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移植免疫 Transplantation Immunology 主讲：柳 忠 辉 教授、博士生导师 WHY TRANSPLANT TISSUES OR RGANS? Replace dysfunctional/nonfunctional tissue or organs 移植研究的内容 组织、器官移植 组织工程学 干细胞移植 第一部分 组织器官移植 概述 移植排斥反应的类型 移植排斥分子基础和损伤机制 延长移植物存活措施 一、概 述 移植排斥的研究史 1597：欧洲一外科医生Tagliacozzi用病人的 手臂皮肤成功修复了患者损伤的鼻子，但用异 体皮肤进行同样的修复，没能成功。 因此得出结论： 个体的特殊性使我们不能在异体间进行器 官移植 爱尔兰医生Bigger第一个打破了异体间不能移植 的结论，首先成功用异体角膜移植治好了一个盲 眼的狗。 1906年第一例人类角膜移植成功。此后角膜移植 一直是临床眼科的一种治疗方法。 1905年研究带血管的实体器官移植。Carrel在解 决了肾血管混合技术后进行了狗肾移植。结果发 现狗的自身肾移植总能成功，而异体移植总在大 约一周以后开始排斥。 1912年肿瘤生物学家Schone进行了系统的肿瘤 移植排斥实验得出如下结论： 异种移植肯定失败；同种异体的肿瘤通常不成 功；自体肿瘤移植总能存活；同种异体肿瘤在 第一次移植时，有一段时间可以生长，但迅速 被排斥；接种过肿瘤的个体再次接种同样的肿 瘤，肿瘤排斥加速；肿瘤与移植宿主之间血缘 关系越近，肿瘤移植存活的可能性越大。 器官移植机制的重要突破 — 移 植排斥的免疫学本质 20世纪40年代初期，英国动物学家Medawar 揭示了移植排斥的免疫学本质：受体的免疫 系统对供体组织器官的免疫应答。 移植免疫学的进步推动了器官移植的 进步。 移植排斥反应的本质是免疫应答 A B C 初次移植 加速 免疫记忆 10天 致敏期 B 再次移植 10天 皮片脱落 再次移植 皮片脱落 特异性 器官移植遗传学的重要突破 — 移 植排斥的MHC背景 最初的移植排斥试验证实，实验动物排斥移植物 的能力受遗传背景的控制。 20世纪40年代中期，生物遗传学家Snell建立了 纯系小鼠的模型。 Snell和英国生物学家 Corer 鉴定了小鼠移植排斥的基因位点，将其命 名为组织相容性-2，H-2。 20世纪50年代，法国的Dausset在输血受血者 中发现了针对白细胞的同种抗体，阐明了小鼠 H-2与人白细胞抗原（HLA）的同一性。 Benacerraf 等免疫学家认为，HLA不可能仅仅 是为病理状态而存在，发现了免疫应答基因Ir 及HLA在免疫应答中的作用。 Benacerraf，Dausset，Snell因他们对 调节免疫应答重要分子的发现而分享了 1980年诺贝尔奖 人类器官移植的成功 1954年美国外科医生Murray单卵双生的姐妹进行肾移植 成功。 1959年，在全身照射免疫抑制的情况下，异卵双生的肾 移植获得长期存活。 1962年无血缘关系的尸体肾移植，术后应用硫唑嘌呤作 免疫抑制药获得了移植肾的长期存活。 至此器官移植的梦想已经成为临床现实 1956年美国Thomas成功进行了骨髓移植治疗白血病 1990年为表彰他们在器官移植所作的开创 性贡献获诺贝尔医学奖。 WHAT ARE EXAMPLES OF COMMON TRANSPLANTS? ------------------------------------------------------------------------------ Blood transfusion Pancreas Kidney Islets Cornea Small intestine Heart Bone Lung Skin Liver , Connective tissue (tendons) ------------------------------------------------------------------------------ 移植物存活时间的延长： 20世纪90年代，随着高效强力免疫抑制药 物的出现以及不同要药物合理配伍，组织 配型技术的不断完善，器官保存技术的提 高器官移植的存活率已大大提高。 