Transcript 6 gene technoloty

บทที่ 18 พันธุศาสตร์และเทคโนโลยีทาง DNA
(Genetics and DNA technology)
ครูเอื้อมพร เอี่ยมแพร
เทคโนโลยีชีวภาพ (Biotechnology)
• การใช้เทคโนโลยีเพื่อทาให้สิ่งมีชีวิต หรือองค์ประกอบของ
สิ่งมีชีวิตมีสมบัติตามต้องการ ยกตัวอย่างเช่น
– การใช้จลุ ิ นทรียใ์ นการหมัก
– การพัฒนาปรับปรุงพันธุพ์ ืชและสัตว์
– เทคโนโลยีชีวภาพที่เกี่ยวกับ DNA (DNA Technology)
พันธุวิศวกรรม (Genetic Engineering)
• พันธุวิศวกรรม (genetic engineering) หมายถึง เทคโนโลยีที่ทา
การเคลื่อนย้ายยีน (gene) จากสิ่งมีชีวิตสปี ชีสห์ นึ่ งไปสู่สิ่งมีชีวิต
อีกสปี ชีสห์ นึ่ ง เป็ นการสร้าง DNA สายผสม (recombinant DNA)
• สร้างสิ่งมีชีวิตรูปแบบใหม่ (novel) ที่มีคณ
ุ ลักษณะแบบใหม่ ซึ่ง
ไม่เคยปรากฏในธรรมชาติมาก่อน
• เปลี่ยนแปลงหน่ วยพันธุกรรม
หรือ DNA ของสิ่งมีชีวิต
• เคลื่อนย้ายยีนที่อยู่เหนื อกฎเกณฑ์
ธรรมชาติ สิ่งมีชีวิตที่เกิดขึน้ อาจมียีน
ลูกผสมแบบใหม่
การโคลนยีน
Cloning : หมายถึง กระบวนการสร้างสิ่งที่มีลกั ษณะทางพันธุกรรม
เหมือนกันกับสิ่งที่มีอยู่ก่อน
มนุษย์ร้จู กั โคลนนิ่งมาแต่สมัยโบราณแล้ว แต่เป็ นการรู้จกั โคลนนิ่ง
ที่เกิดกับพืช นัน่ คือ การขยายพันธุพ์ ืชโดย ไม่อาศัยเพศ เช่น การ
แตกหน่ อ
http://www.youtube.com/watch?v=OCro5zfc3uc&feature=player
_embedded#at=42
กระบวนการในพันธุวิศวกรรม
ประกอบด้วยกระบวนการโดยรวมคือ
1. การเตรียมยีน (gene)หรือ DNA ที่สนใจ
2. การตัด DNA อย่างจาเพาะด้วยเอนไซม์ตดั จาเพาะ
3. การเชื่อมต่อชิ้นส่วนของ DNA ที่แยกได้กบั DNA พาหะ (vector) เช่น
พลาสมิด (plasmid), phage, cosmid
4. การนาพาหะ (vector) ที่มียีนที่สนใจแทรกอยู่ หรือ DNA สายผสม ใส่
เข้าไปในเซลล์ผรู้ บั (host)
–
หลังจากนัน้ เลี้ยงเซลล์ผร้ ู บั ให้แบ่งเซลล์หลายๆครัง้ ทาให้เพิ่มจานวนเซลล์
หรือเพิ่มปริมาณยีนที่น่าสนใจ กระบวนการนี้ เรียกว่าการโคลนยีน (gene
cloning)
5. การคัดเลือกเซลล์ที่มี DNA สายผสมตามที่ต้องการ
การโคลนยีน
1.การเตรียมยีน (gene)หรือ DNA ที่น่าสนใจ
การเตรียมชิ้นส่วนยีนหรือ DNA ที่น่าสนใจมีหลายวิธีดงั นี้
1.
การสกัดจากเซลล์หรือเนื้ อเยื่อของสิ่งมีชีวิตที่ต้องการศึกษา ซึ่งเป็ น DNA ทัง้ หมด
ในจีโนมของสิ่งมีชีวิตชนิดนัน้ เรียกว่า genomic DNA
2.
