=NNH
Dox=NNH
B)
z
Leu
NH
Gly
NH
NH
Boc
CH 2
+
CH 2
SH
NH
N=Dox
NH
S
NH2
S
NHN=Dox
Dox=NNH
NH
C
NH2
NH
S
S
Phe
CO
NH
N=Dox
S
S
CH 2
Boc
NH
G
N=Dox F
L
G
NHN=Dox
CH 3
CO
HC
5
CH 3
x
z
Phe
NH
CO
NH
CH 2 C
CO
NH
CH 2 C
y
NH
N=Dox
G
L
F
G
CH 3
CO
HC
CH 3
CO
S
N
CO
OH
CH 3
CH 2 C
CH 3
+
NH 2 Cl
3
Dox=NNH
NHN=Dox
Struktura micelárního PHPMA-DOX konjugátu
(s cholesterolem a pH-řízeným uvolňováním DOX)
CH3
CH3
O
CH3
x
O
HN
y
O
HN
z
HN
HO
CH3
Vodné prostředí
O
O
O
NH
N
OH
OH
O
HO
H
O
I = 1.8
H3 C
OH
OCH3
Mw(pol) = 32 kDa
Mw(mic) = 170 kDa
O
CH3
HO
H3C
[DOX] = 7 wt%
H3 C
NH2 . HCl
CH3
CH3
[cholesteryl] = 3.5
%mol
dmic = 22 nm
14
intenzity (AU)
O
12
10
8
6
4
2
0
1
RH 10
(nm)
100
Dendritické polymery, syntéza
Polyamidoaminové
jádro
NH 2
H 2N
NH 2
HN
NH 2
G1
O
O
N
H
N
N
O
S
S
N
H
N
O
NH
CH 3
x
H
N
O
O
NH
NH 2
PAA dendrimer druhé
generace
Mw~80 000 - 150000
In~1.8 to 2.3
Rh~8 - 10.5 nm
NH 2
CH 2 C
CO
CO
NH
NH
HC
CH 3
CH 2
OH
NH 2
H
N
O
HN
O
N
y
S
HN
HN
O
N
H
H 2N
5
CO
O
H 2N
N
NH
Boc
Semitelechelický HPMA
kopolymer
NH
N
H
S
S
N
H
N
N
H
N
O
H 2N
HN
NH 2
N
H
N
O
O
NH
N
H
NH
NH 2
N
O
HN
NH 2
PAA dendrimer třetí
generace
Mw~120 000 - 250000
In~2.0 to 2.6
Rh~10 - 14 nm
NH 2
NH 2
O
O
O
H 2N
H
N
O
O
H
N
MW~3300
Diameter~ 2.9 nm
NH2 number = 16
N
O
N
O
O
O
N
NH
H 2N
N
H
N
O
H
N
N
O
O
N
H
O
NH
HN
O
N
H
O
N
H
HN
N
N
H
N
O
NH 2
G2
O
O
NH 2
H
N
N
NH 2
N
O
CH 2
H
N
O
MW~1550
Diameter~ 2.2 nm
NH2 number = 8
NH 2
O
N
H 2N
CH 2 C
N
O
O
H
N
N
H
O
N
H
O
H 2N
HN
N
N
H
H 2N
S
CH 3
O
N
H
Eliminace polymerních léčiv z krevního řečiště a
akumulace do nádoru u B/6 myší nesoucích myší
lymfom EL4. Porovnání s volným léčivem.
