Transcript บท ปฏิบัติการ ที่ 2.7 การ ทดสอบ ยา ปฏิชีวนะ ใน น้ำนม ด้วย โย เกิ ต

บทปฏิบัตกิ ารที่ 2
การตรวจสอบจุลนิ ทรีย์ในนา้ นม
(Determination of Microorganism in Milk )
การตรวจสอบจุลนิ ทรีย์โดยอ้อม
2.1 เมทธิลีนบลูรีดกั ชัน่ เทสต์
2.2 การตรวจสอบรี ซาซูริน
การตรวจสอบจุลนิ ทรีย์โดยตรง
2.3 การนับจุลินทรี ยโ์ ดยกล้องจุลทรรศน์
2.4 การนับจุลินทรี ยบ์ นจานเลี้ยงเชื้อ
2.5 การตรวจแบคทีเรี ยโคลิฟอร์ม
การตรวจสอบแบคทีเรียอืน่ ๆ
2.6 การตรวจหาแบคทีเรี ยโรคเต้านมอักเสบ
2.7 การทดสอบยาปฏิชีวนะในน้ านมด้วยโยเกิต
บทปฏิบัติการ 2.1
การตรวจสอบโดยการเปลีย่ นสี ของเมทธิลนี บลู
(Methylene Blue Reduction Test, MBRT)
หลักการ (Principles)
- MBRT เป็ นวิธีการทดสอบจุลินทรี ยโ์ ดยทางอ้อม
หลักการ: Methylene Blue เมื่ออยูใ่ นสภาวะที่มี O2 จะมีสีน้ าเงิน
จะเปลี่ยนเป็ นสี ขาวในสภาพที่มี CO2
-ชัว่ โมงการเปลี่ยนของ MRBT จะสัมพันธ์ตรงข้ามกับจานวนแบคทีเรี ย
ข้อจากัดอยูบ่ า้ งในการตรวจสอบดังนี้
-แบคทีเรี ยบางชนิด เช่น S. agalactiae B. Subtilis จะเปลี่ยนสี ได้ชา้
-Somatic cell และเม็ดโลหิ ตขาวจะฟอกสี Methylene Blue ได้เช่นกัน
วิธีการ (Method)
1. ไปเปทสารละลายของ MRBT 1 ml. ลงในหลอดตรวจสอบ
2. ไปเปทน้ านมตัวอย่าง 10 ml. ลงหลอดทดสอบดังกล่าวพร้อมทั้งปิ ดฝา
นาเข้าไปแช่ในอ่างน้ าอุ่น( 37+5 C) ปิ ดฝาอ่างป้ องกันแสง
3. จับเวลาสังเกตการเปลี่ยนแปลงสี ของเมธิลีน บลู ทุกๆช่วงเวลา 1/2, 1,
2, 3...7, 8 ชม.
อ่านผลโดยกลับหลอดไป-มา แล้วดูลกั ษณะสี ที่ปรากฏเห็นในแต่ละชม.
4. ทาหลอดควบคุมโดยใช้น้ านม แต่ไม่ใส่ สารละลายสี
การวิเคราะห์ ผล
อันดับ
1
2
3
เกรด
ดี
มาก
ดี
ระยะเวลาของการรี ดิวซ์
ไม่เปลี่ยนสี ในเวลา 8 ชม.
เปลี่ยนสี 8 ชม. แต่ไม่นอ้ ย
กว่า 6 ชม.