การเตรียม DNA จาก mRNA
–
โดยใช้เอนไซม์ reverse transcriptase
–
จะได้ DNA ที่สงั เคราะห์ขึน้ หรือถอดรหัสจาก mRNA เรียกว่า complementary
DNA (cDNA)
การสังเคราะห์ DNA โดยวิธีทางเคมี
3.
–
สามารถสังเคราะห์ oligonucleotide ให้มีลาดับเบสที่ต้องการโดยเครื่อง
สังเคราะห์อตั โนมัติ
–
มี 2 วิธีที่ใช้กนั อย่างกว้างขวางคือ วิธี phosphate triester และวิธี phosphite
triester
2. การตัด DNA อย่างจาเพาะด้วยเอนไซม์ตดั จาเพาะ
• เอนไซม์ตดั จาเพาะ (Restriction enzyme or
restriction endonuclease)
• แบบที่ 2 (type II) เป็ นเอนไซม์ที่ใช้กนั มากในการ
ตัดต่อยีน
• ประกอบด้วยโพลีเพพไทด์เพียงชนิดเดียว
• การตัด DNA จะเกิดที่ตาแหน่ งจาเพาะในบริเวณจดจา
(recognition site) หรือจุดใกล้กบั บริเวณจดจา ทาให้
ได้ชิ้นขนาด DNA ที่มีขนาดแน่ นอน
ตัวอย่างเอนไซม์ตดั จาเพาะ
(restriction enzyme)
Blunt end vs. sticky end
3. การเชื่อมต่อชิ้นส่วนของ DNA ที่แยกได้กบั
DNA พาหะ (vector)
• การเชื่อมต่ออาศัยเอนไซม์ ligase
• การทาพันธุวิศวกรรมต้องนา DNA ที่สนใจเข้าสู่ภายในเซลล์ผรู้ บั โดยอาศัย DNA พาหะ
(vector)
• คุณสมบัติของ DNA พาหะ (vector)มีดงั นี้
– มีส่วนของ DNA ที่เป็ นจุดเริ่มในการจาลองตัว (origin of replication,ORI) ทาให้
สามารถเพิ่มจานวนตัวเองได้พร้อมๆ กับ DNA ที่ใส่เข้าไป
– มียีนเครื่องหมาย (marker gene) สาหรับใช้ในการคัดเลือก เช่น ยีนที่ดือ้ ยา
ปฏิชีวนะ ยีนที่เกี่ยวกับการสร้างหรือสลายกรดอะมิโนและน้าตาลบางชนิด
– มีบริเวณจดจาของเอนไซม์ชนิดใดชนิดหนึ่ งหรือหลายชนิดเพียง ตาแหน่ งเดียวใน
โมเลกุลของ DNA พาหะ (unique or polylinker site)
ชนิดของ DNA พาหะ(vector)
ขึน้ อยู่กบั ขนาดของ DNA ที่นามาเชื่อมและเซลล์ผรู้ บั
ตารางแสดง DNA พาหะ(vector)ชนิดต่างๆและขนาดของชิ้น DNA ที่แทรกในพาหะได้
DNA พาหะ (vector)
รูปร่าง
เซลล์ผร้ ู บั
(host)
ขนาดของชิ้น DNA ที่แทรกได้
Plasmid
DNA สายคู่, วงกลม
E. coli
ยาวได้ถึง 10 กิโลเบส
Bacteriophage
DNA สายตรง, ไวรัส
Cosmid
DNA สายคู่, วงกลม
Yeast Artificial
Chromosome-YACs
โครโมโซมเทียม
,ยีสต์
E. coli
E. coli
yeast
ยาวได้ถึง 20 กิโลเบส
30-50 กิโลเบส
250-1000 กิโลเบส (1 เมกะ
เบส)
pBR322, 4.36kb
Plasmid
Fig. 14-9: Cloning by cosmids. The cosmid is cut at a BglII site next to the cos site. Donor genomic DNA is cut
using Sau3A, which gives sticky ends compatible with BglII. A tandem array of donor and vector DNA results from
mixing. Phage is packaged in vitro by cutting at the cos site. The cosmid with inserts recircularizes once in the
bacterial cell.