Eliminace z oběhu
Akumulace v nádoru
20
40
Dox
16
Dox
14
lineární
12
roubovaný
10
micela (chol)
ug Dox / g nadoru
Dox z injekované dávky (%)
18
8
6
4
35
lineární
30
roubovaný
25
micela (chol)
20
15
10
2
5
0
0
0
10
20
30
40
50
čas (h)
60
70
80
90
100
0
20
40
60
čas (h)
80
100
Aktivní směrování – internalizace polymerních
léčiv v buňkách
Uvolnění léčiva (a) hydrolýza v endosomech,
(b) enzymolýza v sekundárních lysosomech
lysosom
primární endosom
pH 5 - 6
Jádro
sekundární lysosom,
pH 5, enzymy
Schéma klasického protilátkou směrovaného
konjugátu doxorubicinu (enzymatická aktivace)
CH3
CH2
CH3
C
C
CH3
CH2 C
O
C
x
CH2 C
O
C
a
NH
CH2
CH
OH
HO
NH
CH3
CH3
O
O
OH
O
OH
O
HO
HO
CH2
C
O
Oligopeptid -GlyPheLeuGly-
OCH3
O
b
Schéma hvězdicového protilátkou směrovaného
konjugátu doxorubicinu (enzymatická aktivace)
CH3
CH2
C
CH3
CH2
C
CO
CO
NH
Gly
Phe
Leu
Gly
CH2CHCH3
OH
DOX
S-CH2CH2-CONH--
X
Hlavní požadavky kladené na polymerní
nosiče léčiv
• Stabilita v průběhu transportu (chemická vazba
léčiva na nosič)
• Řízené uvolnění léčiva z nosiče (chemická
hydrolýza, enzymolýza)
• Cílený transport k nádoru, nádorovým buňkám
(pasivní směrování pomocí EPR efektu, aktivní
směrování směrující strukturou
• Eliminace nosiče z organizmu (degradovatelný
nosič, micelární nosič)
Schéma degradace roubovaného konjugátu
(degradace v reduktivním prostředí buňky)
NH
NH2
DOX
DOX=N
NH
N =DOX
NH
S
Degradace v
cílové buňce
S
DOX
S
S
NH
NH2
S
S
NH N =DOX
NH N=DOX
DOX
DOX = N HN
H2N HN
Vysokomolekulární léčivo s akumulací
v pevném nádoru
Nížemolekulární fragmenty
vyloučitelné z organizmu
Degradace roubovaného
PHPMA konjugátu se
spojkou -S-S- po inkubaci
s glutathionem
c(kathepsin B) = 5.10-7 mol/l
c(glutathion) = 3.10-6 mol/l
90
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
80
70
Vylučovací mez polymeru
ledvinami
Mw (x10-3)
Mw (x10-3)
Degradace roubovaného
PHPMA konjugátu se spojkou
GFLG po inkubaci s
kathepsinem B
60
50
40
30
20
10
0
0
10
20
30
time (h)
40
50
0
10
20
30
time (h)
40
50
Biologická aktivita polymerních léčiv
studovaná na modelových nádorech u myší
(růst nádoru, doba přežití, váha)
(a) Testy in vitro aktivity na buněčných liniích
(b) In vivo testy na myších, terapeutický režim aplikace
léčiva
( první aplikace po vytvoření nádoru, nejčastěji po 8 – 11 dnech od inokulace)
Inhibice proliferace buněk EL4 T-buněčné
leukemie
(IC50 – koncentrace potřebná pro inhibici proliferace 50 % buněk)
Konjugát
IC50,
μg DOX/mL
PHPMA-GFLG -DOX (PK1)
19.1
PHPMA-GFLG -DOX-ATG
11,8
PHPMA-GFLG -DOX (cis-aconityl)
4.74
PHPMA-GFLG -DOX (hydrazon)
0.13
PHPMA-GG -DOX (hydrazon)
0.08
PHPMA-aminohexanová kys.-DOX
(hydrazon)
0.34
PHPMA-aminobenzoic ac.-DOX
(hydrazon)
0.07
PHPMA-GFLG -DOX-ATG (hydrazon)
0.01
PHPMA-GFLG -DOX-NHNH2 (prekurzor)
100
DOX.HCl
0.01
Směrované PHPMA-DOX konjugáty, výsledky in vivo testů
(Balb/c myši, BCL1 leukemie i.p., léčba i.v.)
a) jedna dávka 5mg/kg, (hv 11 den) b) dvě dávky 11 a 14 den, 2x5mg/kg (kl)
Therapeutický režim, doba přežití
% přežívajících myší
100
80
60
Kontrola
40
PHPMA-Dox-IgG
PHPMA-DOX-mAb kl
20
PHPMA-Dox-mAb hv
0
0
30
60
90
DEN
120
Léčba C3H/HeN myší s 38C13 lymfomem (1x105, s.c.)
doxorubicinem (5x2.5 mg/kg) nebo polymer-DOX konjugáty
(ekvivalent 5 mg/kg DOX) aplikovanými 8 a 11 den
600
120
Tumor size [mm sq.]
