Transcript کنترل کیفیت سمپلر

‫‪ ‬موضوع ‪:‬‬
‫‪ ‬كنترل كيفي آزمايشگاه ميكروب شناس ي‬
‫تهيه و کنترل کيفيت محيط های کشت‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫نکات عمومی در مورد محيط های کشت‪:‬‬
‫آب‪:‬‬
‫کیفیت محیط های کشت بطور مستقیم بستگی به کیفیت مواد‬
‫خام مورد استفاده در تهیه آنها دارد‪ .‬آب یکی از مهمترین موادی‬
‫است که در تهیه محیط های کشت بکار میرود‪ .‬سه معیار مهم‬
‫برای آب مورد استفاده در تهیه محیط های كشت شامل وجود‬
‫یونهای مس‪ ،‬قدرت هدایت الکتریکی و ‪ pH‬می باشد‪ .‬در شرایط‬
‫ایده آل یونهای مس بدلیل خاصیت مهارکنندگی برای اغلب‬
‫میکروارگانیسم ها نباید در آب مورد استفاده جهت تهیه محیط‬
‫های کشت وجود داشته باشد‪ .‬قدرت هدایت الکتریکی آب باید‬
‫کمتر از ‪ 15‬میکرو زیمنس باشد وهمچنین‪ pH‬آب مورد استفاده‬
‫بهتر است کمی اسیدی باشد ولی نباید کمتر از ‪ 5/5‬باشد‪.‬‬
‫توزين محيط کشت و افزودن آب‪:‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫طبق دستورالعمل تهیه محیط کشت که بر روي قوطي نصب‬
‫گرديده است‪ ،‬مقدار مناسبي از پودر محیط کشت را با دقت وزن‬
‫نمايید‪ .‬ظرف محیط کشت را دور از کوران هوا و رطوبت باز کنید‪ .‬از‬
‫استنشاق پودرها به خصوص آنهايي که داراي مواد سمي هستند‬
‫و تماس طوالني مدت آنها با پوست اجتناب کنید‪ .‬پودر را به‬
‫سرعت‪ ،‬به دقت و بدون ايجاد توده اي از غبار وزن کنید‪ .‬هرچه‬
‫زودتر درب ظرف را ببنديد‪.‬‬
‫نصف حجم آب مورد نیاز را داخل ظرف بريزيد‪ .‬سپس مقدار وزن‬
‫شده محیط کشت را به آن اضافه نمايید‪ .‬براي چند دقیقه به تندي‬
‫تکان دهید‪ .‬باقیمانده آب را به ديواره ظرف بريزيد تا ذرات محیط‬
‫کشت چسبیده به ديواره نیز وارد محلول شوند‪ .‬اين مرحله بسیار‬
‫مهم است‪ ،‬چون پودر خشک محیط کشت در باالي سطح آب‪،‬‬
‫ممکن است در اتوکالو استريل نشود و منبع آلودگي گردد‪.‬‬
‫حل کردن محيط کشت‪:‬‬
‫‪ ‬محیط هاي کشت بدون آگار‪ ،‬معموال با تکان دادن‬
‫آهسته و ماليم حل خواهند شد‪ .‬اما محیط هاي‬
‫کشت حاوي آگار بايد قبل از حرارت دادن به مدت چند‬
‫دقیقه با آب مخلوط شوند‪ .‬سپس حرارت داده شوند‬
‫تا آگار قبل از اتوکالو کردن‪ ،‬حل شود‪ .‬محیط هاي‬
‫کشت را بجوشانید بدون آنکه بسوزند‪.‬‬
‫‪ ‬محیط هاي کشتي که نبايد اتوکالو شوند‪ ،‬بعد از اين‬
‫مقدار حرارت دادن‪ ،‬براي تقسیم داخل پلیت ها يا‬
‫ظروف ديگر آماده خواهند بود‪ .‬اکثر محیط هاي کشت‬
‫به استريلیزاسیون نهايي (در دماي ‪ 121C °‬به مدت‬
‫‪ 15‬دقیقه) نیاز خواهند داشت‪.‬‬
‫اندازه گيري و تنظيم ‪:PH‬‬
‫‪ ‬محیط هاي کشت دهیدراته اگر بطور مناسب تهیه‬
‫شوند نیازي به تنظیم ‪ pH‬ندارند‪ pH .‬نهايي محصول‬
‫استريل شده را مي توان روي پلیت يا بطري اندازه‬
‫گیري کرد‪ ،‬اما بايد آنها را بعد از سنجش ‪ pH‬دور‬
‫ريخت‪ .‬بنابراين بعد از استريل شدن و خنک شدن‬
‫محیط کشت تا دماي ‪ ،25C °‬مقدار ‪ pH‬را در حد مورد‬
‫نظر (‪ )± 2/0‬تنظیم نمايید‪ .‬تنظیم ‪ pH‬معموال با‬
‫استفاده از هیدروکسید سديم ‪ 40‬گرم در لیتر (تقريبا"‬
‫يک موالر) و يا با استفاده از اسید کلريدريک ‪5/36‬‬
‫گرم در لیتر (تقريبا" يک موالر) انجام مي شود‪.‬‬
‫توزيع‪:‬‬
‫‪ ‬محیط کشت را در ظرفي مناسب با حجم ‪ 2‬تا ‪3‬‬
‫برابر حجم محیط کشت بريزيد تا بتوانید آنرا به‬
‫خوبي تکان دهید و مخلوط کنید‪.‬‬
‫استريليزاسيون‪:‬‬
‫‪ ‬بعضي از محیط هاي کشت به استريلیزاسیون با‬
‫اتوکالو احتیاجي نداشته و با جوشاندن استريل‬
‫مي شوند که دستور ساخت آنها بر روي برچسب‬
‫قوطي محیط کشت قید گرديده است‪.‬‬
‫استريلیزاسیون ساير محیط هاي کشت توسط‬
‫حرارت مرطوب يا صافي غشايي انجام مي گردد‬
‫که اين موارد نیز بر روي بر چسب قوطي محیط‬
‫کشت قید گرديده است‪.‬‬
‫‪ ‬الف) استريليزاسيون با حرارت مرطوب‪:‬‬
‫‪ ‬استريلیزاسیون محیط کشت تا حجم يک لیتر‪ ،‬در‬
‫اتوکالو به مدت ‪ 15‬دقیقه و در دماي ‪( 121C °‬فشار‬
‫‪ 2/1‬کیلوگرم بر سانتیمترمربع) انجام مي گیرد‪ .‬براي‬
‫حجم هاي بیشتر از يک لیتر بايد چرخه‬
‫استريلیزاسیون را بطور مناسب تغییر داد‪ .‬اما چون‬
‫اکثر مشکالت در استريلیزاسیون محیط هاي کشت‬
‫وقتي رخ میدهد که مقادير بیشتر از دو لیتر محیط‬
‫کشت بايد استريل شود‪ ،‬لذا توصیه مي شود که‬
‫مقادير زياد محیط کشت را در حجم هاي کوچکتر‬
‫تقسیم نمايید‪.‬‬
‫‪‬‬
‫‪ ‬کنترلی کيفی اتوکالو‬
‫‪ ‬کنترل دما و فشار اتوکالو بایستی بطور مداوم‬
‫انجام گردد‪ .‬برای کنترل اتوکالو از اندیکاتورهای‬
‫شیمیائی ‪ TST‬استفاده می کنند‪ .‬از اندیکاتورهای‬
‫بیولوژیکی که جهت کنترل کارائی اتوکالو استفاده‬
‫می کنند اسپور ‪ Bacillus Stearothermophilus‬را‬
‫می توان نام برد که بصورت تجاری قابل دسترس‬
‫می باشد‪.‬‬
‫ب) استريليزاسيون با صافي غشايي‪:‬‬
‫‪ ‬از صافي غشايي براي استريل کردن محیط هاي‬
‫کشت و ترکیبات حساس به حرارت استفاده مي‬
‫شود‪ .‬استريلیزاسیون بوسیله صافي غشايي تحت‬
‫شرايط خالء يا افزايش فشار انجام مي پذيرد‪ .‬از‬
‫غشاء ها و صافیهاي با قطر منفذ ‪ 22/0‬يا ‪45/0‬‬
‫میکرومتر استفاده نمايید‪ .‬اين فیلترها بايد قبل از‬
‫استفاده‪ ،‬در اتوکالو استريل شوند‪ .‬در مورد غشاء ها‬
‫و صافیهايي که در بسته بنديهاي استريل به فروش‬
‫مي رسند‪ ،‬به دستورالعمل سازنده مراجعه نمايید‪.‬‬
‫قسمت هاي مختلف دستگاه صافي را با صافي يا‬
‫بدون صافي در اتوکالو به مدت ‪ 15‬دقیقه در دماي ‪C‬‬
‫‪ 121°‬استريل نمايید‪.‬‬
‫آماده سازي جهت مصرف‪:‬‬
‫‪ ‬بعد از استريلیزاسیون‪ ،‬اجازه دهید دماي محیط‬
‫کشت به حدود ‪ 50C °‬برسد‪ ،‬سپس با رعايت شرايط‬
‫آسپتیک در ظروف نهايي تقسیم نمايید‪ .‬هیچ وقت‬
‫محیط کشت را در دماي باالتر از ‪ 50C °‬تقسیم نکنید‪.‬‬
‫مکمل هاي حساس به گرما و حرارت بايد بعد از اين‬
‫که دماي محیط کشت به حدود ‪ 50C °‬رسید‪ ،‬به آن‬
‫اضافه شوند‪ .‬اجازه دهید دماي مکمل (ساپلمنت)‬
‫استريل قبل از اين که به محیط کشت اضافه شود‪،‬‬
‫به دماي اتاق برسد‪ .‬سپس مکمل را با رعايت شرايط‬
‫آسپتیک به محیط کشت اضافه نموده‪ ،‬خوب مخلوط‬