เปลี่ยนสี 6 ชม. แต่ไม่นอ้ ย
บทปฏิบัติการที่ 2.2
การตรวจสอบรีซาซูรีน (Resazurin Reduction Test, RRT)
หลักการ (Principles)
- RRT คือปฎิกริ ยา oxidation-reduction ของสารเคมีที่มีความไวเปลีย่ นสี
- ใช้หลักการคล้าย MRBT
-การเปลี่ยนสี ของตัวอย่างน้ านม จะอ่านผลภายใน 1 ชัว่ โมง
ขั้นตอนปฏิกริ ิยา
ขั้น 1
ขั้น 2
Resazurin
(สี น้ าเงิน)
Resorufin
(สี ชมพู)
---------------->
---------------->
Resorufin
( สี ชมพู )
Hydroresorufin
(ไม่มีสี, ขาว)
วิธีการ (Method)
1. ไปเปท รี ซาซูรีน 1 ml. ใช้ในหลอดตรวจสอบ
2. ไปเปทตัวอย่างนม 10 ml. ใส่ ลงไปในหลอดดังกล่าว ปิ ดฝาและกลับ
หลอดไปมา 2-3 ครั้ง
และนาไปวางในอ่างน้ าที่ อุณหภูมิ ( 37+5 C) ปิ ดฝาอ่างน้ าให้มิดชิด
3. เมื่อครบเวลา 1 ชัว่ โมง นาหลอดทดสอบมาเทียบสี กบั จานสี lovibond
comparation
การวิเคราะห์ ผล
สี ของตัวอย่ างนา้ นม
คุณภาพของนา้ นม
การตัดสิ น
สี นา้ เงิน (ไม่ เปลีย่ นสี ), Blue
ดีมาก
ดีมาก
สี ม่วงปนชมพู, Lavender
ดี
ดี
สี ชมพู, Pink
เสี ย
สี ขาว, Colourless
พอใช้
นา้ นมกาลัง
ไม่ ดี
นา้ นมเสี ย
บทปฏิบัติการ 2.3
การตรวจนับจุลนิ ทรีย์โดยกล้องจุลทรรศน์ (Direct Microscopic Count, DMC)
หลักการ (Principles)
-เป็ นวิธีตรวจนับแบคทีเรี ยในน้ านมโดยตรงด้วยกล้องจุลทรรศน์
ให้ผลรวดเร็ วและสิ้ นเปลืองน้อย
- แต่ตอ้ งอาศัยความชานาญ
วิธีการ (Method)
การเตรียมแผ่ นสไลด์ ตัวอย่ างนม
โดยทาเครื่ องหมายรู ปสี่ เหลี่ยมพื้นที่ 1 ตร.ซม.
ไว้ที่ใต้แผ่นสไลด์
1 cm2
การทา smear
-อุ่นน้ านม (37 C ) และ กวนให้เป็ นเนื้อเดียวกัน
-ใช้ loop ที่ฆ่าเชื้อแล้ว แตะน้ านมตัวอย่าง 1 loop
(0.01 ml. ) เกลี่ยลงบนพื้นที่สี่เหลี่ยมให้เต็มและเรี ยบ
-ปล่อยแผ่นสไลด์ให้แห้งบนถาดอุ่นสไลด์
3 การย้ อมสี
-จุ่มแผ่นสไลด์ที่ทา smear แล้ว ลงใน Xylene นาน 1-2 นาที เพื่อขจัดไขมัน
-ล้างสไลด์ดว้ ยน้ าเปล่า โดยเปิ ดน้ าก๊อกเบาๆ ริ นผ่านสักครู่ แล้วปล่อยให้แห้ง
- นาแผ่นสไลด์ที่แห้งแล้ว มาจุ่มแอลกอฮอล์ 95% นาน 1-2 นาที เพื่อ fix smear
แล้วตากให้แห้ง
-นาสไลด์มาย้อมด้วยสี Loeffler's methylene blue โดยหยดน้ ายาสี 1-2 หยด
ให้น้ ายาท่วมแผ่นสไลด์ ทิ้งไว้ 2 นาที ล้างสี ออกด้วยน้ าเปล่าอีกครั้ง
-แล้วตากแห้ง ก่อนนาไปส่ องในกล้องจุลทรรศน์ต่อไป
การใช้ กล้องจุลทรรศน์
-ปรับกล้องจุลทรรศน์ เริ่ มจากกาลังขยายต่า 40 X
แล้วจึงปรับไปที่หวั oil
ข้อสังเกตในการตรวจ
- แบคทีเรี ย
ย้อมติดสี น้ าเงินเข้ม
- เม็ดเลือดขาว
ย้อมติดสี น้ าเงินเข้ม
- โซมาติกเซลล์
ย้อมติดสี น้ าเงินเข้ม
- โปรตีน
ย้อมติดสี ฟ้าเป็ นพื้นหลัง
- ไขมัน
ย้อมติดสี ขาวหรื อไม่ติดสี
- สิ่ งสกปรก,ฝุ่ น
ย้อมติดสี เป็ นเม็ดดาหรื อน้ าตาล
การคานวณจานวณแบคทีเรีย (Calculation)
จานวนแบคทีเรียใน 1 ml. = ค่ าเฉลีย่ จานวนแบคทีเรียใน 1 field x conversion factor
ยกตัวอย่างการคานวณหาแบคทีเรียในนา้ นม
กล้ องจุลทรรศน์ มหี ัวoil เส้ นผ่ าศูนย์ กลางเท่ ากับ 0.21 มิลลิเมตร
จานวนโคโรนีทนี่ ับได้ ใน 30 flied คือ 45
จานวนแบคทีเรียในนา้ นม ?