500
Surviving of experimental mice (%)
Control
Dox
P-Dox
400
Classical aCD71 [C2mAb]
300
200
100
0
8
13
18
Days
23
28
100
Control
80
Dox
60
P-Dox
40
Classical aCD71
[C2mAb]
20
0
0
10
20
30
Days
40
50
60
Léčba myší kmene B/6 s nádorem myšího EL-4 Tbuněčného lymfomu pomocí konjugátu HuIgGPHPMA-DOX
Injekce jedné dávky i.v. 20 mg/kg DOX v den 10
Survival of B/6 mice bearing EL-4 lymphoma treated
with HuIgG-targeted conjugate
Growth of EL-4 tumors in B/6 mice treated with
HuIgG-targeted conjugate
900
tumor size [mm2]
800
number of mice [%]
120
B-594
700
Endobulin
600
Kontroly
500
400
300
200
100
80
B-594
60
Endobulin
40
Kontroly
20
0
100
0
0
9
11
14
16
days
18
21
23
10
20
30
days
40
50
Lineární konjugáty PHPMA-DOX s hydrazonovou
vazbou: výsledky in vivo testů, nesměrovaný lineární
konjugát
Myší T-buněčný lymfom EL4, myši C57BL/6, léčba i.p. 10 nebo 10 a 20 den
Hydrolyticky štěpitelná vazba,
pH závislá rychlost štěpení
Růst nádoru
Přežívání myší
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
% přežívajících myší
velikost nádoru (mm2)
120
100
80
60
40
20
0
0
10
15
20
dny
25
30
35
40
20
Kontrola
B531-25 mgDox/kg x2
dny
40
60
B531-25mgDox/kg x1
B531-75 mgDox/kg x1
80
Vysokomolekulární roubované polymerní konjugáty
DOX (Hydrazon) – In vivo protinádorová aktivita
přežívání myší, %
105 buněk T-buněčného lymfomu EL4 inokulovaných myším B/6 v den 0. Léčba: den 11. i.v. ,
jednoduchá dávka 15 mg DOX ekv./kg
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Conjugate A
Conjugate B
linear
Control
0
10
20
30
40
50
60
70
dny
A – konjugát s enzymatickou degradací
B – konjugát s reduktivní degradací
Vysokomolekulární micelární konjugáty PHPMA-DOX
Doba přežití B/6 myší s inokulovaným EL-4 T-buněčným lymfomem (s.c.)
