Transcript การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช

การเพาะเลีย้ งเนือ้ เยือ่ พืช
(Plant Tissue Culture)
การนาเอาชิ้นส่ วนใดๆของพืช เช่ น
เมล็ด ราก ลาต้ น ตา แผ่ นใบ ดอก และ
ส่ วนอืน่ ๆ รวมถึงเซลล์เดี่ยว มาเลีย้ งใน
อาหารสั งเคราะห์ ซึ่งประกอบด้ วย แร่ ธาตุ
ไวตามิน นา้ -ตาล สารเร่ งการเจริญเติบโต
ในสภาพปลอดเชื้อ ภายใต้ สภาวะที่
เหมาะสมกับการเจริญเติบโตและพัฒนา
ของพืช (จนได้ ต้นพืชกลับคืนมา)
ประโยชน์ ของการเพาะเลีย้ งเนือ้ เยือ่
1. การขยายพันธุ์ (Propagation) การนาชิ้นส่ วนของพืช
มาเลีย้ งในสภาพปลอดเชื้อเพือ่ เพิม่ ปริมาณ เช่ น การขยายพันธุ์
กล้วยไม้ การผลิตเมล็ดเทียม ฯลฯ
จาก 1
10 /เดือน
6 เดือน = 106 ต้ น
2. การผลิตสารทุติยภูมิ (Secondary metabolite) เช่ น
สารให้ สีแดง shikonin ทีส่ กัดได้ จากการเลีย้ งเซลล์รากพืช
Lithospermum erythrorhizon สารเคมีชื่อ taxol ซึ่งมีฤทธิ์ในการฆ่ า
เซลล์มะเร็งได้ จาก Pacific yew สามารถผลิตได้ โดยการเพาะเลีย้ ง
เนือ้ เยือ่
ไม้ ดอกไม้ ประดับ
กล้วยไม้ สกุลต่ าง ๆ
หน้ าวัว
3. การคัดเลือกสายพันธุ์กลาย (Mutant selection) การใส่
สภาวะต่ างๆ ลงในอาหารเพือ่ คัดเลือกเฉพาะเซลล์เนือ้ เยือ่ ของพืช ที่
สามารถทนสภาวะนั้นและเติบโตได้ เช่ น การใส่ toxin ทีเ่ ชื้อโรคผลิตลง
ในอาหาร เพือ่ คัดเลือกสายพันธุ์ต้านทานโรค การใส่ สารเคมีปราบวัชพืช
เพือ่ คัดเลือกสายพันธุ์กลายที่ต้านทานสารปราบวัชพืช เช่ น ข้ าวโพด
ต้ านทาน imidazilinone herbicides
4. การผลิตสายพันธุ์แท้ (Inbred production) การนาเอาละอองเกสร
(pollen) หรืออับละอองเกสร (anther) มาเลีย้ งในอาหารจนเกิดเป็ นเนือ้ เยื่อที่มี
โครโมโซมเป็ นครึ่งหนึ่งของโครโมโซมปกติในเซลล์ร่างกาย ( haploid; n )
แล้ วทาการเพิม่ ชุ ดโครโมโซมให้ เป็ น 2 เท่ า (diploid; 2n ) ก็จะได้ สายพันธุ์
แท้ ทนั ที เช่ น ข้ าว และข้ าวโพดสายพันธุ์แท้
5. การผสมโปรโตพลาสต์
(Protoplast fusion) หลังจากทาการย่อยผนัง
เซลล์ออกได้ protoplasts แล้ว เราสามารถนา
protoplasts ของพืชต่ างพันธุ์ ต่ าง species
หรือต่ าง genus กัน มาผสมกันได้ เช่ น การผสม