组织器官移植的分类 自身移植 (autograft) 同系移植 (isograft) 同种移植 (allograft) 异种移植 (xenograft) Transplantation（移植） 将来自一个个体的细胞、组织或器官移植于 另一个个体的过程称为组织或器官移植。 供者（donor）：提供移植物（graft， transplant）的个体 受者（recipient）：接受移植物者（host） 移植物抗原 (graft antigen) 移植排斥 (transplantation rejection) 二、移植排斥反应类型 宿主抗移植物反应(host versus graft reaction, HVGR) 宿主抗移植物病 (host versus graft disease， HVGD) 移植物抗宿主反应(graft versus host reaction, GVHR) 移植物抗宿主病(graft versus host disease GVHD) 宿主抗移植物反应，HVGR 根据移植物反应强度、时间、发生机制不同可 分以下三种类型 超急排斥反应 (hyperacute rejection) 急性排斥反应 (acute rejection) 急性体液排斥 （ acute humoral rejection 急性细胞排斥（acute cellular rejection） 慢性排斥反应 (chronic rejection) 移植排斥反应的分类及特点 型别 反应时间 超急排斥 数分钟至 几小时 急性体液排斥 数天 急性细胞排斥 数天至数 周 慢性排斥 数月之数 年 反应机制 病理改变 体液免疫 血管内凝血 体液免疫 T细胞 T细胞 急性血管炎 体液免疫 T细胞 间质纤维化， 移植血管硬 化 急性间质炎 移植物抗宿主反应(GVHR) 发生条件: 免疫抑制,免疫功能障碍. 常见于骨髓移植, 脾脏, 胸腺及小肠移植 骨髓移植(bone marrow transplantation, BMT) 目的:造血功能及免疫功能重建 适应症:造血系统肿瘤,再障,遗传性免疫缺 陷病. GVHD是BMT后主要并发症和死亡原因. GVHD的分类 急性GVHD 发生在3个月内,多见于移植后3-4周. 病理改变:皮肤、肝脏和消化道细胞 坏死 慢性GVHD 发生在3个月后,甚至6-12个月, 病理改变:全身性器官和组织纤维化. GVHD的免疫损伤机制 骨髓中成熟T细胞识别宿主同种抗原. BMT模型中,去除成熟T细胞可减少GVHD 的发生. NK是GVHD的主要效应细胞. 病理检查发现大量的NK细胞浸润 三、移植排斥的抗原分子, 细胞 学基础及损伤机制 移植排斥的抗原分子 移植排斥的细胞学基础 移植排斥的损伤机制 WHAT ARE TRANSPLANTATION ANTIGENS? Relative degree of Antigens polymorphism -----------------------------------------------------------------------------1) ABO blood group Limited 2) Major histocompatibility complex (MHC)* Very high 3) Minor histocompatibility antigens (mHC antigens) Limited 4) Xenoantigens Extremely high -----------------------------------------------------------------------------* Human MHC = HLA Complex, class I and class II MHC 人类HLA复合体 HLA 6号染色体 DP DN DO DQ DR C4,C2,HSP,TNF HLA-II HLA-III B C E A G HLA-I HLA-II类分子 HLA-III类分子 HLA-I类分子 MHC多态性的原因？ 