léčených 8 (a příp. 12) den po inokulaci jednou nebo dvěma dávkami léčiva
Přežití B/6 myší
120
100
počet myší %
80
60
40
Oleyl 1x10
Oleyl 2x5
Cholesteryl 1x10
20
0
0
10
20
30
40
50
Dny
60
70
80
90
Cholesteryl 2x5
linear 1x15
Controls 0
Přežití C57BL/6 myší s retransplanovanými buňkami
(105) myšího lymfomu EL-4, bez následné léčby
Původní léčba: hydrazonový konjugát
% přežívajících myší
120
100
80
60
Control
25 mg/kg
40
2 x 25 mg/kg
75 mg/kg
20
0
0
10
20
30
40
Dny
50
60
70
Imunogenocita polymerních konjugátů s
protilátkami
Struktura
P
GFLG  DOX
Titr x 10-6
Snížení
imunogenicity
2,1
123 x
P-GFLG-IgG
3,7
70 x
IgG
260
PEG(2000)-a-Thy 1,2
29% substituce
1.6
81 x
PEG(2000)-a-Thy 1,2
39% substituce
0.82
158 x
P-GFLG-a-Thy 1,2
1.0
130 x
a-Thy 1,2
130
GFLG  IgG
Využití rozpustných polymerních
konjugátů v diagnostice
Konjugát gadolinia pro diagnostiku (angiografii)
magnetickou resonancí
CH3
CH2
CH3
C
CH2
C
CO
CO
NH
NH
CH2
CH2
HC
OH
CH3
Hmotová spektroskopie:
(5.19±0.28) %váh. Gd
CH2
CH2
CH2
Kontrastní látka:
CH2
CO
MW: 24.8 kDa
Mw/Mn: 1.92
0.5 M (78 mg/ml Gd)
NH
HC
CH2
CO
NH
CH
CO
CH2
NH
COOH
HC
CH2
COOH
Gd
COOH
COOH
Stabilita komplexu Gd-PHPMA
4000
130903
3500
051103
3000
Doba inkubace: 2 měsíce
Relaxační časy T1, T2
(podélná a příčná vibrace)
2000
1500
1000
500
0
-0.1
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
4500
0.8
C [mmol/l]
130903
4000
051103
3500
3000
Stabilita komplexů
- ve fyziologickém roztoku
(0,9 % NaCl)
- ve vodě
T2 [ms]
T1 [ms]
2500
2500
2000
1500
1000
500
0
-0.1
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
C [mmol/l]
0.5
0.6
0.7
0.8
Cytotoxicita konjugátů gadolinia
(lidské fibroblasty, trypan blue, kontrola Gd-DTPA (Magnevist) od firmy
Schering)
Doba inkubace
50,00
24 hodin
45,00
40,00
35,00
30,00
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
Dead human fibroblast cells (MSU) [%]
50,00
45,00
40,00
35,00
48 hodin
30,00
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
0,00
1
1
Kontrola
PHPMA-Gd Gd-DTPA
(1mM)
(0.1mM)
Kontrola
PHPMA-Gd Gd-DTPA
(1mM)
(0.1mM)
MR-Angiografie, komplex poly(HPMA)-Gd
Krysa, 1.5 T MR scanner:0.02 mmol/kg HE45
Syntetické polymery jako součást
vektorů pro genovou terapii
Požadavky na systém pro dopravu genu
účinný v in vivo podmínkách
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Stabilita v krevním
řečišti, minimální
interakce s buňkami
imunitního systému
Extravazace do cílové
tkáně
Interakce s receptory
cílových buněk
Endocytoza
Únik z endosomu do
cytoplasmy
Transport k buněčnému
jádru
Účinná transfekce a
produkce aktivního
proteinu
Systémy pro in vivo dopravu genu
•
•
•
•
Biodegradovatelné nanočástice
Kationtové liposomy
Kationtové lipidy (lipoplexy)
Interpolyelektrolytové (polykationtové) komplexy
DNA (polyplexy)
• Virální systémy: retroviry, polymerem
modifikované rekombinantní adenoviry
Interpolyelektrolytové komplexy