‫کنید و در ظروف نهايي که از قبل استريل شده اند‪،‬‬
‫تقسیم نمايید‪.‬‬
‫پتری دیش‪:‬‬
‫‪‬‬
‫کیفیت پتری دیش های مورد استفاده در تهیه محیط نیز‬
‫اهمیت دارد‪ .‬معموال ا پتری دیش ها را را با اتیلن اکساید ویا‬
‫اشعه گاما استریل می کنند‪ .‬در صورت استفاده از پتری‬
‫دیش هایی که با اتیلن اکساید استریل شده باشند‬
‫بایستی از نظر وجود بقاياي این ماده بررسی شود زیرا‬
‫اتیلن اکساید دارای خاصیت مهار کنندگی برای‬
‫میکروارگانیسم ها می باشد و می توان آن را با روش‬
‫کروماتوگرافی اندازه گرفت‪ .‬در صورت استفاده از‬
‫پتری دیش های شیشه ای بایستی از پتری دیش هایي از‬
‫جنس بروسیلیکات استفاده کرد‪ .‬استفاده از پتری دیش‬
‫هایي از جنس قلیائی ممکن است موجب آزاد سازی قلیا‬
‫در داخل محیط کشت گردد‪.‬‬
‫پارامترهای فيزیکی‪:‬‬
‫‪ ‬محیط کشت های تهیه شده باید قبل از استفاده‪،‬‬
‫از لحاظ فیزیکی و ظاهری نیز بررسی شوند‪.‬‬
‫معیارهای ظاهری قابل بررسی شامل وجود‬
‫حباب‪ ،‬حفره‪ ،‬ناصافی سطح محیط‪ ،‬ترک‬
‫خوردگی‪ ،‬یخ زدگی می باشد‪ .‬ضخامت محیط نیز‬
‫اهمیت دارد‪ .‬ضخامت محیط های کشت پلیتی‬
‫نبايد كمتر از ‪ 3‬میلی متر باشد‪.‬‬
‫روش تهيه برخي محيط هاي كشت‬
‫روش تهيه محيط کشت ژالتين (ترکيبی)‬
‫‪ ‬پیتون= ‪5g‬‬
‫‪3Beef Extract = g ‬‬
‫‪ ‬ژالتین= ‪120g‬‬
‫‪ ‬مقادیر فوق را به ‪ 1000cc‬آب مقطر اضافه کرده و در‬
‫بن ماری جوش قرار دهید تا کامال ا حل شوند (از‬
‫حرارت دادن این محیط کشت بر روی شعله پرهیز‬
‫کنید)‪ .‬سپس در اتوکالو به مدت ‪ 15‬دقیقه و دمای‬
‫‪ 121oC‬در فشار ‪ 15‬پوند ( ‪ )15Lb‬استریل نمایید‪.‬‬
‫سپس در لوله تقسیم کرده و ‪ PH‬محیط کشت را به‬
‫‪ 8/6‬برسانید‬
‫روش تهيه محيط کشت آب پپتونه قليایی یا ‪( APW‬ترکيبی)‬
‫‪ ‬پیتون= ‪10g‬‬
‫‪ ‬کلرور سدیم (‪10Nacl)= g‬‬
‫‪ ‬آبمقطر= ‪1000cc‬‬
‫‪ ‬سپس ‪ pH‬را به ‪ 6/8-9‬برسانید و در شرایط ‪15‬‬
‫دقیقه‪ ,‬فشار ‪ 15Lb‬در اتوکالو قرار داده و استریل‬
‫نمایید‪ .‬دما نیز ‪ 121oC‬است‪ ( .‬برای تنظیم از‬
‫سود ‪ 1N‬استفاده کنید)‬
‫روش تهيه محيط کشت ‪( %5/6NACL‬براث‪ /‬آگار)‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫محیط پایه همان محیط برین هارت اینفیوژن براث‪/‬آگار است‪ .‬از آنجا‬
‫که این محیط کشت حاوی ‪ %5/0‬نمک میباشد‪ ،‬بنابراین ‪%6‬‬
‫نمک به این محیط پایه اضافه نمایید تا مقدار ‪ %5/6‬نمک حاصل‬
‫شود‪ .‬شرایط استریلیزاسیون همان دمای‪ ،121oC‬فشار ‪ 15Lb‬و‬
‫زمان ‪ 15‬دقیقه میباشد‪.‬‬
‫براساس دستور ساختی که روی هر بسته محیط کشت قید شده‬
‫پودر بالدآگار را وزن نموده و در مقدار مشخص آب مقطر بریزید پس‬
‫از حرارت دادن و ذوب کامل پودر آن را در ‪ 121‬درجه سانتیگراد برای‬
‫‪ 15‬دقیقه اتوکالو نمایئد پس از خروج از اتوکالو و سردشدن تا دمای‬
‫‪ C500‬تا ‪ C550‬حدود ‪ 10‬درصد خون گوسفند اضافه نماید و پس از‬
‫مخلوط کردن به آرامی داخل پتری دیش ازمایشگاهی تقسیم‬
‫کنید‪ .‬و بگذارید سرد شود‪ .‬اگر قصد ساختن آگار شکالتی‬
‫‪ ChoColate Ajar‬را دارید پس از افزودن خون به بالد آگار آن را در‬
‫دمای ‪ 75‬تا ‪ 80‬درجه قرار دهید تا محیط آگار شکالتی داشته‬
‫‪ MUELLER HINTON AGAR‬محيط مولر هينتون آگار‬
‫‪ ‬این محیط کشت در اصل برای جداسازی گونه‬
‫نیسریابی بیماری زا فرموله شد‪ .‬امروزه بیشتر در‬
‫ارتباط با دیسکهای آنتی بیوتیکی با توان باال برای‬
‫تعیین الگوهای حساسیت آنتی بیوتیکی بکار میرود‪.‬‬
‫روش ساخت آن بسیار ساده است پس از وزن مقدار‬
‫مشخص از پودر آن را در آب مقطر استریل و در روی‬
‫شعله حرارت داده تا پودر کامال ا حل شود سپس در‬
‫اتوکالو ‪ 121‬درجه سانتیگراد برای ‪ 15‬دقیقه استریل‬
‫نمایئد پس از خروج از اتوکالو و سرد شدن تا ‪50‬‬
‫درجه سانتیگراد آن را در ظروف پتری دیش تقسیم‬
‫کنید ضخامت محیط کشت از چهار میلیمتر بیشتر‬
‫نگردد‪.‬‬
‫محيط ‪MACCONKEY AGAR‬‬
‫‪ ‬این محیط برای کشت انتروباکتریاسه مفید است‬
‫و محتوی نمک صفراوی است تا باکتریهای غیر‬
‫رودهای را مهار کند و نیز برای تشخیص کلی‬
‫فرمهای تخمیر کننده الکتوز از سالمونالهای غیر‬
‫تخیمرکننده الکتوز و گروه دیسانتری‪ ،‬حاوی الکتوز‬
‫یا قرمز خنثی (‪) Neutra red‬است‪.‬‬
‫‪BISMUTH SULFITE AJAR‬‬
‫‪‬‬
‫بیسموت سولفیت آگار مناسب برای جداسازی سالموفالتایفی و دیگر‬
‫بایسلهای رودهای است روش ساخت آن مطابق دستور الصاقی روی ظرف‬
‫میحط کشت است‪ .‬بیسموت سولفیت آگار یک محیط کامال ا مغذی به علت وجود‬
‫پپتونها‪ ،‬عصاره گوشت گاو و دکستروز است‪ .‬سولفات فروز‪ ،‬معرف تولید‬
‫سولفیدهیدروژن است بیسموت فلز سنگینی است که خاصیت مهار کنندگی‬
‫بعضی از میکرو ارگانیسمها را دارد رنگ بریلیانت گرین نیز به عنوان مهار کننده‬
‫است حضور این مهار کنندهها باعث مهار باکتریهای گرم مثبت و بیشتر‬
‫ارگانیسمهای گرم منفی رودهای به جز اکثر گونههای سالمونال و بعضی از‬
‫گونههای شیگال میشود‪ .‬ممکن است گونه سالمونال براساس ظاهر و رنگ‬
‫کلونی احتمالی شنساسایی گردد‪ .‬رنگ سیاه یا سبز ایجاد شده‪ ،‬یک رسوب‬
‫فلزی است که وقتی سولفید هیدروژن (که توسط سالمونال از ترکیبات سولفور‬
‫در میحط ایجاد شده) با یک نمک آهن واکنش بدهد‪ ،‬تولید میشود‪ .‬به طور‬
‫شاخص کلونی ها سیاه یا سبز هستند و ممکن است با هاله سیاه یا قهوهای‬
‫تیره با درخشندگی فلزی سبز احاطه شده باشند‪.‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫ظاهر کلونیهای شاخصی (‪ )Typic‬و واکنش آنها روی‬
‫بیسموت سولفیت آگار به شرح زیر است ‪:‬‬
‫‪ : Salmonella typhi‬کلونیهای مسطح‪ ،‬خشک‪ ،‬سیاه‬
‫مرمری احاطه شده با هالههای سیاه مایل به قهوهای در‬
‫محیط معموال ا درخشندگی فلزی وجود دارد‪.‬‬
‫‪ : Salmonlla typhi‬کلونیهای سیاه مرطوب‪ ،‬بدون هاله‬
‫– ‪S Paratyphi – S. Cholerasuis – S.gallinanum‬‬
‫‪ morganella morganij‬کلونی سبزبدون هاله‬
‫‪ Shigella spp‬مهار میشود‪ ،‬اما اگر رشد کند‪ ،‬کلونیهای‬
‫سبز مایل به قهوهای دارد این محیط کشت احتیاج به‬
‫اتوکالو ندارد‪.‬‬
‫محيط ‪CARY AND BLAIR TRANSPORT MEDIUM‬‬