ระหว่ าง Nicotiana tabacum และ N. rustica ได้
ลูกผสมทีม่ ลี กั ษณะพิเศษทีป่ ริมาณนิโคติน และ
การต้ านทานต่ อโรค blue mold และ black root
rot
6. การเก็บรักษาด้ วยการแช่ แข็ง (Cryopreservation) การเก็บเนือ้ เยือ่ แช่ เย็น
จัด เพือ่ หยุดยั้งกระบวนการทางชีวเคมีของเซลล์ ใช้ สาหรับเก็บรักษาเชื้อพันธุกรรมไว้
ในระยะยาว เมือ่ นามาชักนาให้ เกิดเป็ นต้ น ก็จะได้ พชื พันธุ์น้ันกลับคืนมา
7. การผลิตพืชให้ ปลอดเชื้อไวรัส (Virus - free plant propagation) การใช้
ส่ วนเนือ้ เยือ่ เจริญ (meristem) ซึ่งยังไม่ มีท่อนา้ ท่ ออาหาร มาเพาะเลีย้ งในอาหารเพือ่
ผลิตท่ อนพันธุ์พชื ปราศจากการปนเปื้ อนของเชื้อโรค โดยเฉพาะไวรัส เช่ น มันฝรั่ง
กล้วยไม้
8. การเปลีย่ นแปลงพันธุกรรม (Genetic transformation) การ
ถ่ ายทอดยีนทีต่ ้ องการโดยวิธีทางพันธุวศิ วกรรม (genetic engineering)
การเพาะเลีย้ งเนือ้ เยือ่ เกีย่ วข้ องกับการเตรียมเซลล์ เนือ้ เยื่อพืชฯลฯ เพือ่
ถ่ ายทอดยีน และการชักนาให้ เกิดต้ นฯลฯ
อาหารเพาะเลีย้ งเนือ้ เยื่อ
องค์ ประกอบของอาหาร
1. ธาตุอาหาร
A. ธาตุอาหารทีต่ ้ องการในปริมาณมาก (macro - elements)
* C, N, P, K, Ca, Mg, S
B. ธาตุอาหารทีต่ ้ องการในปริมาณน้ อย (micro - elements)
* Fe, Mn, Cu, Zn, B, Mo, Co, Cl, (Si, Al)
2. ไวตามิน (vitamins)
3. ฮอร์ โมน (plant hormones) [สารควบคุมการเจริญเติบโต
(growth regulator)] เช่ น ออกซิน ไซโตไคนิน
4. อืน่ ๆ เช่ น นา้ มะพร้ าว นา้ ต้ มมันฝรั่ง นา้ คั้นมะเขือเทศ
กล้วยหอมบด activated charcoal
เทคนิคปลอดเชื้อ (Aseptic Techniques)
ความปลอดเชื้อ และการรักษาความสะอาดให้ อยู่ในสภาพปลอด
จากเชื้อจุลนิ ทรีย์ เป็ นหัวใจสาคัญของการเพาะเลีย้ งเนือ้ เยือ่ พืช
วัสดุ อุปกรณ์ เครื่องมือ ฯ ทีจ่ าเป็ นต้ องอยู่ในสภาพปลอดเชื้อ
อาหารเพาะเลีย้ งเนือ้ เยือ่
ตู้ถ่ายเนือ้ เยือ่
วัสดุต่างๆ เช่ น กระดาษ
ภาชนะต่ างๆ เช่ น เครื่องแก้ว ขวด
อุปกรณ์ ต่างๆเช่ น ปากคีบ (forceps) มีด
มือของผู้ปฏิบัตกิ าร
วิธีการสาหรับกาจัดเชื้อจุลนิ ทรีย์
1. ความร้ อนเปี ยก (wet heat)