(IPEC) polykationtů s DNA
plasmidy (polyplexy)
Tvorba komplexu polykation-DNA
Agregace částic
+
+
+
+
+
+/- = 1 : 1
+ +
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+ +
+
++
+
++
+
+
+ +
+
+ +
+/- > 1
++
+
+
+
+ +
+ +
+
+/- >> 1
+
+
+
+
+
Izolované komplexy
+
+ +
+
+
+
+
+
+ +
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+ +
+
+ +
+ + + Směs polymeru s komplexem
Polykationty použité pro přípravu IPEC
a) Primární amíny
b) Terciární amíny
c) Kvarterní ammoniové
soli
CH3
CH3
CH2
C
CH2
C
CH3
CH2
C
CH3
CH2
C
CH3
CH3
CH2
CH2
C
CH3
C
CH2
C
CO
CO
CO
CO
CO
CO
CO
NH
NH
NH
O
NH
O
NH
CH2
CH2
CH2
(CH2)2
CH2
CO
CO
NH2
NH
NH
CH2
CH2
CH2
CO
NH2
NH
MAEDA
(CH2)6
MAGEDA
NH2
MAGGHMDA
N
H3C
H3C
N
CH3
DMAEM
(CH2)2
(CH2)2
H3C
CH3
DMAEMam
N
CH3
CH3 Cl
TMAEM
(CH2)2
H3C
N
CH3
CH3
TMAEMam
Cl-
Polykationty použitelné pro přípravu IPEC
CH2
CH
NH
CO
H
AIBN
CH2
CH2
NH
CH2
CH2
CH2
CH2
NH2
CH2
CH2
NH
N
PEI
CH2
CH
NH
CO
H
HN
NaOH
CH
CO
CH2
CH2
CH2
CH
CH2
NH2
CH2
NH2
PVA
PLL
Multifunkční polykationtový vektor pro dopravu genu
připravený kondensací DNA s blokovými kopolymery
polykationtů a hydrofilních polymerů
+++
+ + +
+
+ + +
plasmid
Fusogení molekula (peptid)
Směrující jednotka
Hydrolyticky labilní
vazba (při pH < 6)
pH 7,4 stabilní
při dopravě
Uvnitř buňky při
pH < 6 se
plasmid uvolní z
endosomu
Stabilita polykationtového komplexu DNA
stabilizovaného hydrofilním PHPMA
kopolymerem při inkubaci s DNAzou
(fosfátový pufr, pH 7.4, 37 °C)
změna absorbance (260 nm)
0,08
0,07
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0
0
5
10
15
20
25
čas, min
DNA
DNA/roub
DNA/blok
30
35
Povrchová úprava IPEC pomocí HPMA kopolymeru,
využití pro cílenou dopravu IPEC pomocí aktivních
proteinů nebo oligopeptidů
NH2
NH2
NH2
ONp
NH2
ONp
+
NH2
NH2
ONp ONp
ONp
ONp
NH2
ONp
NH2 NH2
+
NH2
ONp
ONp
ONp
NH
oligopeptid
NH2
protein (IgG,
transferin)
Průnik do buněk K562 (lidská leukemie) a účinnost transfekce
komplexů pLL/DNA (gen kódující ß-Gal). Směrování
transferinem.
Průnik PL/DNA komplexu do buněk, vliv směrování
Účinnost přenosu genu v in vitro podmínkách
8000000
100
7000000
80
6000000
70
60
svět. jednotky
průnik do buněk, %
90
50
40
30
20
5000000
4000000
3000000
10
2000000
0
0
50
100
150
200
250
300
1000000
čas, min
pLL/DNA
pHPMA-pLL/DNA
350
pHPMA-Tf-pLL/DNA
0
pLL/DNA
pHPMA-pLL/DNA
pHPMA-Tf-pLL/DNA
Virální systémy, rekombinantní adenoviry
Adenovir: Potenciální vektor pro nádorovou
genovou terapii
Požadavky na intravenozní aplikaci:
• Virus se nesmí vázat na erythrocyty a neutrofily
• Nesmí napadat makrofágy a buňky RES
• Nesmí docházet k neutralizaci protilátkami a
komplementem
• Nesmí docházet k záchytu viru v jaterních buňkách
• Musí být schopen specifického směrování k vybraným
buňkám (retargeting)
Receptory: coxsackie a adenovirus receptory
(CAR), receptory pro „fibre knob“ ligandy
Povrchová modifikace viru hydrofilním polymerem
Reaktivní esterová