‫‪ ‬این محیط برای جمعآوری و حمل نمونههای بالینی به‬
‫کار میرود‪ .‬در سال ‪ Cary and Blair 1964‬فرمول‬
‫جدیدی را شرح دادند که برای انتقال نمونههای‬
‫مدفوع درست شده بود‪ .‬محیط آنها حاوی مقدار ماده‬
‫مغذی کم‪ ،‬پتانسیل اکسید و احیاء پائین و ‪ PH‬باال بود‬
‫‪ Cary‬و همکارانش روی بقاشیگال و سالمونال در این‬
‫محیط تحقیق کردند‪ .‬در بررسی ‪ 162‬نمونه مدفوع‪،‬‬
‫ارگانیسم های شیگال برای ‪ 49‬روز قابل جداسازی‬
‫بودند سالمونالها برای ‪ 45‬روز در پی تلقیح سازی‬
‫وقتی آلوده کنندههای پروتئوسی و سودوموناسی‬
‫وجود داشتند و برای ‪ 62‬روز در غیاب این آلوده‬
‫کنندهها‪ ،‬قابل جداسازی بودند‪.‬‬
‫‪‬‬
‫‪ Gaines‬و همکارانش یک سلسله آزمایش روی ‪Cary and Blair‬‬
‫‪ Transport medium‬برای جمعآوری نمونههای مدفوع یا رکتال‬
‫سواب در منطقهای از تایلند که اسهال اندمیک بود انجام دادند آنها‬
‫نتیجهگیری کردند که این محیط کشت روشی کارا و موثر را برای‬
‫انتقال نمونههای مدفوع فراهم میکند‪.‬این محیط با حداقل مواد‬
‫مغذی‪ ،‬فرموله شده تا بقای ارگانیسم را بدون پاسخ و دفاع‬
‫افزایش دهد‪ .‬تایوگلیکوالت سدیم اضافه میشود تا پتانسیل‬
‫اکسید و احیای پائینی را فراهم کند‪ PH ،‬نسبتاا باال نابودی‬
‫باکتریها به علت تشکیل اسید را کاهش میدهد‪ .‬سوابهای فرو‬
‫رفته در مدفوع یا نمونههای دیگر را داخل لولههای محتوی محیط‬
‫ترانسپورت (انتقالی) قرار دهید‪ .‬لولهها در طی حمل به آزمایشگاه‬
‫در دمای اتاق نگهداری می شوند به محض رسیدن لولهها به‬
‫آزمایشگاه باید از سوابهای برای تلقیح محیطهای مغذی استفاده‬
‫کرد‪ .‬محیط کری بلر را پس از آماده سازی تا یک سال در دمای‬
‫اتاق میتوان نگهداری کرد‪.‬‬
‫نگهداری محيط های کشت تهيه شده‪:‬‬
‫‪‬‬
‫طول عمر محیط های کشت تهیه شده بستگی به نوع‬
‫اجزاء تشکیل دهنده محیط‪ ،‬نحوه نگهداری و ذخیره کردن‬
‫آنها دارد‪ .‬تمامی محیط های کشت باید دور از نور نگهداری‬
‫شوند‪ .‬تابش نور به محیط های کشت موجب تشکیل مواد‬
‫باکتریوستاتیک و باکتریساید مانند پراکسیداز می گردد‪.‬‬
‫طول عمر اغلب محیط های کشت پلیتي در دمای ‪ 4‬درجه‬
‫سانتیگراد یک هفته می باشد ولی اگر در داخل کیسه‬
‫های پالستیکی بسته بندی شوند بطوریکه هوا داخل آنها‬
‫نفوذ نکند تا ‪ 3-4‬هفته قابل مصرف هستند‪ .‬طول عمر‬
‫محیط های کشت حاوی آنتی بیوتیک بستگی به پایداری‬
‫آنتی بیوتیک موجود در آن دارد‪ .‬در مجموع محیط های حاوی‬
‫آنتی بیوتیک را در مدت یک هفته باید مصرف کرد‬
‫‪ . ‬از سوی دیگر با گذشت زمان اینگونه محیط های‬
‫کشت رطوبت خود را از دست داده‪ ،‬بدلیل افزایش‬
‫غلظت آنتی بیوتیک قدرت انتخابی آنها افزایش‬
‫می یابد‪ .‬پلیت ها را باید قبل از مصرف به دمای‬
‫اتاق رساند‪ .‬اگر پلیت محیط کشت بیش از ‪8‬‬
‫ساعت در دمای اتاق باقی بماند برای مصرف‬
‫مناسب نمی باشد‪ .‬محیط های کشت لوله اي در‬
‫مقایسه با محیط های کشت پلیتی عمر طوالنی‬
‫تري دارند‪ .‬اغلب این محیط های کشت اگر در‬
‫دمای ‪ 4‬درجه سانتیگراد نگهداری شوند ‪ 3-6‬ماه‬
‫قابل مصرف می باشند‪.‬‬
‫‪ ‬موارد استثناء‪ :‬تايوگلیكوالت براث‪ ،‬اندول‬
‫نیترات براث و ‪SIM‬فقط به مدت يكماه قابل‬
‫نگهداري مي باشند‪ .‬محیط هاي ‪CTA‬‬
‫‪ Medium‬و ‪ OF Medium‬حاوي كربوهیدرات و‬
‫مولرهینتون براث فقط به مدت ‪ 6‬هفته قابل‬
‫نگهداري مي باشند‪.‬‬
‫کنترل کيفی محيط های کشت ميکروبی‪:‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫اصطالحات مربوط به سویه های میکروبی کنترل‬
‫سویه کنترل (‪ :)Control Strain‬میکروارگانیسمی که برای‬
‫ارزیابی عملکرد میکروبی محیط کشت استفاده می شود‪.‬‬
‫سویه مرجع (‪ :)Reference Strain‬میکروارگانیسمی که حداقل تا‬
‫سطح جنس و گونه شناسایی شده و بر اساس ویژگی ها و‬
‫ترجیحاا منشا آن‪ ،‬فهرست بندی و تعریف شده است‪.‬‬
‫ذخیره های مرجع (‪ :)Reference Stocks‬کشت های بدست‬
‫آمده از پاساژ سویه مرجعی که از مراکز بین المللی تهیه شده‬
‫است‪.‬‬
‫ذخیره های کاری (‪ :)Working Stocks‬کشت مجددی که از‬
‫کشت های ذخیره جهت کنترل کیفیت محیط های کشت‬
‫استفاده می شود‪.‬‬
‫منبع سویه های کنترل‪:‬‬
‫‪.(American type culture collection) ‬این سوشها‪،‬‬
‫حداقل سوشهایی هستند که باید برای ارزیابی هر‬
‫محیط کشت استفاده شوند‪ .‬ارگانیسم های مورد‬
‫استفاده برای اهداف کنترل کیفی مي تواند از سویه‬
‫های ‪ National collection‬باشد‪ .‬سویه های دیگری‬
‫نیز ممکن است توسط سازنده محیط کشت به کار‬
‫رود که شامل مجموعه ای از سویه های وحشی‬
‫(‪ )Wild strain‬یا بدست آمده از نمونه های بیمار می‬
‫باشد که مختص هر آزمایشگاه بوده و برای انجام‬
‫آزمایش هاي بیشتر به کار می روند‪.‬‬
‫روش انجام آزمون کنترل کيفيت محيط های کشت‬
‫تهيه سوسپانسيون ميکروبی‪:‬‬
‫‪ ‬یک کشت از ارگانیسم کنترل کیفی روی پلیت‬
‫بالدآگار تهیه کنید‪ .‬بعد از انکوباسیون پلیت ‪3-5‬‬
‫کلنی ایزوله را در مقدار کمی تریپتیکیس سوی‬
‫براث )‪(TSB‬استریل حل نمایید تا سوسپانسیون‬
‫میکروبی حاصل شود و آن را برای چهار یا پنج‬
‫ساعت انکوبه نمایید‪ .‬سپس کدورت آن را با‬
‫استاندارد نیم مک فارلند تنظیم کنید‪( .‬استاندارد‬
‫نیم مک فارلند در طول موج ‪ ،625 nm‬دارای جذب‬
‫‪ 08/0‬تا ‪ 1/0‬ناتومتر می باشد)‬
‫‪ ‬به جای این روش می توان مستقیماا از کلنی‬
‫های ایزوله روي پلیت‪ ،‬سوسپانسیون میکروبی‬
‫مطابق با كدورت نیم مك فارلند تهیه كرد‪ .‬بدين‬
‫ترتیب كه ‪ 3-5‬کلنی ایزوله روی پلیت ‪ 24‬ساعته را‬
‫در ‪ 3-5‬میلی لیتر سرم فیزیولوژی استریل حل‬
‫كرده و کدورت آن را با نیم مک فارلند تنظیم‬
‫نمايید‪ .‬با هر روشی که این سوسپانسیون‬
‫میكروبي تهیه شود‪ ،‬باید كدورتي حاوی ‪107-108‬‬
‫‪ CFU/ml‬کلنی داشته باشد‪( .‬مطابق با استاندارد‬
‫نیم مک فارلند)‪.‬‬
‫بررسی آزمایش هاي عملکردی محيط کشت‬
‫(‪)PERFORMANCE TESTING‬‬
‫‪ -1 ‬آزمایش ظرفيت مغذی بودن ( ‪Nutritional‬‬
‫‪ )activity‬محيط هاي کشت پليتی مانند بالد آگار‬
‫‪ ‬سوسپانسیون اولیه را به نسبت ‪ 1‬به ‪ 100‬در نرمال‬
‫سالین یا آب مقطر استریل رقیق نموده و مقدار ‪10 µl‬‬
