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2008级五年制本科生 免疫学实验课 补体依赖细胞毒试验 实验内容 补体依赖的细胞毒试验（实验） 细胞毒实验（讲解） 实验目的 掌握补体依赖细胞毒试验的原理及操作方法 熟悉各种细胞毒实验的原理和检测方法 实 验 原 理 细胞性抗原与特异性抗体(IgG1,2,3或IgM)的结合可 激活补体活化的经典途径，引起细胞膜损伤，膜通 透性改变而吸收染料，使细胞着色，胀大而死亡， 失去正常的折光性。根据死细胞的多少判断细胞毒 性的强弱。 本次实验采用抗Thy-1血清(Thy-1是T细胞的一种表 面标志)与小鼠的胸腺和脾的T细胞相互作用，通过 激活补体对胸腺和脾的T细胞进行杀伤。 实 验 原 理 示 意 图 MAC T Cell T细胞+抗Thy-1抗体 + 补体 细胞溶解现象 实验分组 四人一组，1只小鼠/组。 两人做脾，两人做胸腺。 物品分配 器材名称 加样器 吸头 载玻片/盖玻片 量/组 2把 12个 4套 试剂名称 PBS 抗Thy-1血清 台酚兰 量/组 10ml 0.3ml 1瓶 显微镜 小试管 滴管 1台 6支 2支 补体 小鼠 0.5ml 1只 平皿 刻度吸管(5ml) 剪刀、镊子 (直,弯) 1对 1支 1套 纱布块 2块 操作步骤 1. 将3ml PBS先放到平皿中。 2. 小鼠脱颈处死，取脾和胸腺(分别位于左侧腹部和胸骨柄处) 3. 取胸腺和脾脏分别放到平皿中，用直头镊子固定组织，用 弯头镊子轻压组织，将其捣碎，再将3-4层纱布覆盖到组织 上，然后用滴管隔着纱布将细胞悬液吸出。 4. 按下图加样：>> 5. 混匀后放置37℃水浴，孵育40分钟。 6. 取出后每管加入50ul台酚兰染液，混匀后立即取出染色的 细胞悬液20ul滴到玻片上，用盖玻片盖上，在显微镜下观 察。 7. 观察结果：计数200个细胞中死细胞数(死细胞形态为肿胀 变大，失去折光性，呈兰色)。 加样方法 试管 阳性管(ml) 阴性管(ml) 靶细胞 100 100 抗Thy-1血清 100 — PBS — 100 补体 100 100 结 果 判 定 Ag+C Ag+Ab+C 阳性管 阳性管 细胞毒百分率(%)= (1- 阴性管 阳性管活细胞数 阴性管活细胞数 )×100% 注意事项 靶细胞浓度要适中，过高或过低均会影响试验结果 。 台酚兰染色时间不要太长，因为台酚兰本身具有一 定的毒性作用，可致细胞死亡。 补体要新鲜采集，三只以上的豚鼠的血清混合。 补体依赖性细胞毒实验的应用 细胞性抗原的测定 单克隆抗体的筛选和鉴定 组织相容性抗原的检查与分型 细 胞 毒 试 验 细胞毒试验的分类 抗体依赖细胞介导的细胞毒试验（ADCC） 补体依赖的细胞毒试验（CDC） 细胞介导的细胞毒试验 NK细胞介导的细胞毒试验 抗体依赖细胞介导的细胞毒试验（ADCC） ADCC反应是由多种不同效应细胞群介导的杀伤性 效应机制之一。 选用适当的靶细胞，加相应的免疫血清，再加入 效应细胞，作用一段时间后，观察靶细胞被破坏 的程度并推测效应细胞的ADCC作用。 淋巴细胞的若干亚群如NK细胞，以及巨噬细胞等 都具有这种杀伤功能。 ADCC反应中所用的靶细胞也是多种多样的，常用 的是同种或异种红细胞，或传代的肿瘤细胞系等。 补体依赖的细胞毒试验（CDC） 实验原理： 细胞性抗原与特异性抗体(IgG1,2,3或IgM) 结合后，可激活补体活化的经典途径，引起细胞 膜受损，细胞膜通透性改变，而使细胞外低渗的 液体（水）进入细胞，使细胞胀大死亡。 细胞介导的细胞毒试验 细胞介导的细胞毒试验是检测细胞毒性T细胞(CTL) 对靶细胞的杀伤作用。 CTL对靶细胞具有直接杀伤作用，能特异杀伤某些 肿瘤细胞或病毒感染的细胞。 CTL的细胞毒活性是评价机体细胞免疫功能的指标， 但其检测需要抗原预先致敏。 测定肿瘤患者CTL对瘤细胞的杀伤作用对判断肿瘤 预后及观察疗效有重要意义。 NK细胞介导的细胞毒试验 NK细胞：无需抗原预先致敏就能杀伤靶细胞的 大颗粒淋巴细胞、对肿瘤细胞及某些病毒感染 的细胞具有明显的杀伤作用。 NK细胞杀伤方式： １.直接接触启动杀伤：NK 细胞一旦与靶细胞结 合后，即可被活化发生细胞内颗粒重排，释放 NK细胞毒因子、穿孔素等物质破坏靶细胞。 ２. ADCC作用杀伤靶细胞。 细胞毒试验检测方法 形态学检测方法（ADCC、CDC、NK） 同位素释放法（CTL、NK、ADCC） 酶释放法（ADCC、NK） 凋亡检测法（NK） 同位素释放法 原理：用放射性核素标记靶细胞，当靶细胞受到破 坏时，放射性核素被释放出来，通过测定释放或残 留在未破坏细胞内的放射性核素的放射活性，即可 计算和推测杀伤细胞的细胞毒活性。 常用的放射性核素：51Cr、3H-TdR、125I-UdR等。 优缺点：优点是敏感、简便、流程短等；缺点是试 验条件要求高，并且同位素具有化学毒性和放射毒 性，对人体有害。 细胞毒试验(51Cr释放法)示意图 51Cr 靶细胞 效应细胞 洗涤 去除游离 的51Cr 混合培养4-6小时 测量上清液中 释放的51Cr 酶释放法----乳酸脱氢酶释放法 原理：乳酸脱氢酶（LDH）存在于细胞内，正常情 况下不能透过细胞膜。当细胞受到损伤时，细胞 膜通透性改变，LDH可从细胞内释放到培养液中。 利用效应细胞与靶细胞进行反应并离心取上清， 借助比色法测定靶细胞膜受损后从胞内所释放出 的乳酸脱氢酶活性，其水平反映效应细胞的杀伤 活性。 优缺点：优点：经济、快捷、安全，可定量。 缺点：LDH分子较大，仅当靶细胞膜完全 被破坏时才释放,故不能较早地反映效应的功能。 酶释放法---血红蛋白酶释放法 (HbE-Assay) 用于检测ADCC 原理：红细胞被杀伤裂解后释放出的血红蛋白具 有过氧化酶活性，在过氧化氢存在下，可催化底 物邻-苯二胺等发生显色反应，用分光光度计测定 显色程度来间接表示ADCC对靶红细胞的杀伤活性。 优点：安全、简便。 细胞凋亡检查法 用于检测NK细胞的活性 原理：效应细胞介导靶细胞凋 亡时，内源性核酸水解酶将靶 细胞DNA在核小体单位之间被切 断，产生180-200bp(核小体单 位长度)及其整数倍数的寡核苷 酸片断，在琼脂糖电泳中呈现 阶梯状DNA区带图谱，借以反映 细胞凋亡。