4. การนาพาหะ (vector) ที่มียีนที่สนใจแทรกอยู่ หรือ DNA สายผสม ใส่เข้าไป
ในเซลล์ผรู้ บั
• ขัน้ ตอนการนา DNA สายผสม ใส่เข้าไปในเซลล์ผร้ ู บั มีหลายวิธี คือ
4.1 Transformation
• เป็ นการนา DNA ในรูปplasmidเข้าสู่เซลล์ผร้ ู บั
• เซลล์ผร้ ู บั ที่นิยมใช้กนั มากคือ E. Coli
• โดยทาให้เซลล์ผรู้ บั เป็ น competent cell ก่อน มีสองวิธีคือ
– การใช้สารเคมี เช่น dimethyl sulfoxide-DMSO, CaCl2,
MgCl2
– Electroporation- ใช้กระแสไฟฟ้ าทาให้เกิดรูที่เยื่อหุ้มเซลล์
ทาให้ DNA หรือพลาสมิดเข้าสู่เซลล์ได้
– การใช้แสงlaser ทาให้เกิดรูที่เยื่อหุ้มเซลล์
4.2 Transfection
– เป็ นการนา DNA ของphageที่มีขนาดเล็ก เช่น M13 เข้าสู่เซลล์ผรู้ บั
– เมื่อแบคทีเรียได้รบั DNA ของphageจานวนมาก เซลล์จะแตกและ
phage จะบุกรุกเซลล์อื่นต่อไปทาให้เกิดจุดใส (clear plaque)
– จุดใส (clear plaque)คือจานวน DNA ของphageที่เข้าสู่เซลล์
แบคทีเรีย
4.3 Transduction
– เป็ นการนา DNA ของcosmid,lamda phage ที่มีขนาดใหญ่เข้าสู่
เซลล์ผรู้ บั
– โดยบรรจุลงในอนุภาคของ phage ก่อนแล้วจึงนาเข้าเซลล์
– วิธีนี้มีประสิทธิภาพสูงกว่า Transformation
จุดใส (clear plaque)
คือจานวน DNA ของphageที่เข้าสู่เซลล์แบคทีเรีย
5.การคัดเลือกเซลล์ที่มี DNA สายผสมตามที่ต้องการ
5.1 การคัดเลือกโดยอาศัยลักษณะ (phenotype)
– เป็ นการอาศัยการแสดงออกของยีนเครือ่ งหมาย
(marker gene) และมีการสร้างโปรตีนออกมา
– เช่น การสร้างเอนไซม์บางชนิดที่ทาให้เกิด clear
zone ในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มี substrate (IPTG) อยู่
– หรือพบลักษณะการดือ้ ยาในเซลล์ผรู้ บั ที่ได้รบั มา
จากพลาสมิด
5.2 การคัดเลือกโดย DNA hybridization
– อาศัยการจับคู่กนั ของสาย DNA ที่เป็ นตัวติดตาม
(probe) กับ DNA เป้ าหมายที่ต้องการตรวจหาที่มี
ลาดับเบสคู่สมกัน บน membrane
– โดย probe จะติดฉลากด้วยสารไอโซโทปหรือเอนไซม์
5.3 การคัดเลือกโดยวิธีทางอิมมิวโนวิทยา
– ทาได้เมื่อโคลนที่ต้องการแสดงออกได้ โดยผลิต
โปรตีน แต่โปรตีนไม่แสดงลักษณะหรือ phenotype
ที่ชดั เจน
– เป็ นการตรวจสอบโปรตีนที่เซลล์ผลิตขึน้ โดยใช้
แอนติบอดีที่จาเพาะกับโปรตีนที่ต้องการนัน้
การคัดเลือกโดยอาศัยลักษณะ (phenotype)