‫یا ‪ 01/0 ml‬سوسپانسیون رقیق شده را به محیط‬
‫کشت مورد آزمایش تلقیح كنید‪ .‬تعداد کلنی های‬
‫مورد انتظار در هر پلیت (‪ 103-104 )CFU/plate‬می‬
‫باشد‪ .‬برای اجتناب از رشد زیاد باکتری در بعضی از‬
‫محیطهای کشت انتخابی ممکن است نیاز باشد که‬
‫سوسپانسیون را ده بار رقیق تر تهیه نمايید‪.‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪ -2‬آزمايش ظرفيت مهار کنندگی محيط های کشت‬
‫انتخابی پليتي مانند مكانكي آگار‬
‫سوسپانسیون اولیه را به نسبت ‪ 1‬به ‪ 10‬در نرمال‬
‫سالین یا آب مقطر استریل رقیق نموده و مقدار ‪10 µl‬‬
‫‪ 01/0ml‬سوسپانسیون رقیق شده را به محیط‬
‫یا‬
‫کشت مورد آزمایش تلقیح کنید‪ .‬تعداد کلنی های مورد‬
‫انتظار در هر پلیت (‪ 104-105 )CFU/plate‬می باشد‪ .‬برای‬
‫اجتناب از رشد زیاد باکتری در بعضی از محیطهای کشت‬
‫انتخابی ممکن است نیاز باشد که سوسپانسیون ده بار‬
‫رقیق تر تهیه شود‪.‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪ -3‬آزمایش محيط های کشت لوله ای‬
‫هر لوله باید با ‪ 10 µl‬یا ‪ 01/0ml‬از سوسپانسیون اولیه تهیه شده‬
‫مطابق با نیم مک فارلند (بدون رقیق سازي) تلقیح شود‪ .‬گاهی‬
‫ممکن است به تلقیح کمتر یا بیشتر نیاز باشد‪.‬‬
‫محیط مورد آزمون را بعد از تلقیح تحت شرایطی که در جدول ‪2‬‬
‫آمده است‪ ،‬انکوبه نمایید‪ .‬به طور نرمال زمان انکوباسیون‪18-24 ،‬‬
‫ساعت یا ‪ 24-48‬ساعت در دمای ‪ 2±35 ºC‬می باشد‪ .‬محیط‬
‫شکالت آگار و ساير محیط های کشت برای جداسازی انتخابی‬
‫گونه های نیسریای بیماریزا باید در ‪ Co2 %5 -10‬انکوبه شوند و در‬
‫فواصل زماني‪ 18-24‬ساعت وسپس ‪ 24-48‬ساعت بررسی گردند‪.‬‬
‫برای باكتري هاي بی هوازی‪ ،‬کشتها عموماا به حداقل ‪ 48‬ساعت‬
‫انکوباسیون در شرایط بی هوازی و غنی از ‪ Co2‬نیاز دارند‪.‬‬
‫در مورد کمپیلوباکتر آگار‪ ،‬پلیتها باید در ‪ 42 ºC‬در شرایط‬
‫میکروآئروفیلیک غنی از ‪ Co2‬به مدت ‪ 48‬ساعت انکوبه شوند‪.‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪ -4‬کنترل محيط های کشت براي آزمایشهاي‬
‫بيوشيميایی‬
‫از سوسپانسیون میکروبی رقیق نشده برای كنترل این‬
‫محیطها استفاده می کنیم‪.‬‬
‫پس از تلقیح‪ ،‬تمام کشت ها را در شرایط الزم (از نظر‬
‫‪ ،Co2‬رطوبت و یا شرایط بیهوازی و درجه حرارت مناسب)‬
‫قرار داده و پس از طی مدت زمان الزم (‪ 24‬تا ‪ 48‬ساعت)‬
‫آنها را مورد بررسی قرار می دهیم‪ .‬محیط های مناسب‬
‫دارای رشد كافي از کلنی های باکتریهاي مورد نظر مي‬
‫باشند و در مورد محیطهای انتخابی مهار‬
‫میکروارگانیسمهای مورد نظر بايد مشخص باشد‪.‬‬
‫کنترل محيط های ساخته شده تجاری (آماده‬
‫مصرف)‪:‬‬
‫تتا ن تتوده‪،‬‬
‫•رطوب ت ‪ :‬محیطه تتات بش ت ناه تتن ن تتنوا ا تتر و ت رطوب ت‬
‫امچن تتیا ا تتیا ش تتا ت ز فش ت ش تتنا ط تتر مح تتی بش ت ا تتن‬
‫مشاانه گردد‪.‬‬
‫•ستروا نودا‪ :‬محیطهات بش ناهن عاري زآلود ی ناشنن‪.‬‬
‫ر ت ت ‪ :‬محیطهت تتات بش ت ت آ ت تتار فو ت تتن ر اهت تتن ات تتیا شت تتا ت ز امت تتولی‬
‫د شتتب ناشتتنن و محیطهتتات بش ت دهگتتر اهتتن ایچگو ت ییتتر ر ت یتتر‬
‫ط یع د شب ناشنن‪.‬‬
‫بررسی آلودگی محيط های کشت‬
‫(استریل بودن محيط های کشت)‪:‬‬
‫‪ ‬در صورتیکه تعداد پلیت یا لوله تهیه شده در هر‬
‫سری ساخت یا ‪ 100 ،Lot‬عدد یا کمتر باشد‪ ،‬باید‬
‫به تعداد ‪ %3-5‬محیط هاي تهیه شده را در دماي‬
‫‪ 35-37 ºC‬به مدت ‪ 2-5‬روز انکوبه نمود‪ .‬برای ‪Lot‬‬
‫های با تعداد بیش از ‪ ،100‬باید به تعداد ‪ 10‬پلیت‬
‫یا لوله را به طور تصادفی برداشته و در شرایط‬
‫فوق انکوبه نمود‪ .‬بعد از انکوباسیون هیچ گونه‬
‫رشد میکروبی نباید مشاهده شود‪.‬‬
‫‪ ‬یک محیط کشت زمانی قابل قبول می باشد که با‬
‫همه سویه های پیشنهادی برای آزمون محیط کشت‬
‫که در جدول ‪ 2‬مشخص شده است‪ ،‬رشد کافی‬
‫داشته و خصوصیات مورفولوژیكي کلنی ها بارز باشد‪.‬‬
‫در مورد محیط های انتخابی‪ ،‬رشد بعضی از‬
‫ارگانیسم های خاص مهار می شود‪ ،‬ضمن اینکه‬
‫اجازه رشد کافی به سايرارگانیسم می دهد‪ .‬در‬
‫بعضی موارد‪ ،‬واکنشهای رنگی خاص یا همولیز‬
‫همچنانکه در جدول ‪ 2‬آمده است‪ ،‬باید ایجاد شود‪.‬‬
‫مثال ا در مورد کشت بالدآگار ایجاد همولیز مناسب‬
‫ضروری است و یا برای محیط مکانکی آگار ایجاد‬
‫واکنش های رنگی برای سویه های میکروبی‬
‫مشخص ضروری می باشد‪.‬‬
‫سایر معيارهای تضمين کيفيت‪:‬‬
‫‪ ‬محیطهای کشت آماده مصرف باید از نظرموارد زیر نیز‬
‫بررسی شوند‪:‬‬
‫‪ ‬شکستگی ظروف پتری‬
‫‪ ‬پر شدن ناصاف پلیتها‬
‫‪ ‬ترک خوردگی محیط کشت در پلیتها‬
‫‪ ‬وجود همولیز (برای بالد آگار)‬
‫‪ ‬یخ زدگی‬
‫‪ ‬وجود مقدار زیاد حباب یا حفره در سطح محیط كشت‬
‫جدول ‪ -2‬كنترل كيفي محيط هاي كشت متداول‬
‫نگهداري ديسكهاي آنتي بيوتيكي‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫ديسكها بايد در دمای ‪ -8‬تا ‪-14‬درجه سانتیگراد نگهداري شوند‪.‬‬
‫تمامي ديسكهاي آنتیبیوتیکی گروه بتاالكتام مانند‬
‫تیكارسیلین‪،‬‬
‫كربنيسیلین‪،‬‬
‫آمپيسیلین‪،‬‬
‫پنيسیلین‪،‬‬
‫اگزاسیلین و نسل اول‪ ،‬دوم و سوم سفالوسپورينها و‪ ...‬بايد در‬
‫فريزر نگهداري شوند و فقط ميتوان مقداري از آن را بر اساس‬
‫كار روزانه آزمايشگاه حداكثر به مدت يك هفته در يخچال‬
‫معمولی نگهداري نمود‪.‬‬
‫ديسكها بايد در ظروف داراي درپوش محكم و حاوي مواد جاذب‬
‫رطوبت نگهداري شوند‪.‬‬
‫ديسكهاي آنتيبیوتیكي بايد يك تا دو ساعت قبل از استفاده از‬
‫يخچال يا فريزر خارج شوند تا به درجه حرارت اتاق برسند‪.‬‬
‫کنترل کيفيت قطر هاله عدم رشد سويه‬
‫کنترلي‪ /‬ديسک آنتي بيوتيکي‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫سويه هاي کنترل کیفي را بايد به روش استاندارد‬
‫آزمايش ‪disk diffusion‬و با استفاده از همان مواد و روشي‬
‫که براي سويه هاي جدا شده از نمونه هاي کلینیکي‬
‫استفاده مي شود آزمايش و نتايج را با جداول‬
‫‪ CLSI‬مقايسه و بررسي نمود ‪ .‬محدوده قطر هاله عدم‬
‫رشد قابل قبول براي هر سويه کنترلي نسبت به يک‬
‫ديسک آنتي بیوتیکي در جداول فوق فهرست شده است ‪.‬‬
