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2008级五年制本科生 免疫学实验课 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬 鸡红细胞试验 实验原理 单核细胞存在于外周血液中，巨噬细胞广泛 分布在各种组织中，可以从腹腔渗出细胞、 骨髓、脾脏、淋巴结、胸腺、肝脏以及肺等 组织中分离获得。 正常小鼠每只可收集腹腔渗出细胞约106，其 中巨噬细胞占30%。如果给小鼠腹腔注射某种 刺激物，可使巨噬细胞渗出增加，易于分离 更多的巨噬细胞。 常用于刺激腹腔细胞渗出的物质 刺激物 浓度 原浓度 注射剂 量(ml) 0.5-1 细胞采取时间 获得细胞数量 （注射后天数） （×106） 2-3 1-5 血清 肉胨汤 10% 1-1.5 3-5 3-7 矿物油 原浓度 0.1-0.5 4-6 10-20 淀粉 2%-10% 1-1.5 3-5 2-5 明胶 2%-4% 0.5-1 3-5 3-7 实验分组及材料 分组：一只小鼠 试剂（每组）： 2％鸡红细胞悬液 1ml Giemsa－Wright染液 1 EP管 生理盐水 1瓶 • 器材（每组） • • • • • • • • • 1ml注射器 1个 玻片 4片 1ml微量加样器 1支 200ul微量加样器 1支 tips 若干 1.5mlEP管 2个 剪刀、镊子 1套 显微镜 温箱 操作步骤 1. 实验前1天，给小鼠腹腔注射3％淀粉溶液１ml。 2. 用1毫升注射器给小鼠腹腔注射2％鸡红细胞悬液0.5ml后 放回笼中；45min后脱颈椎处死小鼠。 3. 剪开小鼠腹部皮肤，用镊子提起腹膜，用剪刀剪开一小口， 用1ml加样器向腹腔打入2ml生理盐水，吸出腹腔液放入EP 管中。 4. 用200ul加样器在新的EP管中加入100ul腹腔液，再加入 20ul Giemsa-wright染色液，混匀后取出20ul加在载玻片 上，上面盖好盖玻片后，显微镜下观察。 结果判断 用40倍镜查找观察100个巨噬细胞，计数其中未 吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数、吞噬了鸡红细胞的巨 噬细胞数及被吞噬的鸡红细胞数，计算吞噬百分率 及吞噬指数。 吞噬百分率: 有吞噬作用的巨噬细胞数／100×100％ 吞噬指数: 有吞噬作用的巨噬细胞吞入的鸡红细胞总数／ 100 淋巴细胞分离及检测技术 淋巴细胞的分离 淋巴细胞的功能测定技术 淋巴细胞的分离 一、外周血单个核细胞的分离 淋巴细胞分离液密度梯度离心法 二、淋巴细胞亚群的分离及鉴定 1. E花环分离法 2. 尼龙纤维分离法 3. 流式细胞术 4. 磁珠分离术 E花环分离法 （纯化 （纯化T细胞） T细胞） TT细胞表面的 细胞表面的 CD2 CD2分子－绵羊红细胞受体（ 分子－绵羊红细胞受体（ E受体） E受体） 尼龙纤维分离法 BB细 细 胞和 胞和 单核细 单核细 胞 胞具 具有 有易 易粘 粘附 附特 特 性，将淋巴细胞悬 性，将淋巴细胞悬 液 液加 加到 到尼 尼龙 龙纤 纤维 维 上 上， ，37 37℃ ℃作 作用 用11－ －22 小时后，洗脱的为 小时后，洗脱的为 非粘附性 非粘附性TT细胞。 细胞。 PBMC B 细胞 单 核细胞 尼 龙纤维 毛柱 T 细胞 流式细胞术 （ Fl ow Cyt om et r y ， FCM ） FC MM 将免疫荧光技术应用于流式细 FC 将免疫荧光技术应用于流式细 胞仪，对单个细胞的表面标志（抗原或 胞仪，对单个细胞的表面标志（抗原或 受体）进行快速、精确的分析和自动检 受体）进行快速、精确的分析和自动检 测，并 FC 测，并 M 还 将不同类型的细 可对同一细胞的 将不同类型的细胞分选收集。 