เช่ น การใช้ หม้ อนึ่งความดัน (autoclave) โดยใช้ อุณหภูมิ 121 องศา
เซลเซียส ความดัน 15 ปอนด์ ต่อตารางนิว้ นึ่งเป็ นเวลา 15-20 นาที
กระดาษต่ าง ๆ เครื่องมือ เครื่องแก้ว อาหาร สารละลาย
2. ความร้ อนแห้ ง (dry heat) เช่ น การใช้ ตู้อบ
160 องศาเซลเซียส นาน 45 นาที
170 องศาเซลเซียส นาน 18 นาที
180 องศาเซลเซียส นาน 7.5 นาที
190 องศาเซลเซียส นาน 1.5 นาที
เครื่องแก้ ว เครื่องมือโลหะทีท่ นอุณหภูมสิ ู งได้
กระดาษ ผ้าฝ้ าย พลาสติก ใบมีด(ทาให้ ทอื่ )
3. การกรอง (ultrafiltration)
เช่ น การกรองด้ วย
เยือ่ กรอง ทีม่ ขี นาดรู 0.45 หรือ 0.22 ไมครอน
อาหาร หรือสารทีเ่ สี ยหายได้ จากความร้ อน
อากาศทีเ่ ป่ าผ่ านแผ่ นกรองของตู้ถ่ายเนือ้ เยือ่
(laminar flow hood) จากด้ านหลังมา
ด้ านหน้ า หรือด้ านบนลงด้ านล่าง
4. การใช้ สารเคมี (chemical sterilization)
เอธิลแอลกอฮอล์ 70%
ทาความสะอาดตู้ถ่ายเนือ้ เยือ่ (laminar flow hood)
ผิวนอกของภาชนะฯ มือ ชิ้นส่ วนพืช
เอธิลแอลกอฮอล์ 95%
ใช้ จ่ ุมเครื่องมือโลหะแล้ วลนไฟ ด้ วย
ตะเกียงก๊าซหรือแอลกอฮอล์
ชนิด ความเข้ มข้ น และระยะเวลาที่ใช้ ฟอกฆ่ าเชื้อชิ้นส่ วนพืช
ขึน้ อยู่กบั ชนิดพืช, ชนิดและระยะการพัฒนาของเนือ้ เยือ่ พืช
โซเดียมไฮโปคลอไรท์ 0.5 - 3 %
(คลอร็อกซ์ 10-20
%) - 30 นาที
ชิ้นส่ วนพืช นาน 10
แคลเซียมไฮโปคลอไรท์ 9 - 10 %
ชิ้นส่ วนพืช นาน 10 - 30 นาที
ไฮโดรเจนเปอร์ ออกไซด์ 10-12 %
เมล็ด หรือชิ้นส่ วนพืช นาน 1 - 5 นาที
นอกจากนี้ อาจใช้ ซิลเวอร์ ไนเตรต ไอโอดีน เมอร์ ควิ ริคคลอไรด์ ฯ
5. การใช้ สารปฏิชีวนะ (antibiotic)
ไม่ นิยมใช้ เนื่องจากอาจมีผลกระทบต่ อการเจริญเติบโต
และพัฒนาการของเนือ้ เยือ่ พืช
6. รังสี UV (UV irradiation)
ตู้ถ่ายเนือ้ เยือ่ เปิ ดนานประมาณ 30 นาที
ภาชนะพลาสติกแบบใช้ แล้วทิง้
อย่าเปิ ดรังสี UV เมือ่ มีสารละลายไฮโปคลอไรท์ เพราะ
จะปลดปล่อย ก๊าซคลอรีน
ห้ องปฏิบัติการเตรียมอาหาร และเครื่องมือ
หม้ อนึ่งฆ่ าเชื้อ
เครื่องเตรียมอาหารอัตโนมัติ
ห้ องปฏิบัติการปลอดเชื้อ และเครื่องมือ
ตู้ปลอดเชื้อ
ห้ องปฏิบัติการปลอดเชื้อ และเครื่องมือ (ต่ อ)
เครื่องตัดเนือ้ เยือ่