‫چنانچه تغییر در میانگین قطر هاله عدم رشد ناشي از خطا‬
‫در روش انجام آزمايش نباشد ‪ ،‬احتماال" ناشي از تغییر در‬
‫حساسیت ذاتي باکتري نسبت به آن آنتي بیوتیک مي‬
‫باشد‪ .‬در اين صورت الزم است کشت تازه از سوش کنترل‬
‫تهیه شود ‪.‬‬
‫آزمايش کنترل کيفيت را بايد درچه فواصل‬
‫زماني انجام داد ؟‬
‫‪ ‬الف _ انجام آزمايش روزانه‬
‫‪ ‬براي هر سويه کنترلي با يک ديسک آنتي بیوتیکي‬
‫بايد ‪ 20‬روز متوالي آزمايش تعیین حساسیت انجام و‬
‫نتايج با مقادير قابل قبول اشاره شده در جداول فوق‬
‫مقايسه گردد ‪ .‬بر اساس ضريب اطمینان ‪ %95‬تنها‬
‫يک مورد از ‪ 20‬نتیجه قرائت شده مي تواند خارج از‬
‫محدوده كنترل باشد ( به ضمیمه ‪2‬مراجعه کنید) ‪.‬‬
‫چنانچه بیشتر از يک مورد خارج از محدوده کنترل‬
‫باشد نیاز به اقدامات اصالحي خواهد بود ‪ ،‬که در‬
‫ادامه توضیح داده مي شود‪.‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫ب _ انجام آزمايش هفتگي‬
‫ در صورتیكه تنها يک مورد از ‪ 20‬نتیجه قطر هاله عدم‬‫رشد براي هر سويه کنترلي‪ /‬ديسک آنتي بیوتیکي خارج‬
‫از محدوده قابل قبول مندرج در جداول ‪ 3‬و ‪ (3A‬ضمیمه ‪)3‬‬
‫قرار گیرد ‪ ،‬کنترل کیفي روزانه را به هفتگي تغییر دهید(‬
‫به ضمیمه ‪ 2‬مراجعه کنید) ‪.‬‬
‫ آزمايش کنترل کیفي هفتگي را يکبار در هفته و هم‬‫چنین زمانیکه يکي از عوامل آزمايش (مانند سري ساخت‬
‫آگار يا ديسکهای تهیه شده از يک سازنده) تغییر کند‪،‬‬
‫انجام دهید ‪.‬‬
‫اگر هر يک از نتايج کنترل کیفي هفتگي خارج از محدوده‬
‫قابل قبول باشد ‪ ،‬انجام اقدامات اصالحي مورد نیاز است‬
‫‪.‬‬
‫نگهداري و استفاده از سويههاي باکتريايي‬
‫‪ ‬براي نگهداري سويههاي باکتريايي ميتوان از دو‬
‫روش استفاده نمود‪.‬‬
‫‪ ‬روش طوالني مدت‬
‫‪ ‬روش کوتاه مدت‬
‫‪ ‬نگهداري طوالني مدت‬
‫‪ ‬نگهداري طوالنيمدت باکتريها اين امکان را‬
‫ميدهد که کلیه سويههاي میکروبي اعم از‬
‫هوازي (بارشد سريع ويا سخت رشد) ونیز‬
‫بیهوازي ‪ ،‬ماهها و حتي سالها به صورت زنده‬
‫نگهداري شوند‪ .‬بهترين روشهاي نگهداري طوالني‬
‫مدت شامل لیوفیلیزاسیون (‪ )Freeze drying‬و‬
‫نگهداري در دماي ‪ -70‬درجه سانتيگراد يا پايین‬
‫تر ( در ديپ فريز يا در نیتروژن مايع ) ميباشد‪.‬‬
‫‪ -1 ‬نگهداري در ديپ فريز ( ‪ -50‬تا ‪ -70‬درجه‬
‫سانتيگراد يا پايینتر) ويا نیتروژن مايع ‪:‬‬
‫‪ ‬باکتري مورد نظر را روي محیط مغذي مانند پلیت‬
‫‪ ) TSA ( Trypticase Soy Agar‬حاوي ‪ %5‬خون‬
‫گوسفند و در مورد میکروارگانیسمهاي سخت‬
‫رشد روي محیط آگار شکالته کشت دهید‪ .‬پلیتها‬
‫را به مدت ‪ 18-24‬ساعت در دماي ‪ 35±2‬درجه‬
‫سانتيگراد و در صورت نیاز تحت شرايط ‪ 2CO‬براي‬
‫هر باکتري انکوبه نمائید‪.‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫بعد از انکوباسیون‪ ،‬خالص بودن و مورفولوژي کلنيها را بررسي‬
‫نموده و در صورت نیاز‪ ،‬تستهاي بیوشیمیايي آنرا انجام دهید‪.‬‬
‫سپس از باکتري رشد يافته ‪ ،‬سوسپانسیون غلیظي در ‪50-100‬‬
‫میليلیتر از يک محیط محافظتکننده از سرما (‪) Cryoprotective‬‬
‫تهیه نمائید‪ .‬اين محیط براي جلوگیري از تخريب سلولهاي باکتري‬
‫در شرايط انجماد مورد استفاده قرار ميگیرد‪ .‬محیط محافظتکننده‬
‫از سرما ميتواند ‪ ، Skim milk‬خون گوسفند يا خرگوش دفیبرينه‬
‫استريل يا ‪ )Tryptic Soy Broth (TSB‬حاوي گلیسرول با غلظت‬
‫نهايي ‪ %10-15‬باشد‪.‬‬
‫سپس از سوسپانسیون باکتريايي فوق به مقدار ‪ 5/0- 1mL‬در‬
‫ويالهاي شیشهاي يا پالستیکي کوچک استريل توزيع کنید ‪ .‬تعداد‬
‫ويال ذخیره خود را براي مصرف يکسال آماده نمائید‪.‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫سويههاي سخت رشد مانند هموفیلوس انفلوآنزا و نیسريا‬
‫گنوره در اين دما قابل نگهداري نميباشند و بايد در فريزر ‪-70‬‬
‫درجه نگهداري شوند‪.‬‬
‫سويههاي بارشد سريع در اين دما عمر کمي دارند و تعداد‬
‫زيادتري از آنها از بین ميروند‪ .‬بنابراين توصیه ميشود براي‬
‫اطمینان از حیات سويهها هر چند ماه ‪ ،‬طبق روش زير کشت‬
‫داده شوند‪.‬‬
‫يک ويال از فريزر بیرون آورده و و سريعا زير آب جاری ولرم‬
‫محتويات آنرا ذوب نمائید‪ .‬نمونه را روي محیط آگار خوندار يا‬
‫شکالته ( در مورد باکتريهاي سخت رشد ) تلقیح کرده و به مدت‬
‫‪ 18-24‬ساعت در دماي ‪ 35±2‬درجه ودر صورت نیاز در شرايط‬
‫‪ 2CO‬انکوبه نمايید‪ .‬اين باکتري ميتواند براي آزمايشهاي کنترل‬
‫داخلي کیفیت در آزمايشگاه يا براي تهیه ‪ working control‬بکار‬
‫رود‪ .‬قبل از هر اقدام بايد از خالص بودن نمونه ‪ ،‬اطمینان حاصل‬
‫کرد‪ .‬ويال مورد استفاده بعد از ذوب شدن بايد دور انداخته شده‬
‫و بهیچوجه مجددا فريز نگردد‪.‬‬
‫کشتهاي ‪:WORKING CONTROL‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫عبارتست ازکشت مجدد از کشت ذخیره فريز شده که براي‬
‫کنترل کیفیت محیط کشت و‪ ..‬استفاده ميشود‪.‬‬
‫از کشت ذخیره تا ‪ 3‬پاساژ پشت سر هم ميتوان انجام داد ‪.‬‬
‫پس از آن ‪ ،‬نمونه بايد دور انداخته شده و از يک کشت ذخیره‬
‫فريز شده ديگر براي تهیه کشتهاي ‪ working control‬استفاده‬
‫شود‪ .‬پاساژهاي مکرر( بیش از ‪ 3‬پاساژ)‪ ،‬احتمال تغییر فنوتیپي‬
‫سويهها را افزايش ميدهد‪.‬‬
‫براي تهیه ‪ ، working control‬از کشت ذخیره فريز شده ‪ ،‬روي‬
‫پلیت يا آگار شیبدار تلقیح و آنرا به مدت يک شبانهروز تا زماني‬
‫که رشد مناسبي بدست آيد‪ ،‬انکوبه نمائید‪ .‬در مورد‬
‫ارگانیسمهاي با رشد سريع اين پلیت يا آگار شیبدار را ميتوان‬
‫در ‪ 2-8‬درجه سانتیگراد يا در دماي اتاق تا مدت ‪ 4‬هفته‬
‫نگهداري نمود‪ .‬بعد از هر پاساژ‪ ،‬خالص بودن و مورفولوژي‬
‫کلنيها را بررسي نمائید‪.‬‬
‫ استفاده از روغن معدني در دماي اتاق ‪:‬‬‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪ -1‬محیط کشت ‪ )Brain Heart Infusion Agar (BHIA‬را با شیب‬
‫کم در لوله تهیه نمايید‪ .‬براي باکتريهاي مشکلپسند مانند‬
‫گونوکک ‪ ،‬مننگوکک ‪ ،‬استرپتوکک پنومونیه و هموفیلوس آنفلوانزا‬
‫‪ ،‬الزم است محیط شکالت آگار را با افزودن ‪ %5‬خون گوسفند‬