• Plasmid/phageที่มีส่วนของยีนที่สร้าง b-galactosidase จะสร้างเฉพาะ afragment
• เมื่อ Plasmid/phage ถูกนาเข้าสู่แบคทีเรีย ภายใต้ภาวะที่ถกู กระตุ้นด้วย IPTG
จะทาให้มีการสร้าง b-galactosidaseในแต่ละ fragment ซึ่งสามารถเปลี่ยน Xgal ให้เป็ นสีน้าเงินได้
• แต่ถ้ามี foreign DNA มาเชื่อมจะทาให้เกิดการทางานของยีนดังกล่าวบกพร่อง
• ไม่มีการสร้าง b-galactosidase ไม่สามารถเปลี่ยน X-gal ได้จึงให้โคโลนี สีขาว
Polymerase Chain Reaction (PCR)
• เพิ่มจานวน DNA ในหลอดทดลอง
• เครื่องมือ thermocycler
ขัน้ ตอนของกระบวนการ PCR
1. การแยกสายดีเอ็นเอเกลียวคู่ออกจากกัน (Denaturation) ใช้
อุณหภูมิ ประมาณ 94 องศาเซลเซียส เมื่อเริ่มต้นดีเอ็นเอ
แม่แบบ จะอยู่ในลักษณะที่เป็ นเกลียวคู่ เมื่อเพิ่มอุณหภูมิถึง
ประมาณ 94 องศาเซลเซียส จะทาให้พนั ธะไฮโดรเจนระหว่างคู่
เบสของดีเอ็นเอถูกทาลาย ทาให้เส้นดีเอ็นเอแยกออกจากกัน
2. การจับของไพรเมอร์กบั DNA แม่แบบ (Annealing) เมื่อแยกสาย
ดีเอ็นเอออกจากกันแล้ว จะลดอุณหภูมิลงเหลือ 40 - 62 องศา
เซลเซียส เพื่อให้ดีเอ็นเอสังเคราะห์ขนาดสัน้ ประมาณ 15 - 25
คู่เบส ที่เรียกว่า ไพร์เมอร์ (Primer) เข้ามาจับบริเวณที่มีลาดับ
เบสคู่สมกัน ในการสังเคราะห์ดีเอ็นเอ
3. การสังเคราะห์ DNA สายใหม่ต่อจากไพรเมอร์
(Extension) ใช้อณ
ุ หภูมิ ประมาณ 68-72 องศาเซลเซียส
ในขัน้ ตอนนี้ จะเป็ นการสร้างสายดีเอ็นเอต่อจาก
ไพร์เมอร์ โดยอุณหภูมิที่ใช้จะพอเหมาะกับ การทางาน
ของ Taq DNA polymerase
• http://www.maxanim.com/genetics/PCR/pcr.swf
• http://www.sciencemedia.com/website/demos/biochem/PCRMuta
genesis.swf
ลายพิมพ์ DNA (DNA Fingerprint)
ลายพิมพ์ DNA (DNA Fingerprint)
DNA ทัง้ หมดของสิ่งมีชีวิตนัน้ ประกอบด้วย 2 ส่วน
• coding DNA ทาหน้ าที่ควบคุมการสร้างโปรตี นที่
มีความสาคัญต่อกลไกต่างๆ ภายในร่างกาย ซึ่งจะ
มีอยู่เพียงร้อยละ 5 ของชุด DNAทัง้ หมด
• noncoding DNA ร้อยละ 95 มีส่วนหนึ่ งที่เป็ นเบส
ซา้ ต่อเนื่ อง (tandem repeat) อยู่หลายตาแหน่ ง
Tandem Repeat
เบสซา้ ต่อเนื่ องนี้ เองที่นามาทาเป็ นลายพิมพ์ดีเอ็นซึ่งเป็ น
เครื่องหมายพันธุกรรม ทาให้สามารถรู้ลกั ษณะของจานวนการ
ซา้ ของท่อน DNA แต่ละชุดในแต่ละตาแหน่ งบนสาย DNA ของ
สิ่งมีชีวิตและบุคคลได้
สามารถใช้ความแตกต่างกันของขนาดและจานวนการซา้