1. หาค่ าเฉลีย่ จานวนแบคทีเรียใน 1 field = 45 / 30 = 1.5
2. จานวนแบคทีเรียในนา้ นม =
1.5 x 300,000
=
450,000 เซลล์ / ml.
บทปฏิบัติการ 2.4
การนับจุลนิ ทรีย์บนจานเลีย้ งเชื้อ (Standard Plate Count, SPC)
หลักการ (Principles)
-วิธี Standard Plate Count นี้เป็ นการเพาะเลี้ยงเชื้อในอาหารที่จุลินทรี ยส์ ่ วนมาก
สามารถเจริ ญเติบโตได้
-หลังจากนั้นแล้วจึงนับจานวนโคโลนี (colony)
-ค่าที่ได้บ่งชี้ถึงความสะอาดของน้ านมดิบ(ความสะอาดในการรี ดนม และความ
สะอาดของอุปกรณ์ โรคเต้านมอักเสบ)
วิธีการ (Method)
1. การวางแผนการทา Dilution
ในนา้ นมดิบจะมีจานวนแบคทีเรียอยู่เป็ นจานวนมาก จึงต้ องทาเจือจางก่อนเพาะเลีย้ ง
1. ขั้นตอนการเตรียม dilution นา้ นมชนิดต่ าง ๆ
1 ml.
9 ml. H2O
1:10
A
1 ml.
9 ml. H2O
1:100
B
1 ml.
1 ml.
9 ml. H2O
1:1000
C
9 ml. H2O
1:10,000
D
Dilutionทีเ่ หมาะสมควรมีจุลนิ ทรีย์เกิดอยู่ในช่ วง 30-300 โคโลนี
1.การเลือกใช้ dilutions กับนา้ นมชนิดต่ าง ๆ
ชนิดตัวอย่างนา้ นม
นา้ นมดิบ
นา้ นมพาสเจอร์ ไรส์
นมยูเอชที
Dilutions
standard plate count (SPC)
Coliform
1: 1,000 (10 -3 )
1: 10,000 (10 -4 )
1:10 (10 -1 )
1: 100 (10 -2 )
1: 1,000 (10 -3 )
1
1 : 10 (10 -1 )
1: 100 (10 -2 )
1: 1,000 (10 -3)
1
1: 10
1: 1,00
1
1 : 10 (10 -1)
4. การเพาะเชื้อ
4.1 นาจานทีจ่ ะใช้ มาเขียนชื่อตัวอย่างนา้ นม
SPC
กลุ่ม
.............
Control
วันที่
SPC
กลุ่ม
.............
ตัวอย่ าง
น้านมดิบ
Dilution 1:
10
วัน
1.การหยด Dilution
.-ใช้ ไปเปท ลนไฟ ก่ อนดูดนา้ นมจาก dilution ต่ างๆ ทีท่ าไว้
จานวน 1 ml. ลงในจานเลีย้ งเชื้อ
2. การเท Agar ( ตรวจอุณหภูมaิ garต้ องไม่ ร้อนเกินไป
ใช้ หลังมือแตะขวดพอทนได้ )
- ใช้ ไฟตะเกียงลนปากขวดagar ก่อนเปิ ดฝา
- และเท agar ประมาณ 15 ซีซี สู่ จานเลีย้ ง
-วางจานบนโต๊ ะใช้ มือจับฝาจาน แกว่ งตัวจาน
-ในแนวราบบนโต๊ ะให้ agar เข้ ากันดี
4.4 วางรอจน agar แข็งตัว นาเข้าอบที่อุณหภูมิ 32 C นาน 48 ชัว่ โมง
การวางจานนั้นต้องกลับคว่าจานเลี้ยงเชื้อลง