遗传特点决定 复等位基因 共显性遗传 单元型遗传 复等位基因 A B C DP DQ DR 27 56 10 23 9 6 共显性遗传 a b 母 HLA a c a d cd 父 HLA b c bd 子代 单元型种类: 27 x 56 x 10 x 23 x 9 x 6=1.8x107 基因型种类: = 1.8x107 x 1.8x107 = 3.2 x 1014 移植排斥的细胞基础 过路细胞或过客白细胞（passenger leukocyte):供者体内的APC T淋巴细胞：受者体内的CD4+ CD8+T 1 T细胞在移植排斥中的核心作用 2 T细胞的同种识别及致敏 3 CD4+ CD8+T细胞 过路细胞,过客白细胞 (passenger leukocyte) 移植物血管和组织中的白细胞，主要是DC和 其它白细胞，是致敏受者的主要抗原提呈细 胞。 T细胞同种识别及致敏 受者T细胞对同种异体抗原的识别分为 直接识别 (direct allo-recognition) 1%-10%。 间接识别 (indirect allo-recognition) 0.01-0.1%。 T细胞在移植排斥中的中心作用 无胸腺的裸鼠, 新生儿期胸腺切除鼠 成年鼠经过X-ray照射去除成熟T细胞 在应用抗T细胞球蛋白，消除循环中的成熟T 细胞。 同种移植后可避免急性排斥反应的发生 或降低发生的几率和程度。 移植排斥的损伤机制 四、延长移植物存活措施 移植物的组织学配型 免疫抑制剂 物理方法延长移植物存活 诱导免疫耐受 基因敲除 移植物的组织学配型 血型相容试验 HLA配型 HLA分型 材料:外周血淋巴细胞 方法: 血清学 细胞学 基因水平 血清学分型: 检测HLA-A,B,C,DR,DQ 补体依赖细胞毒试验 待测淋巴细胞+已知型HLA抗血清 室温, 60min 加补体 37 60min 台芬兰染细胞 细胞学分型: 检测HLA－ＤＲ 混合淋巴细胞培养法 [mixed lymphocyte culture (reaction), MLC, (MLR)] 单向法: 供者细胞 (x射线照射, 丝裂霉素)+受者淋巴细胞 淋巴细胞转化率(%) 双向法: 供者淋巴细胞+受者淋巴细胞 淋巴细胞转化率(%) 免疫抑制剂 化学免疫制剂 硫唑嘌呤 肾上腺皮质激素 环孢菌素A(cyclosporin A , CsA): B, M, Th FK506: T细胞免疫抑制剂 中药免疫抑制剂 雷公藤 冬虫夏草 环磷酰胺 作用：干扰淋巴细胞的DNA合成及 复制，毒性强。 副作用：严重 硫唑嘌呤 作用：干扰DNA合成，抑制细胞有丝分裂。 主要用于抑制细胞免疫。 副作用：骨髓抑制、感染、肝功能损害、 恶性病变、口腔溃疡、脱发等。 氨甲喋玲 作用：有丝分裂抑制剂。 体液免疫抑制作用较强。 应用：肿瘤化疗、自身免疫病。 糖皮质激素 作用：抑制单核巨噬细胞、中性粒细胞和 T、B细胞。 常用药： 氢化可的松、强地松 、强地松龙、 地塞米松。 副作用：类肾上腺皮质综合征、诱发和加重感 染，影响伤口愈合，骨质诉讼，抑制生长激 素的分泌。 微生物制剂 真菌的代谢产物具有选择性的强免疫 抑制作用。 环孢菌素A（cyclosporin A, CsA） FK-506 环孢菌素A（CsA） 1972年瑞士一家药厂从真菌中提取的新药， 1978年首次试用于肾和骨髓移植病例，取得了满 意的效果，使器官移植进入了一个划时代的新时期。 作用：抑制Th细胞 、B细胞、巨噬细胞 FK-506 从真菌中分离出来的大环内酯类抗生素。 作用：抑制T细胞功能，比CsA用量小 应用：器官移植 生物免疫抑制剂 抗体 抗淋巴细胞血清 抗胸腺细胞球蛋白 抗 CD3 抗CD4 抗CD25 靶细胞及靶分子 所有淋巴细胞 T细胞 成熟T细胞 Th1/Th2 活化T 物理方法延长移植物存活 高氧（95%O2)低温(24度）培养 过路白细 胞MHCII阳性细胞明显减少。 紫外线照射: 抑制过路白细胞活性，并改 变某些抗原分子，淋巴细胞凋亡。 