‫به محیط فوق پس از خروج از اتوکالو و رسیدن به دمای ‪50‬‬
‫درجه سانتیگراد و قرار دادن در بنماري ‪ 80‬درجه سانتيگراد‬
‫به مدت ‪ 15‬دقیقه تهیه نمود‪.‬‬
‫‪ -2‬روغن معدني ( يا پارافین مايع ) را در حرارت خشک ( ‪170‬‬
‫درجه سانتيگراد به مدت يکساعت ) استريل نمائید‪.‬‬
‫‪ -3‬میکروب مورد نظر را روي محیط کشت دهید‪.‬‬
‫‪ -4‬بعد از بدست آوردن کشت کافي ‪ ،‬روغن استريل را به مقدار‬
‫‪ 1cc‬روي سطح محیط بريزيد‪.‬‬
‫‪ -5‬در صورت نیاز به کشت مجدد ‪ ،‬نمونه از سطح آگار (زير روغن‬
‫) برداشته ميشود‪.‬‬
‫‪ -6‬بعد از ‪ 6-12‬ماه تجديد کشت نمايید‪.‬‬
‫ کشت عمقي و نگهداري در دماي اتاق ‪:‬‬‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫اين روش فقط براي باکتريهايي که مشکلپسند نیستند مانند‬
‫استافیلوکک وخانواده انتروباکترياسه بکار ميرود‪.‬‬
‫يک محیط کشت آگار بدون کربوهیدرات مانند ‪ TSA‬را باعمق‬
‫‪-1‬‬
‫زياد در لوله تهیه نمايید‪.‬‬
‫‪ -2‬باکتري را بصورت کشت عمقي در در اين محیط تلقیح نمايید‪.‬‬
‫‪ -3‬اين محیط را ‪ 24‬ساعت در اتو ‪ 35‬درجه انکوبه نمائید‪.‬‬
‫‪ -4‬در لوله را با درپیچ يا چوب پنبه ببنديد‪.‬‬
‫‪ -5‬لوله در پیچدار را در پارافین مايع فرو ببريد به گونهاي که کامال‬
‫در لوله را بپوشاند‪.‬‬
‫‪ -6‬کشتها را در حرارت اتاق نگهداري نمائید‪.‬‬
‫‪ -7‬هرساله سوش موردنظر را تجديد نمائید‪.‬‬
‫تست حساسيت‪:‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫تست حساسیت با توجه به رشد نمونه و اهمیت ارگانیسم توسط‬
‫روش نیمه مک فارلند یا روش استاندارد دیسک دیفیوژن کربیبایر‬
‫انجام میشود‪.‬‬
‫ نگهداري طوالني مدت‬‫براي نگهداري سويههاي باكتري ميتوان از روشهاي طوالني و‬
‫كوتاه مدت استفاده نمود‪.‬‬
‫بهترين روشهاي نگهداري طوالني مدت شامل لیوفیلیزاسیون‬
‫)‪ (Freeze drying‬و نگهداري در دماي ‪ -70‬درجه سانتیگراد يا پايینتر‬
‫(در ديپفريز يا در نیتروژن مايع) ميباشد‪.‬‬
‫در صورت عدم دسترسي به فريزر ‪ -70‬درجه ميتوان سويههاي با‬
‫رشد سريع را در فريزر ‪ -20‬درجه نیز نگهداري نمود‪.‬‬
‫‪ ‬در اين شرايط توجه به نكات زير ضروري است‪:‬‬
‫‪ ‬سويههاي سخت رشد مانند هموفیلوس آنفلوآنزا و‬
‫نیسريا گنوره در اين دما قابل نگهداري نميباشند و‬
‫بايد در فريزر ‪ -70‬درجه نگهداري شوند‪.‬‬
‫‪ ‬روش دیگر استفاده از روغن معدني در دماي اتاق‬
‫میباشد که در این روش روغن معدني (يا پارافین‬
‫مايع) را در حرارت خشك (‪ 170‬درجه سانتیگراد به‬
‫مدت يك ساعت) استريل مینمایند و سپس میكروب‬
‫مورد نظر را روي محیط كشت داده و بعد از بدست‬
‫آوردن كشت كافي‪ ،‬روغن استريل را به مقدار ‪1 cc‬‬
‫روي سطح محیط میریزند‬
‫تهيه كدورت استاندارد نيم مك فارلند‬
‫‪ ‬هدف‪:‬‬
‫‪ ‬جهت استاندارد کردن غلظت تلقیح براي آزمايش‬
‫تعیین حساسیت میكروبي‪ ،‬بايد از استاندارد‬
‫سولفات باريم (‪ ،)BaSo4‬برابر با استاندارد نیم مک‬
‫فارلند استفاده شود‪.‬‬
‫‪‬‬
‫‪ -2 ‬مواد و ابزار الزم‪:‬‬
‫‪ ‬کلرور باريم دهیدراته‪ ،‬اسیدسولفوريک‪ ،‬مزور‪ ،‬بالن‬
‫ژوژه‪ ،‬لوله آزمايش در پیچ دار استريل‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫ روش انجام کار‪:‬استاندارد نیم مک فارلند سولفات باريم به روش زير تهیه‬‫مي شود‬
‫‪ 5/0ml )1‬از کلرور باريم (‪ )%175/1 W/VBaCl2. 2H2O( 048/0 mol/l )BaCl2‬را‬
‫به ‪ 99 /5ml‬اسید سولفوريک ‪ )%1 V/V( 18/0 mol/l‬اضافه کنید و با هم زدن‬
‫مداوم سوسپانسیون بدست آوريد‪.‬‬
‫‪ )2‬چگالي صحیح کدورت استاندارد با استفاده از اندازه گیري جذب در اسپکترو‬
‫فتومتر با طول مسیر نوري ‪ ،1cm‬مشخص شود‪ .‬جذب در ‪ 625nm‬بايد بین‬
‫‪ 08/0‬تا ‪ 13/0‬باشد‪.‬‬
‫‪ )3‬سوسپانسیون سولفات باريم بايد به مقدار ‪ 4-6ml‬در لوله هاي در پیچ دار‬
‫هم اندازه با لوله هاي سوسپانسیون باکتريايي ريخته شود‪.‬‬
‫‪ )4‬درب اين لوله ها بايد محکم بسته شوند و در دماي اتاق و در تاريکي‬
‫نگهداري گردند‪.‬‬
‫‪ )5‬استاندارد سولفات باريم قبل از هر بار استفاده بايد به شدت (ترجیحا با‬
‫ورتکس مکانیکی) همزده شود‪ ،‬تا کدورت يکنواختي ايجادگردد‪ .‬در صورت‬
‫مشاهده ذرات بزرگ‪ ،‬بايد استاندارد تازه اي تهیه گردد‪.‬‬
‫‪ )6‬استاندارد سولفات باريم بايد به صورت ماهانه جايگزين شود يا جذب آن اندازه‬
‫گیري گردد‪.‬‬
‫کنترل کيفی و کاليبراسيون لوپ ميکروب شناسی‬
‫‪‬‬
‫از بین وسایل مورد استفاده در بخش میکروب شناسی‬
‫لوپ میکروب شناسی از جمله ابزارهای مهم و اصلی بوده‬
‫و ارزش آن همانند پی پت در آزمایشگاه بیوشیمی و‬
‫سرولوژی است ‪.‬بدین معنی که اگر از مقدار برداشت شده‬
‫توسط لوپ محاسبه دقیق به عمل نیاید در گزارش نتایج‬
‫آزمایش تاثیر زیادی خواهد داشت ‪ .‬لذا به سبب عدم وجود‬
‫روش استاندارد جهت کالیبراسیون لوپ و نظر به اهمیت آن‬
‫در این مقاله سعی شده است که راه کارهای مناسب و‬
‫عملی برای کالیبراسیون لوپ میکروب شناسی ارائه گردد ‪.‬‬
‫در بررسی انجام شده دو روش محاسبه حجم توسط روش‬
‫اسپکتروفتومتری و روش استفاده از ترازو مورد ارزیابی قرار‬
‫گرفته اند ‪.‬‬
‫‪ ‬در اینجا حجم برداشت شده توسط دو نوع لوپ مورد‬
‫مصرف که تحت عنوان لوپ های تجاری در بازار موجود‬
‫بوده و به عنوان لوپ ‪ 0.01‬و لوپ ‪ 0.001‬استفاده‬
‫میشوند مورد بررسی قرار گرفت و نیز با توجه به‬
‫اینکه برخی از آزمایشگاه های تشخیص پزشکی لوپ‬
‫های دست ساز را که با استفاده از پیچیدن سیم به‬
‫دور دسته فلزی لوپ تهیه می شوند مورد استفاده‬
‫قرار می دهند این نوع لوپ ها نیز به دو روش‬
‫اسپکتروفتومتری و توزین مورد ارزیابی قرار گرفتند ‪.‬‬
‫همچنین مقدار حجم برداشتی توسط لوپ ها به‬
‫صورت تخمینی و از طریق ریاضی مورد بررسی قرار‬
‫گرفت ‪.‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫الف ) روش اسپکتروفتومتری ‪ :‬در این روش از یک ماده‬
‫رنگی که دارای جذب نوری در طول موج خاص است‬
‫استفاده می گردد ‪ .‬معموال از ماده رنگی اوانس بلو برای‬
‫این آزمایش استفاده میشود اما با توجه به کمبود و گران‬
‫بودن ماده مزبور در این بررسی از متیلن بلو که از نظر‬