อัตโนมัติ
Bioreactor
ห้ องเพาะเลีย้ งเนือ้ เยือ่ พืช และโรงเรือนปลูกพืช
ชั้นสาหรับเพาะเลีย้ งเนือ้ เยือ่
คอมพิวเตอร์ ควบคุม
ระบบให้ นา้
ระบบควบคุมคุณภาพและการบรรจุหีบห่ อ
ควบคุมการผลิตด้ วยระบบคอมพิวเตอร์
การบรรจุหีบห่ อเพือ่ จัดจาหน่ าย
ตัวอย่ างการเพาะเลีย้ งเนือ้ เยือ่ พืช
การเพาะเลีย้ งเนือ้ เยือ่ กล้วยไม้ สกุลหวายจากตา
กล้ วยไม้ สกุลหวายเป็ นไม้ ตดั ดอกทีไ่ ด้ รับความสนใจจากทัว่ โลก
ประเทศไทยเป็ นแหล่ งปลูกกล้ วยไม้ ตดั ดอกทีส่ าคัญแห่ งหนึ่ง พันธุ์ทไี่ ด้ รับ
ความนิยมปลูกมากทีส่ ุ ด คือ กล้ วยไม้ สกุลหวายลูกผสม การเพาะเลีย้ ง
เนือ้ เยือ่ กล้วยไม้ ทาได้ โดยการ “การปั่นตา” และการเพาะเมล็ด ซึ่ง
นอกจากจะทาให้ ขยายพันธุ์ได้ เป็ นปริมาณมาก ยังทาให้ ได้ ต้นปลอดโรค
ไวรัส ซึ่งเป็ นปัญหาสาคัญในการผลิต
การปั่นตาเป็ นการเพาะเลีย้ งชิ้นส่ วนของตาในอาหารเหลวที่วางอยู่
บนเครื่องเขย่ าแบบหมุนหรือปั่นในสภาพปลอดเชื้อ และมีการควบคุม
สภาพแวดล้ อม เช่ น อุณหภูมิ และช่ วงแสงให้ เหมาะสมกับการ
เจริญเติบโต
ขั้นตอนการเพาะเลีย้ งเนือ้ เยื่อกล้วยไม้ จากตา
1. หน่ ออ่ อนกล้ วยไม้
2. เตรียมสารฟอกฆ่ าเชื้อ
4. ล้ างด้ วยนา้ กลัน่ นึ่งฆ่ าเชื้อ
แล้ ว 3 ครั้ง
3. ตัดแต่ งหน่ ออ่ อนและ
ฟอกฆ่ าเชื้อ
5. ตัดแยกตาอ่ อนออกจาก
หน่ อ
6. ย้ ายลงเลีย้ งในอาหารเหลว
สั งเคราะห์
7. วางเลีย้ งบนเครื่องเขย่ า
9. ต้ นทีพ่ ร้ อมนาออกปลูก
8. โปรโตคอร์ มทีพ่ ร้ อมนาไปเลีย้ ง
บนอาหารแข็ง
10. ปลูกเพือ่ ให้ ปรับตัวใน
โรงเรือน
การเพาะเลีย้ งเนือ้ เยื่อกล้วยไม้ จากเมล็ด
ขั้นตอนการเพาะเลีย้ งเนือ้ เยื่อกล้วยไม้ จากเมล็ด
1. ล้ างฝักกล้ วยไม้ ให้ สะอาด
2. ชุ บฝักด้ วยเอทิลแอลกอฮอล์ 95 %
3. ลนไฟให้ ลุกนอกเปลว ตะเกียง
ฝักกล้ วยไม้
4. วางบนจานแก้ ว ตัดหัวตัดท้ ายของฝี ก
และผ่ ากลางด้ วยมีด
5. คีบเอาเมล็ดมาเพาะในอาหารสั งเคราะห์
เมล็ดกล้ วยไม้
6. เก็บไว้ ในทีม่ ดื หรือสว่ างก็ได้ จนกระทั่งเมล็ดงอก
ได้ เป็ นก้ อนโปรโตคอร์ ม
7. ใช้ เทคนิคปลอดเชื้อย้ ายอาหารใหม่ ๆ ทุกเดือน
จนได้ ต้นทีม่ รี าก
โปรโตคอร์ มกล้ วยไม้
ต้ นกล้ วยไม้ ทมี่ รี าก