免疫隔离技术： 诱导移植物免疫耐受 可溶性抗原诱导耐受: sHLA-I 胸腺内诱导耐受 供者细胞门静脉输入诱导耐受 FasL转基因抗原提呈细胞(APC)诱导耐受 MHC等相关基因敲除 异种移植—器官移植研究的 新领域 异种移植的超急性排斥反应（HAR） HAR是异种移植的首要障碍，是人体内一些天 然抗体（natural antibody）或补体所介导的。 这些天然抗体或补体识别猪组织细胞表面的异 种抗原（xenoantigen）分子，尤其是表达于血管 内 皮 细 胞 表 面 的 半 乳 糖 成 分 a-1,3- 半 乳 糖 苷 (Gala-1,3Gal)。 天然抗体与血管内皮细胞结合后激活补体或抗 原直接激活补体替代途径，手术后几分钟至数小时 之内就可导致移植器官血管栓塞、坏死。 抑制HAR的可能途径 •用含有蔗糖转移酶的缓冲液术前对器官进行灌流， 对Gala-1,3Gal加以修饰使其在结构上与人的糖基类 似，不再被人天然抗体或补体所识别。 •在术前用带有Gala-1,3Gal糖基的微球柱吸附清除 宿主血清中的天然抗体。 •抑制补体在被移植组织细胞表面的活化。 •将猪的a-1,3半乳糖苷转移酶基因敲除。 由于补体调节机制具有同源限制性（homologous restriction），猪组织细胞表面的补体调节和补 体抑制因子难以对人体内的补体发挥作用。 表达人膜型补体抑制因子（CD46、CD55和CD59等） 的转基因猪。表达于猪组织细胞表面的人补体调节 蛋白能够有效地抑制人补体的活化，从而阻断HAR 的发生。 迟发型异种排斥反应 （Delyed xeno-transplantation rejection， DXR） 异种移植物除了诱导抗体产生，造成补体依 赖的细胞毒作用。还能致敏淋巴细胞，产生细胞 因子，局部出现单核细胞和NK细胞浸润与活化。 移植物在数天后被排斥。 慢性异种排斥反应 供者MHC及其它异种抗原被宿主T细胞间接识 别。反应强烈，不易被免疫抑制剂控制。 “基因工程猪”的制备 DNA 受精卵 表达人CD46、 CD55和CD59等 敲除a-1,3半乳 糖苷转移酶基因 *** *** 第二部分 移植科学的最新进展 ——干细胞移植 干细胞是一种未分化细胞，保持长期增殖 活力，并具有分化成多种特定细胞类型的能力， 在机体中终生存活，在维持机体特定细胞群数 量上具有重要的意义。 目前的研究表明，当组织器官受到损伤时， 干细胞被激活，对受损的组织进行自我修复重 建。也可通过人工移植干细胞达到治疗相关疾 病的目的。 干细胞的可塑性 通常情况下，干细胞在机体内分化为与其组织 来源一致的细胞。而在某些情况下干细胞的分 化并不遵循这种规律。 1999年Goodell等人分离出小鼠的肌肉干细胞， 体外培养 5天后，与少量的骨髓间质细胞一起 移植入接受致死量辐射的小鼠中，结果发现肌 肉干细胞会分化为各种血细胞系。这种现象被 称为干细胞的横向分化。 干细胞的分离与纯化 干细胞表面有许多特殊的标记，以造血系统 为例，人造血干细胞表现为CD34+而CD10， CD14，CD15，CD16，CD19，CD20皆为阴性 另外干细胞还有不同于一般分化细胞的物理 特性，比如干细胞不被染料Hoechst33324和 Rhodamine123染色。利用这些特性及表面标 志，采用荧光细胞分离器从单细胞悬液中即 可分离纯化干细胞。 骨髓干细胞移植 根据干细胞采集方法：分为自体骨髓干细胞移 植和异体干细胞移植。须在无菌条件下采集骨 髓350～500ml，分离、纯化干细胞进行移植。 干细胞注射方法有两种：将干细胞悬液下肢肌 肉局部注射和下肢动脉导管注射。 入介入室，局麻，经动脉穿刺，通过动脉导管 注入干细胞悬液。 干细胞移植的应用 骨髓干细胞移植 1.下肢缺血性疾病：糖尿病足、血栓闭塞性脉管 炎、动脉硬化闭塞症等。 2.股骨头坏死。 3.缺血性心脏病：心梗。 4.失代偿期肝硬化。 5.神经系统疾患：脑梗死、肌萎缩性侧索硬化症 （ALS）、脑脊髓损伤（因创伤、缺血、变性 疾病等造成神经元损伤）等。 并发症 移 植宿 物主 抗病 感染 并发症 肝塞 静症 脉 闭 出血性膀胱炎