4.6 เมื่อครบ 48 ชัว่ โมง แล้วนาออกมานับจานวนโคโลนีโดยใช้เครื่ อง
(colony counter) และรายงานผลในหน่วยของโคโลนีต่อml.ของน้ านม (
colony/ml )
5. การอ่านผล
5.1 เลือกนับจากจานทีม่ จี านวนโคโลนี 30-300 โคโลนี
หากทุกจานมีมากกว่ า 300 โคโลนีให้ รายงานเป็ น นับไม่ ได้
จานวนแบคทีเรียที่นับได้ ในแต่ ละจาน = จานวนแบคทีเรียที่นับได้ / ค่ า dilute
ตัวอย่างเช่ น
นับจานวนแบคทีเรียได้
250
โคโลนี ที่ dilution 1 x 10 - 3 (0.001)
จะมีจานวนแบคทีเรีย
=
250 / 0.001 = 250,000 cfu/ml
หรือ
=
250 x 1,000 = 250,000 cfu/ml
*cfu = colony forming unit
บทปฏิบัติการที่ 2.5 การตรวจสอบแบคทีเรียโคลิฟอร์ ม
-เป็ นวิธีที่ใช้ตรวจสอบน้ านมภายหลังจากที่ทาการฆ่าเชื้อแล้ว
-ลุ่มโคลิฟอร์มได้แก่ Coliform bacteria จาพวก gram-negative
เช่น Escherichia (E. Coli) กับ Enterobacter (หรื อ Acrobacter)
ความสาคัญของแบคทีเรี ยโคลิฟอร์ม
1. โคลิฟอร์มเป็ นแบคทีเรี ยที่พบได้ทวั่ ไปในนมดิบ
2. โคลิฟอร์มไม่ทนในอุณหภูมิฆ่าเชื้อนมพาสเจอร์ไรส์
ดังนั้นการพบแบคทีเรี ยในน้ านมที่พาสเจอร์ไรส์แล้ว แสดงว่ามีการปนเปื้ อน
วิธีการ (Method)
-อุ่น Agar ให้อยูใ่ นสภาพละลาย
-เติมน้ านม dilution ตัวอย่างละ 1 ml. ต่อ 1 จาน ( หากเป็ นน้ านมดิบให้ใช้
Dilution 1:10, 1:100 และน้ านมพาสเจอร์ไรส์ใช้ 1:1, 1:10)
-ให้เท วุน้ แดง( Violet red bile agar) ทับในแต่ละจาน จานละ 10 มล. หมุนจาน
ให้ส่วนผสมเข้ากันและตั้งทิ้งไว้ให้วนุ ้ แข็ง
-นาจานวุน้ ที่แข็งตัว บ่มในตูอ้ ุณหภูมิ 37 C นาน 24 ชม.
-เมื่อครบเวลาให้นาจานออกมาตรวจนับ
-ลักษณะโคโลนีจะเป็ นสี แดงเข้มขึ้นอยูใ่ นเนื้อวุน้
-รายงานผลเป็ น โคโลนีต่อมล.
= จานวนโคโลนี/จาน x อัตราเจือจาง
บทปฏิบัติการที่ 2.6
การตรวจโรคเต้ านมอักเสบโดยวิธี California Mastitis Test
-CMT เป็ นวิธีที่ใช้การประมาณค่า somatic cell โดยอาศัยปฏิกิริยาของ
Sodium hydroxide ซึ่งจะทาให้เซลล์แตกสลาย และ ทาให้โปรตีนของเม็ด
โลหิ ตขาวเกิดการตกตะกอน
-จับกันเป็ นก้อนหนืด ปรากฎให้เห็นด้วยตาเปล่า
วิธีการ ( Method )
1. ใช้ไปเปทดูดน้ านมใส่ ในจานหลุมทั้ง 4 จาน ๆ ละ 2-5 ml.