多种参数（如 胞分选收集。 FC 还 可对同一细胞的 多种参数（如 DD NM 、 、 蛋白质和细胞体积等）进 NA、 A RN RNAA 、 蛋白质和细胞体积等）进 行多信息分析，是当代生命科学研究领 行多信息分析，是当代生命科学研究领 域中广泛使用的一项新技术。 域中广泛使用的一项新技术。 免疫磁珠分离术 1. 直接法： 抗细胞表面分子抗体+ 磁性微球 免疫磁珠+ 细胞悬液 强磁场 与免疫磁珠结合的细胞 2. 间接法： 第二抗体+ 磁性微粒 第一抗体+ 细胞 磁场 特定细胞 淋巴细胞的功能测定技术 一、体外法 1. 淋巴细胞增殖试验 2. 酶联免疫斑点法 3. 细胞毒试验 二、体内法 淋巴细胞增殖试验 淋 巴细胞增 殖试验 淋巴 细胞在有丝分裂 原或特异性抗 原的作 用下，细胞内核酸 和蛋白质合成 增 加，同 时细胞 形态转 化为原 始母细 胞。 此实验 可测定 淋巴 细胞的 应答功 能 ，称淋 巴细胞 转化试 验 (lymp h o cyte tran sfo rm atio n test). 一、T细胞增殖试验 1. 形态学检查 2. 3H-TdR掺入法 3. MTT法 二、B细胞增殖试验 T细胞增殖试验 （形态学示意图） 原 理 ： T细 胞体 外 受特 异性 抗 原物 质（ 如 细菌 类 毒 素 ） 、 非 特 异 性 有 丝 分 裂 原 （ 如 PH A、 Con A） 的 刺 激 后 能 转 化 为 体 积 较 大 、代 谢 旺 盛 、 且能 进 行分 裂的 淋 巴母 细胞 ， 以此 测定 T细 胞 的 功能 。正 常人 转化 率为 70％ 左右 。 PHA刺 激 48~72小 时 T细胞增殖试验 （ 3H-TdR掺入法） TdR掺入法） 原理 ： 淋巴细胞被有丝分裂原ConA或 PHA 激活后，进入细胞周期进行有丝分裂，当细 胞进入S期，细胞合成DNA明显增加，在培 养液中加入 3H标记的DNA合成原料脱氧胸 腺 嘧 啶 核 苷 (TdR)， 则 3H-TdR 作 为 合 成 DNA的 原 料 被 摄 入 细 胞 ， 掺 入 新 合 成 的 DNA中，根据同位素掺入细胞的量则可推测 淋巴细胞对刺激物的应答水平。掺入的同位 素经β-液体闪烁仪检测。 四 甲基偶氮 唑盐法 （ MTT ） 淋巴细胞被有丝分裂原等激活发生 转化，在 细胞培养终止前数 小时加入 MTT，活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶 分解MTT产生蓝色甲臜（Fo rm azan )沉积 于细胞内或细胞周围，形成甲臜的量与细 胞增殖程度成正相关。 B细胞 增殖试 验 不溶性 SPA是人 B细胞的高效促分裂 原，对 T细胞无刺激作用。在淋巴细胞悬 液中加入不溶性 SPA，混匀培养 3天，培 养结束 前 22小时加入 3H -Td R， 采用 3H Td R掺入法检测 B细胞的增殖程度。 酶联免疫斑点法 （En zym e-Link ed Imm un o spo t, ELISPOT） 在 ELI SA的 基础上建立 的检测 抗体 生成细胞 及细胞因子 产生细胞 的方 法。 体内法检测淋巴细胞 功能 原理：用生物 抗原或化学抗原作皮内试验 。 常用抗原：结 核菌素（O T） 链 激酶－链道酶（ SK－ D S） 结果判定：注 射 48-72 后 h 观察，注射 局部出 现红肿、硬结 ，直径大于 0. 5 cm为阳性。 应用：检测 免疫缺陷病、观察肿瘤患 者免疫 功能、疗效和 预后。