ของท่อน DNA แต่ละชุดนี้ บ่งบอกถึงข้อมูลพันธุกรรม
เฉพาะของแต่ละบุคคลได้
หลักการทางานของเทคโนโลยีลายพิมพ์ DNA
1. เก็บตัวอย่างเซลล์ ตัวอย่างต้องมี DNA ที่มีคณ
ุ ภาพ ไม่เสื่อม
สลาย (ปัจจัยที่ทาให้ DNA เสื่อมสลายคือ ระยะเวลา อุณหภูมิ
ความชื้น แสงแดด สารเคมี จุลินทรีย์ ฯลฯ)
2. สกัด DNA จากเซลล์ของตัวอย่าง
3. ตรวจลายพิมพ์ดีเอ็นเอ หลักการคือ เลือกตัด DNA ในส่วนที่
แสดงเอกลักษณ์เฉพาะบุคคล โดยใช้ restriction enzyme
จากนัน้ นาชิ้นส่วน DNA ที่ถกู ตัดมาวิเคราะห์ตามขนาดด้วยวิธี
Gel Electrophoresi
4. แปลผลลายพิมพ์ DNA โดยการอ่านผลจากลักษณะตาแหน่ ง
ของแถบดีเอ็น หรือกราฟที่ได้
ประโยชน์ ของลายพิมพ์ DNA
• ใช้พิสจู น์ ความสัมพันธ์ทางสายเลือด
• ใช้ในการติดตามการรักษาผูป้ ่ วยที่ได้รบั การปลูก
ถ่ายไขกระดูก ในการรักษาลูคีเมีย ผูป้ ่ วยต้องรับ
การปลูกถ่ายไขกระดูกจากผูใ้ ห้ หากลายพิมพ์ดี
เอ็นเอเลือดผูป้ ่ วยเปลี่ยนไป แต่ลายพิมพ์เซลล์อื่น
ๆ เหมือนเดิม แสดงว่าร่างกายไม่ปฏิริริยาต่อต้าน
ไขกระดูกจากผูใ้ ห้
• ใช้พิสจู น์ หลักฐานทางนิติเวชศาสตร์
Gel Electrophoresis
Electrophoresis เป็ นเทคนิคที่ใช้แยกโมเลกุลของ
สารที่มีประจุออกจากกันโดยใช้กระแสไฟฟ้ า
สารที่มีประจุนัน้ เคลื่อนที่ผา่ นตัวกลางชนิดหนึ่ งใน
สารละลาย สารที่ประจุต่างกันจะเคลื่อนที่ไปใน
ทิศทางตรงกันข้าม
อัตราการเคลื่อนที่ยงั ขึน้ อยู่กบั ขนาด รูปร่างโมเลกุล
แรงเคลื่อนไฟฟ้ าและตัวกลางที่ใช้ด้วย
โมเลกุลของ DNA ประกอบด้วยหมู่ฟอสเฟตจานวน
มาก สารละลายของ DNA จึงมีประจุเป็ นลบที่ pH
เป็ นกลาง
เมื่ออยู่ในสนามไฟฟ้ าโมเลกุลของ DNA จะเคลื่อนที่
จากขัว้ ลบไปยังขัว้ บวก
ความเร็วในการเคลื่อนที่ของโมเลกุล DNA จึงขึน้ อยู่
กับขนาดเป็ นส่วนใหญ่ อย่างไรก็ตามมีปัจจัยอื่นที่มี
ผลต่อการเคลื่อนที่ของโมเลกุล DNA ด้วยดังนี้
การประยุกต์ใช้เทคโนโลยีของ DNA
1. เชิงการแพทย์และเภสัชกรรม
• การวินิจฉัยโรค
• การบาบัดด้วยยีน
• การสร้างผลิตภัณฑ์ทางเภสัชกรรม
2. เชิงนิติวิทยาศาสตร์
3. เชิงการเกษตร
• การทาฟาร์มสัตว์เพื่อสุขภาพมนุษย์
• การสร้างสิ่งมีชีวิตดัดแปลงพันธุกรรม
(transgenic organisms)
4. การใช้พนั ธุศาสตร์เพื่อศึกษาค้นคว้าหายีน
และหน้ าที่ของยีน
5. การประยุกต์ใช้เพื่อสิ่งแวดล้อม