2. ไปเปท CMT ใส่ จานทั้ง 4 จาน (น้ ายา CMT : น้ านมตัวอย่าง = 1:1)
3. แกว่งถาดจานหลุมวนเป็ นวงกลมอย่างช้า ๆ ให้คะแนนและสังเกตการ
เกิดตะกอนจับเป็ นก้อนทันทีภายใน10 วินาที
ปฏิกริ ิยา
ลักษณะปฏิกริ ิยา
จานวนจุลนิ ทรีย์ (Cell/ml )
สัญลักษณ์
% การ
สู ญเสีย
-
0
negative
ส่ วนผสมเหลวปกติ ไม่ มี
ตะกอน, สีม่วง
0-200,00
T
3
trace
ส่ วนผสมข้ นเล็กน้ อย แต่ ไหล 150,000- 500,000
ได้ ปกติ, สีม่วง
1
11
Weak Positive
ส่ วนผสมเริ่มหนืด พอเห็น
ไหลเป็ นเส้ น, สีม่วง
400,000 - 1,500,000
2
28
Distinct Positive
ส่ วนผสมหนืด ตรงกลางมี
ตะกอนไม่ ค่อยไหล, สีม่วง
800,000 - 5,000,000
3
46
Strong Positive
ส่ วนผสมหนืด ตรงกลางมี
ตะกอนเหนียวติดอยู่ตรง
กลางชัด, สีม่วง
>5,000,000
+
ใส่ สัญลักษณ์
เพิม่ ในกรณี
Alkaline milk
pH 7.0 หรือ
มากกว่า
ให้ ใส่ +
ตามตัวเลขในกรณีเห็นเป็ นสี
ม่ วง
การหลัง่ นา้ นมผิดปกติ
เต้ านมอักเสบแบบไม่ ตดิ
เชื้อ ไม่ แสดงอาการ
Y
ใส่ สัญลักษณ์
เพิม่ ในกรณี
Acid milk ,
pH <5.2
ให้ ใส่ Y ตามตัวเลขในกรณี
เห็นเป็ นสีเหลือง
แสดงว่ามีจุลนิ ทรีย์ทาให้
นา้ นมเสีย
หมายเหตุ : ระวังการอ่านผลตรวจน้ านมจากโคแรกคลอดและช่วงปลายการให้นม
ซึ่งจะให
บทปฏิบัติการที่ 2.7 การทดสอบยาปฏิชีวนะในนา้ นมด้ วยโยเกิต
-ปัญหาน้ านมที่พบบ่อย คือการปลอมปนยาปฏิชีวนะ
หรื อสารป้ องกันการเสี ยของน้ านม
วิธีตรวจอย่างง่ายคือการทาโยเกิตเทส( Yogurt test )
-โดยน้ านมที่มีสารกันนมเสี ยเมื่อใส่ จุลินทรี ยจ์ ากโยเกิต เพาะเลี้ยงแล้วจะพบว่า
เชื้อตาย
-ต่างกับน้ านมที่ไม่มีสารป้ องกันเสี ย เชื้อจะเจริ ญได้ ทาให้น้ านมเกิดตะกอน
การตรวจสอบยาปฏิชีวนะเบือ้ งต้ นโดยวิธี PlainYoghurt
วิธีการ
1.ใช้โยเกิตจืด 1 ถ้วย (150 กรัม) ผสมน้ าเย็น 150 มล. คนให้เข้ากัน
2.นาน้ านมดิบ 10 มล. ต้มเดือด 10 นาที และปรับอุณหภูมิ 35-37 C
3.ใส่ โยเกิตที่เตรี ยมไว้ 1 ซีซี. ลงในหลอดน้ านม เขย่าให้เข้ากัน
4.บ่มในWater Bathอุณหภูมิ 48 C นาน 3 ชัว่ โมง
5.ทาตัวอย่าง Bank และControl เพื่อเปรี ยบกับผลจากน้ านมดิบ
การอ่านผล
-ถ้าตัวอย่างน้ านมมีการจับตัวเป็ นก้อน/หนืด อ่านผลเป็ นลบ(-) คือไม่มีสารยับยั้ง
จุลินทรี ย ์
-ถ้าตัวอย่างน้ านมยังเป็ นน้ านมปกติ ไม่หนืดให้อ่านผลเป็ นบวก(+) คือ อาจมี
สารยับยั้งการเจริ ญเติบโตจุลินทรี ย ์
การตรวจสอบยาปฏิชีวนะโดยวิธี Yoghurt with Bromocresol Purple
-ใช้ โยเกิตรสจืดไม่ตอ้ งเจือจาง
-ใช้นม 2 ซีซี. ต้มในน้ าเดือด 10 นาที และปรับอุณหภูมิ 35-37 C
-ผสมโยเกิต 0.1 ซีซี. ประมาณ 1 หยด + BCP 0.2 ซีซี.( 2 หยด) เขย่าให้เข้ากัน
-บ่มใน Water Barth อุณหภูมิ 45 C นาน 3 ชัว่ โมง
การอ่านผล
ตัวอย่างถ้ามีสีเหลือง = ผลลบ
ตัวอย่างถ้ามีสีน้ าเงิน = ผลบวก