‫اقتصادی به صرفه بوده و در اکثر آزمایشگاه ها موجود است‬
‫استفاده شد ‪.‬‬
‫مواد مصرفی و معرف ها شامل موارد زیر بود ‪:‬‬
‫پودر متیلن بلو – الکل طبی ‪ ( %96‬اتانول ) – آب مقطر –‬
‫لوپ های ‪ 0.01‬و ‪ 0.001‬و لوپ های دست ساز – لوله‬
‫آزمایش – پی پت – سمپلر ‪ 20‬الندا – اسپکتروفتومتر‬
‫‪‬‬
‫ابتدا ‪ 0.1 – 0.2‬گرم از پودر متیلن بلو را در حاللی که از‬
‫مخلوط کردن آب مقطر و الکل ‪ %96‬به نسبت ‪ 50‬به ‪50‬‬
‫تهیه شده حل می کنیم ‪ .‬پس از حل شدن کامل متیلن‬
‫بلو در حالل مزبور ‪ 8‬لوله آزمایش انتخاب کرده در لوله اول‬
‫‪ 2‬میلی لیتر و در بقیه لوله ها ‪ 1‬میلی لیتر از حالل‬
‫ساخته شده را می ریزیم ‪ .‬سپس مقدار ‪ 0.02‬میلی لیتر‬
‫از محلول متیلن بلو را به کمک سمپلر کالیبره شده به‬
‫محلول اضافه کرده و پس از مخلوط کردن ‪ 1‬میلی لیتر از‬
‫محلول مزبور را به لوله دوم انتقال می دهیم و این عمل‬
‫را تا لوله هشتم پی می گیریم ( رقت های سریالی‬
‫)‪.‬پس از تهیه رقت های مزبور جذب نوری هر یک از لوله‬
‫ها را در طول موج ‪ 663‬نانومتر قرائت کرده و ثبت می‬
‫کنیم ‪.‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫با توجه به کاهش تصاعدی رقت لوله ها از کاغذ لگاریتمی‬
‫برای تهیه منحنی استاندارد استفاده میشود ‪ .‬پس از‬
‫ترسیم منحنی برای کالیبره کردن لوپ ‪ 10-15‬لوله برداشته‬
‫و در هر یک از آنها ‪ 1‬میلی لیتر از حاللی که تهیه کرده‬
‫بودیم می ریزیم و به کمک لوپ از محلول رنگی ( متیلن بلو‬
‫) در لوله ها وارد می کنیم ‪ .‬پس از خواندن جذب نوری آنها‬
‫در طول موج ‪ 663‬نانومتر و به دست آوردن میانگین جذب‬
‫نوری و انتقال آن بر روی منحنی مقدار حجم برداشته شده‬
‫توسط لوپ به راحتی به دست می آید ‪.‬‬
‫از آنجا که مقدار کلنی بر اساس ‪CFU/ml ( colong forming‬‬
‫‪ ) unit‬گزارش می گردد اگر ‪ 1‬میلی لیتر را که برابر با ‪1000‬‬
‫الندا می باشد بر حجم به دست آمده تقسیم کنیم ضریب‬
‫لوپ مجهول به دست خواهد آمد‪.‬‬
‫‪ ‬ب ) روش توزین ‪ :‬در این روش ترازوی حساس با‬
‫دقت ‪ 0.001‬گرم مورد نیاز است و از آنجا که وزن و‬
‫حجم آب مقطر خالص مساوی هستند می توان‬
‫به کمک لوپ از آب مقطر برداشت کرد و بر روی‬
‫یک دیسک آنتی بیوگرام قرار داد و با توزین توسط‬
‫ترازو مقدار حجم برداشتی را محاسبه کرد ‪ .‬در‬
‫این روش ابتدا دیسک آنتی بیوگرام توزین می‬
‫شود سپس مقدار افزایش وزن بر اثر برداشت آب‬
‫مقطر توسط لوپ محاسبه می گردد ‪ .‬اگر این‬
‫عمل را ‪ 10 -15‬بار تکرار کرده و میانگین افزایش‬
‫وزن را ثبت کنیم حجم برداشتی توسط لوپ به‬
‫دست خواهد آمد‪.‬‬
‫‪ ‬ج ) روش محاسبه ریاضی ‪ :‬در این روش اگر قطر‬
‫سیم مورد استفاده در ساخت لوپ را توسط میکرومتر‬
‫اندازه گیری کرده و قطر داخلی حلقه لوله را توسط‬
‫کولیس محاسبه کنیم حجم برداشتی از طریق‬
‫محاسبه حجم استوانه به دست می آید ‪ .‬این روش‬
‫برای محاسبه مقدار برداشتی توسط لوپ چندان‬
‫دقیق نیست زیرا حجم برداشتی توسط لوپ در‬
‫مقایسه با روش های استاندارد حجم بیشتری را‬
‫نشان می دهد و در عمل از آنجا که کشش سطحی‬
‫بافت باعث می شود مقدار کمتری از محلول در مرکز‬
‫لوپ قرار گیرد میزان برداشتی نهایی کمتر خواهد بود‬
‫‪.‬‬
‫‪ ‬نتیجه بررسی ‪ :‬مقایسه نتایج حاصل از بررسی ‪3‬‬
‫روش فوق نشان می دهد که حجم برداشت‬
‫شده توسط لوپ هایی که به عنوان لوپ تجاری‬
‫عرضه میشوند استاندارد نیست برای مثال با لوپ‬
‫تجاری ‪ 0.001‬مقدار برداشتی لوپ ‪ 0.6‬الندا می‬
‫باشد و در مورد لوپ ‪ 0.01‬مقدار برداشتی ‪2.4‬‬
‫الندا است ‪ .‬در نهایت ضریب لوپ ‪ 0.001‬برابر با‬
‫‪ 1666.66‬و لوپ ‪ 0.01‬برابر با ‪ 416.66‬و لوپ دست‬
‫ساز تقریبا معادل ‪ 338‬است که با مقادیر ادعا‬
‫شده تفاوت دارند‬
‫با توجه به بررسی های مزبور موارد زیر پیشنهاد میشود ‪:‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫ لوپ هایی که تحت عنوان ‪ 0.01‬و ‪ 0.001‬به صورت تجاری‬‫به فروش می رسند استاندارد نبوده و هر آزمایشگاه می‬
‫باید نسبت به کالیبراسیون و تععین ضریب دقیق لوپ‬
‫مصرفی اقدام کند‪.‬‬
‫‪ -2‬در صورت عدم کالیبراسیون لوپ مصرفی شمارش کلنی‬
‫در کشت ادرار به صورت تخمینی گزارش شود‪ ( .‬کمتر از‬
‫‪ 1000‬یا ‪ 1000-10000‬یا بیشتر از ‪) 10000‬‬
‫‪ -3‬برای کالیبراسیون لوپ به علت مجهز نبودن اکثر‬
‫آزمایشگاه ها به ترازوی حساس روش اسپکتروفتومتری‬
‫پیشنهاد می شود ‪.‬‬
‫‪ -4‬حتی المقدور سعی گردد تا لوپ ها به صورت‬
‫پالستیکی و یک بار مصرف تهیه شود ‪.‬‬
‫انكوباتور‬
‫‪ ‬انكوباتور محفظه عايق بندي شدهاي است‬
‫كه دما و رطوبت را كنترل کرده و محیط را براي‬
‫رشد میكروارگانیسمها فراهم میسازد‪.‬‬
‫برخی از انكوباتورها براي نگهداري میزان‬
‫مطلوب از دیاکسیدکربن ‪ Co2‬براي‬
‫میكروبهايي كه برای رشد به ‪ CO2‬نیاز دارند‬
‫)‪(Capnophilic‬در دسترس هستند‪.‬‬
‫‪-‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫انكوباتور بدون ‪:Co2‬‬
‫در این انکوباتور نمونهها باید بطور مناسب روي سینيها‬
‫يا قفسهها قرارگیرد‪.‬‬
‫ميتوان با قرار دادن يك مخزن آب در كف انكوباتور‪ ،‬رطوبت‬
‫مورد نیاز را حفظ کرد‪.‬‬
‫ انكوباتور ‪Co2‬دار‪:‬‬‫دراین انکوباتور برای تأمین دیاکسید کربن مورد نیاز از‬
‫کپسول گاز ‪ CO2‬استفاده میشود‪.‬‬
‫در صورت اتمام كپسول گاز ‪ ،Co2‬تا زمان شارژ مجدد‬
‫ميتوان جهت انكوباسیون نمونههاي نیازمند ‪Co2‬از جار‬
‫بیهوازی یا کندل جار که از سوزاندن شمع به عنوان منبع‬
‫‪ CO2‬استفاده میشود بصورت جايگزين استفاده کرد‪.‬‬
‫ مراقبت از انکوباتور‪:‬‬‫ام كوباتوراا نا ن نطور مااا نا محلول صانوا مال م تمی شو ن‪.‬‬‫كپسولااي ‪Co2‬ن منظور رعا مو رد مني‪ ،‬نا ن ن صتور يستباده نتا ز جیتر‬‫سنگیا ن د و ر محكم شو ن‪.‬‬
‫زما ي ك ز سيلننراا سبفاده ميشود‪ ،‬سوپاپاا و درپوشاا نا ن ن طور محكتم‬‫بس تتب ش تتو ن‪ .‬س تتيلننرااي ف تتاي ر روي هم تتد كنن تتنه س تتيلننر تتاز ن ت ط تتور محك تم ن تتا‬
‫ز جیتتر گهتتن ري كنيتتن‪ .‬ارگتتس ستتيلننرااي تتاز ر در دمتتاي نتتا تر ز ‪ 52‬درجت ستتا ایگر د‬