skupina
Aminoskupina
+
Semitelechelický
monovalentní polymer
Virus
+
Klasický multivalentní
polymer se směrující
skupinou
Modifikovaný
virus
Osud povrchově modifikovaného viru v
cílové buňce
Extracelární prostředí
Prostředí v buňce
Ochranný polymer
Přesměrovaný virus
adenovirová
kapsida
endosom
pH < 6
GSH
Směrující struktura
Degradovatelné vazby
Buněčná membrána
Uvolnění
DNA
Příklad HPMA kopolymerů určených pro povrchovou
úpravu virálních nosičů genu
CH3
CH2
C
CH3
CH2
CH3
C
CH2
CH3
C
CH2
C
CH3
CH3
CH2
C
CH2
CH3
C
CH2
C
CO
CO
CO
CO
CO
CO
CO
NH
O
NH
NH
O
NH
NH
CH2
CH OH
CH3
(CH2)2
CH3
N
CH3
CH3 Cl
(CH2)2
CH2
NH
CH OH
CO
CH3
(CH2)2
CH3
N
CH3
CH3 Cl
(CH2)2
NH
NH
CO
CO
(CH2)2
(CH2)2
Reduktivně štěpitelná
vazba (v cytoplasmě)
S
S
(CH2)2
S
S
S
S
(CH2)2
(CH2)2
(CH2)2
CO
CO
CO
N
N
S
S
S
(CH2)2
S
EGF
Množství nemodifikovaných a polymerem modifikovaných virů
v krvi po 30 min od aplikace (% vstupní dávky, myši BALB/C)
60
% Input Dose
50
40
30
20
10
Vi
ru
6x
s
10
E1
1
Vi
ru
1x
s
10
E9
pc
Vi
1x
ru
10
s
E1
0
pc
Vi
1x
ru
10
s
E1
1
pc
Vi
4x
ru
10
s
E1
1
pc
Vi
6x
ru
10
s
E1
1
pc
Vi
ru
s
4x
10
E1
1
Vi
ru
s
Vi
ru
s
1x
10
E1
1
1x
10
E1
0
1x
10
E9
Vi
ru
s
0
Modifikace viru polymerem a vhodná dávka vede ke snížení poměru počtu
virů v játrech vers. krev z poměru >2000 na <1.
Polymerem modifikovaný nesměrovaný adenovirus Ad5-GFP
ztrácí schopnost účinně infikovat buňky (A549 – plicní nádor)
Nemodifikovaný virus
Asociace s
buňkami (FACS)
Transgenní
exprese genu
Ad5-GFP
Polymerem
modifikovaný virus
Virus retargetovaný
pomocí bFGF
Retargeting adenoviru (Ad5-luc) pomocí EGF
(epidermální růstový faktor)
Ovariální nádor SKOV 3
1000000
1000000
100000
100000
Luciferase (RLU)
Luciferase (RLU)
Vaginální nádor A431
10000
1000
10000
1000
100
100
virus
pc-virus
EGF-pc-virus
virus
pc-virus
EGF-pc-virus
Exprese polymerem modifikovaného viru Ad5-GFP
směrovaného humanizovanou protilátkou herceptinem
Buňky
SKOV3
Ovariální
nádor
K562
Lidská
leukemie
Virus
PHPMA modifikovaný virus
Herceptinem
retargetovaný virus
Závěry
 Polykationty tvoří dostatečně malé a stabilní komplexy s DNA a plasmidy
 Stabilitu polykationt/DNA komplexu je možné ovlivňovat strukturou
polykationtu a modifikací povrchu komplexu hydrofilním polymerem
 Účinnost transfekce IPE komplexů může být ovlivňována změnami
struktury komplexu a zavedením funkčních molekul (směrování)
 Modifikace adenoviru hydrofilním HPMA kopolymerem vede k
prodloužené cirkulaci viru v krvi a až k 1000 násobné redukci exprese genu
(poklesu nespecificke infektivity).
 Expresi genu je možné obnovit specifickým směrováním polymerem
modifikovaného viru pomocí specifických oligopeptidů i proteinů
(transferin, herceptin).
 Specifita směrování virálního vektoru je výrazně závislá na struktuře
směrující molekuly
 IPEC i polymerem modifikované viry jsou slibnými vektory s potenciálním
využitím v genové terapii