8. นาออกปลูกบนขุยมะพร้ าว หรือถ่ านป่ น แล้ ว
ย้ ายไปปลูกในโรงเรือน
การปลูกกล้ วยไม้ เป็ นการค้ า
กล้วยไม้ จากขวดเพาะเลีย้ ง
นาออกปลูกในกระถางขนาดเล็ก
ย้ ายลงในกระถางขนาดใหญ่ ขนึ้
ปลูกในแปลงหรือกระถางเพือ่ ตัดดอก หรือจาหน่ ายทั้งต้ น
ย้ ายลงปลูกในกระถาง
ปลูกในแปลงผลิตเพือ่ ตัดดอก
การเพาะเลีย้ งเนือ้ เยื่อหน้ าวัว
หน้ าวัวเป็ นพืชทีม่ ีลกั ษณะเด่ น คือ เป็ นไม้ ดอกที่มีจานรองดอก
เด่ น สี สวย ทาให้ ได้ รับความนิยมอย่างมากทั้งในประเทศ และ
ต่ างประเทศ ดังนั้น การขยายพันธุ์เพือ่ ให้ ได้ ปริมาณมาก ๆ ถือว่ าเป็ น
ปัจจัยสาคัญที่ส่งเสริมให้ หน้ าวัวเป็ นพืชเศรษฐกิจได้
เทคนิคการเพาะเลีย้ งเนือ้ เยือ่ ของหน้ าวัว คือ การนาส่ วนของ
เนือ้ เยือ่ เจริญบริเวณใบอ่อนมาทาการเพาะเลีย้ งในอาหาร
สั งเคราะห์ ภายใต้ สภาวะทีป่ ลอดเชื้อและมีการควบคุม
สภาพแวดล้อม
ขั้นตอนการเพาะเลีย้ งเนือ้ เยือ่ หน้ าวัว
1. ใบอ่ อนหน้ าวัว
2. เตรียมสารละลาย
สาหรับฟอกฆ่ าเชื้อ
4. ล้ างด้ วยนา้ กลัน่ นึ่งฆ่ าเชื้อ
3. แช่ ใบหน้ าวัวใน
สารละลายฟอกฆ่ าเชื่อ
5. ตัดเนือ้ เยือ่ ใบเป็ นชิ้นขนาด 1 x
1 ซม.
6. วางเลีย้ งบนอาหาร
สั งเคราะห์ ทเี่ ตรียมไว้
7. กลุ่มเซลล์ แคลลัส
9. นาต้ นทีไ่ ด้ มาชักนาให้
เกิดราก
8. เปลีย่ นลงเลีย้ งในอาหารทีช่ ั กนา
ให้ เกิดต้ นและยอด
10. นาไปปลูกเพือ่ ให้ ปรับตัวใน
โรงเรือน
การปลูกหน้ าวัวเป็ นการค้ า
ผสมพันธุ์หน้ าวัวพันธุ์ที่ต้องการจนติดเมล็ด
ย้ ายลงปลูกในกระถาง
นาไปเพาะเลีย้ งเนือ้ เยือ่
ย้ ายต้ นอ่อนออกปลูกในโรงเรือน
ปลูกในแปลงผลิตเพือ่ ตัดดอก
การปลูกหน้ าวัวเป็ นการค้ า (ต่ อ)
แปลงปลูกดอกหน้ าวัว
การคัดเลือก แยกเกรด และการบรรจุหีบห่ อ
การตัดดอก
ภายนอกโรงเรือนเพาะชา
การเพาะเลีย้ งอัฟริกนั ไวโอเล็ตจากใบ
อัฟริกนั ไวโอเล็ตเป็ นไม้ กระถางทีเ่ ป็ นทีน่ ิยมทั้งใน
ประเทศ และต่ างประเทศ ขยายพันธุ์ได้ โดยใช้ ใบ แต่ ได้ จานวนต้ นน้ อย
วิธีการ:
ตัดใบเป็ นชิ้น
ตัดยอด ชักนาให้ เกิดราก
ยอดพัฒนาบนผิว, ขอบใบ
ย้ ายต้ นที่เกิดรากลงปลูกในดิน
ยอดเจริญเติบโต
ยอดปกคลุมทั้งใบ
ปลูกในโรงเรือนเพาะชาเพือ่ จาหน่ าย