‫ه تتا ‪ 125‬درجت ت هارت اهت ت گه تتن ري كني تتن‪ .‬جهت ت جل تتوگیرت ز شت ت ‪ ،‬س تتيلننراا ر در‬
‫و عي هقي قر ر ناين‪.‬‬
‫نتتر ت بنتتترل و تتعی ‪ CO2‬کوبتتاتور‪ ،‬تتا كش ت ز وستتر ا و تتوره در كوبتتاتور‬‫قتتر ر دايتتن‪ ،‬اتتر روز آا ر داستتا د ده و رشتتنش ر نررست ي ما يتتن‪ .‬تتا ر ا وستتم نت‬
‫‪ Co2‬ياز كامد د رد‪.‬‬
‫اتوكالو‬
‫‪ ‬اگر چه اتو كالو بهترين وسیله براي‬
‫استريلیزاسیون است‪ ،‬ولي طوالني شدن مرحله‬
‫گرمايي‪ ،‬سبب كاهش كیفیت مواد مغذي در‬
‫محیطهاي كشت كمپلكس محتوي قند‪ ،‬مواد‬
‫معدني و فلزي ميشود و در نتیجه به محیطهاي‬
‫كشت زيان وارد ميكند‪ ،‬بنابراين در چرخهي‬
‫استريلیزاسیون بايد از زمان كوتاهتر و دماي باالتر‬
‫استفاده كنیم تا عالوه بر آنكه آسیب كمتري به‬
‫محیط كشت وارد شود‪ ،‬براي ارگانیسم كشندهتر‬
‫باشد‪.‬‬
‫ انواع استريليزاسيون‬‫‪‬‬
‫استريلیزاسیون محیطهاي‬
‫كشت و محلولها‬
‫‪‬‬
‫استريلیزاسیون‬
‫مواد‬
‫مصرفي آلوده‬
‫‪‬‬
‫استريلیزاسیون‬
‫مواد‬
‫خشك بسته بندي شده‬
‫نکات کاربردی‪:‬‬
‫‪ ‬بهتر است از لوله و ارلن با در پیچدار شل که بیشتر از‬
‫آن پرنشده است استفاده کنید‪.‬‬
‫‪ ‬جهت برقراری جریان مناسب سفارش میشود که از‬
‫قرار دادن اشیا بر روي يكديگر بپرهیزيد و بايد فاصله‬
‫اشیا از يكديگر و از ديوارههاي اتوكالو حداقل ‪5‬‬
‫سانتیمتر باشد‪.‬‬
‫‪ ‬چرخهي استريلیزاسیون بايد متناسب با زمان نفوذ‬
‫گرما در نظر گرفته شود‪ ،‬براي مثال محتويات يك ظرف‬
‫يك لیتري محیط كشت بايد طي ‪ 15‬دقیقه از زمان‬
‫رسیدن محفظه به دماي ‪ ،121˚c‬به اين دما برسد‪.‬‬
‫استريليزاسيون مواد مصرفي آلوده‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫مواد مصرفي آلوده را جدا نموده و در كیسههاي قابل‬
‫اتوكالو قرار دهید و بر روي آنها برچسب خطر بیولوژیک‬
‫)‪ (Biohazard‬نصب كنید‪.‬‬
‫براي اطمینان از نفوذ بخار به همه قسمتهاي كیسه‪ ،‬يا‬
‫گره آن را شل كنید يا قبل از محكم كردن گره‪ ،‬يك پیمانه‬
‫(‪ 0.3‬لیتر) آب به آن اضافه كنید‪.‬‬
‫براي جلوگیري از مسدود شدن آبگذر اتاقك اتوكالو توسط‬
‫آگار مذاب‪ ،‬كیسهها را داخل سطل فلزی قرار دهید‪.‬‬
‫زمان الزم براي استريلیزاسیون زباله‪ 30-60 ،‬دقیقه در ‪121‬‬
‫درجه سانتیگراد يا ‪ 15-30‬دقیقه در ‪ 134‬درجه سانتیگراد‬
‫ميباشد‪.‬‬
‫‪ ‬استريليزاسيون مواد خشك بسته بندي‬
‫شده از قبيل سوآب و لوله آزمایش‪:‬‬
‫‪ ‬بستهها را طوري در اتوكالو قرار دهید كه حداكثر‬
‫چرخش بخار در بین آنها ايجاد شود وبا ديوارههاي‬
‫اتوكالو نیز تماسي نداشته باشند‪.‬‬
‫‪ ‬کنترل اتوکالو با تست شيميايي‪:‬‬
‫‪ ‬نوار كاغذي )‪ :)TST Tempreture ,Steam ,Time‬این‬
‫نوار در هر سری کاری سه عامل زمان‪ ،‬بخار و دما‬
‫را كنترل ميكند و از زرد به بنفش تغییر رنگ‬
‫ميدهد‪.‬‬
‫کنترل اتوکالو با تست بيولوژيك‪:‬‬
‫‪‬‬
‫استفاده از ويال حاوي اسپور باسیلوس استئاروترموفیلوس ‪ATCC 79 53‬‬
‫بطور هفتگي سفارش ميشود‪ ،‬زیرا اسپورهای این باکتری به عنوان‬
‫مقاومترین اسپورها به حرارت در اتوکالو با درجه حرارت ‪ 121‬درجه‬
‫سانتیگراد به مدت ‪ 5‬دقیقه از بین میروند‪ .‬پس از پایان استریلیزاسیون‪،‬‬
‫ویال را خارج کرده و با فشار به جداره آن محوطه درونی حاوی اسپور را‬
‫میشکنند تا اسپورها در محیط کشت آزاد شوند؛ سپس این محیط را در‬
‫حرارت ‪ 55‬درجه سانتیگراد قرار داده و در مدت یک هفته از نظر تغییر رنگ‬
‫اندیکاتور موجود محیط کشت را کنترل میکنند‪ .‬در صورتی که تغییر رنگ‬
‫مشاهده نشد یعنی اسپورها در اثر استریلیزاسیون مردهاند و‬
‫استریلیزاسیون کامل صورت گرفته است در صورت تغییر رنگ اندیکاتور‬
‫محیط کشت یعنی اسپورها زنده ماندهاند‪.‬‬
‫راهبردهای ايمني هنگام کار با اتوکالو‪:‬‬
‫‪ ‬از دستكش مقاوم به حرارت و محافظ چشم استفاده‬
‫كنید‪.‬‬
‫‪ ‬بعد از اتمام کار وقتي فشار اتاقك اتوكالو به صفر‬
‫رسید درب آنرا باز كنید‪ .‬منتظر بمانید تا ظروف كمي‬
‫خنك شوند‪ ،‬سپس آنها را حمل كنید‪.‬‬
‫‪ ‬هرگز در هنگام روشن بودن دستگاه اقدام به‬
‫بارگذاري يا خارج نمودن وسايل و مواد ننمايید‪.‬‬
‫‪ ‬هرگز در هنگام روشن بودن دستگاه و اتصال‬
‫الکتریکی آن به پريز‪ ،‬اقدام به تمیز نمودن آن نكنید‪.‬‬
‫‪ ‬هرگز پیچهاي محكم كنندهي درب را در هنگام كار‬
‫دستگاه شل و سفت نكنید‪.‬‬
: ‫منابع‬








- Quality Assurance for commercially prepared Microbiological Culture
Media-Second Edition ; Approved standard. -Third edition document M22A3. Vol. 24 No.19; 2006.
Oxoid company- General Guide to the use of Oxoid culture Media.
Diagnostic microbiology, Elmer W.Koneman,5th edition, 2006: page 96
-Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests;
Approved Standard—Ninth Edition (2006).M2- A9.
-Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That
Grow Aerobically; Approved Standard—Seventh Edition (2006).M7-A7
-Quality Control for Commercially Prepared Microbiological Culture Media;
Approved Standard— Third Edition (2004).M22-A3
-Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Sixteenth
Informational Supplement (2006).M100-S16
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪‬‬
‫‪ -9‬محیط هاي كشت آزمايشگاهي (موارد مصرف وكنترل‬
‫كیفي) به انضمام اطلس رنگي محیط هاي كشت؛ گرد‬
‫آوري و ترجمه مهناز صارمي – محمد علي صارمي؛‬
‫آزمايشگاه مرجع سالمت‪ ،‬وزارت بهداشت‪ ،‬درمان وآموزش‬
‫پزشكي؛ ‪1387‬‬
‫‪-10‬مباحث عملی میکروبیولوژی عمومی‪ ،‬مجتبی محمدی‪،‬‬
‫انتشارات مهدیس‪1381 ،‬‬
‫‪-11‬باکتری شناسی عملی‪ ،‬هادی صفدری‪ ،‬جهاد‬
‫دانشگاهی مشهد‪1382 ،‬‬
‫‪-12‬تکنیکهای عملی در آزمایشگاه میکروب شناسی‪ ،‬دکتر‬
‫سیدعلی مهبد‪ ،‬انتشارات کتاب امیر‪1386 ،‬‬
‫‪-13‬نکاتی پیرامون آزمایشگاه میکروبیولوژی‪ ،‬مؤلف‬
‫‪ ،cappoccino& Sherman‬مترجم مریم محمدی‪ ،‬انتشارات‬
‫جنگل‪1380 ،‬‬
‫‪‬ت ي و تنظيم ‪:‬‬
‫‪ ‬هرز رهيع‬
‫‪‬سمي میرز يي دور‬
‫‪‬تابسباا ‪1393‬‬