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2008级五年制本科生 免疫学实验课 外周血单个核细胞分离 实验内容 外周血单个核细胞的分离（实验） 淋巴细胞分离及检测技术（讲解） 实验目的 掌握单个核细胞分离及淋转的原理和方法 熟悉淋巴细胞的检测技术 细胞分离纯化的目的 测定细胞免疫功能首先要从人或动物外周血或 组织中获取有活性的细胞，如淋巴细胞、巨噬细 胞、粒细胞等。 根据实验目的不同，采用不同方法，主要需考 虑(1)细胞纯度；(2)细胞获得量；(3)细胞活力； Ficoll密度梯度离心法 常用来分离外周血单个核细胞（PBMC）的分层液：比重是 1.077左右的聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)分层 液。 红细胞、粒细胞比重大(1.092)，离心后沉于管底；淋巴 细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重(1.070)， 离心后漂浮于分层液的液面上，吸取分层液液面的细胞， 就可从外周血中分离到单个核细胞。 Ficoll密度梯度离心法 比重：1.070 比重：1.077 Ficoll 比重：1.092 实验材料 分组：两人一组 器材 数量 试剂 数量 滴管 2支/2人 分层液 1ml/2人 EP管 1个/2人 血液 1ml/2人 计数板 1块/2人 PBS 1瓶/4人 计数液 1管/4人 1ml刻度吸管 1支/4人 加样器(tip) 1把/4人 显微镜 1台/2人 实验步骤 1. 加样：吸取1ml稀释的血液沿试管壁缓慢加至分层液顶部； NOTE：不要打破血液与分层液的界面； 2. 分离：2,000r/min离心15min，离心后管内液体可分为四层， 见后图； 3. 回收：将吸管直接插入灰白层，沿管壁轻轻吸出灰白层单个 核细胞，放入EP管中，400ml左右即可； NOTE：尽量少吸分层液； 4. 计数：将EP管中的细胞液上下颠倒混匀，取出20ml加入新 的EP管中，再加入20ml细胞计数液，混匀后取出10ml，加到 计数板内，显微镜下计数。 示意图 细胞计数方法 4 查出四个大方格的总细胞数(X) 算出每个大方格的平均细胞数：Y=X/4 每个大方格的体积为V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml 制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=Y×104×稀释倍数 淋巴细胞分离及检测技术 红细胞 淋巴细胞 巨噬细胞 DC细胞 淋巴细胞分离及检测技术 淋巴细胞的分离 淋巴细胞的功能测定技术 淋巴细胞的分离 一、外周血单个核细胞的分离 淋巴细胞分离液密度梯度离心法 二、淋巴细胞亚群的分离及鉴定 1. E花环分离法 2. 尼龙纤维分离法 3. 流式细胞术 4. 磁珠分离术 E花环分离法 （纯化 （纯化T细胞） T细胞） TT细胞表面的 细胞表面的 CD2 CD2分子－绵羊红细胞受体（ 分子－绵羊红细胞受体（ E受体） E受体） 尼龙纤维分离法 BB细 细 胞和 胞和 单核细 单核细 胞 胞具 具有 有易 易粘 粘附 附特 特 性，将淋巴细胞悬 性，将淋巴细胞悬 液 液加 加到 到尼 尼龙 龙纤 纤维 维 上 上， ，37 37℃ ℃作 作用 用11－ －22 小时后，洗脱的为 小时后，洗脱的为 非粘附性 非粘附性TT细胞。 细胞。 PBMC B 细胞 单 核细胞 尼 龙纤维 毛柱 T 细胞 流式细胞术 （ Fl ow Cyt om et r y ， FCM ） FC MM 将免疫荧光技术应用于流式细 FC 将免疫荧光技术应用于流式细 胞仪，对单个细胞的表面标志（抗原或 胞仪，对单个细胞的表面标志（抗原或 受体）进行快速、精确的分析和自动检 受体）进行快速、精确的分析和自动检 测，并 将不同类型的细 胞分选收集。 FC 测，并 MM还 将不同类型的细 多种参数（如 胞分选收集。 FC 还可对同一细胞的 可对同一细胞的 多种参数（如 DD NNA、 、 、 蛋白质和细胞体积等）进 A RN RNAA 、 蛋白质和细胞体积等）进 行多信息分析，是当代生命科学研究领 行多信息分析，是当代生命科学研究领 域中广泛使用的一项新技术。 域中广泛使用的一项新技术。 免疫磁珠分离术 1. 直接法： 抗细胞表面分子抗体+ 磁性微球 免疫磁珠+ 细胞悬液 强磁场 与免疫磁珠结合的细胞 2. 间接法： 第二抗体+ 磁性微粒 第一抗体+ 细胞 磁场 特定细胞 淋巴细胞的功能测定技术 一、体外法 1. 淋巴细胞增殖试验 2. 酶联免疫斑点法 3. 细胞毒试验 二、体内法 淋巴细胞增殖试验 淋 巴细胞增 殖试验 淋巴 细胞在有丝分裂 原或特异性抗 原的作 用下，细胞内核酸 和蛋白质合成 增 加，同 时细胞 形态转 化为原 始母细 胞。 此实验 可测定 淋巴 细胞的 应答功 能 ，称淋 巴细胞 转化试 验 (lymp h o cyte tran sfo rm atio n test). 一、T细胞增殖试验 1. 形态学检查 2. 3H-TdR掺入法 3. MTT法 二、B细胞增殖试验 T细胞增殖试验 （形态学示意图） 原 理 ： T细 胞体 外 受特 异性 抗 原物 质（ 如 细菌 类 毒 素 ） 、 非 特 异 性 有 丝 分 裂 原 （ 如 PH A、 Con A） 的 刺 激 后 能 转 化 为 体 积 较 大 、代 谢 旺 盛 、 且能 进 行分 裂的 淋 巴母 细胞 ， 以此 测定 T细 胞 的 功能 。正 常人 转化 率为 70％ 左右 。 PHA刺 激 48~72小 时 T细胞增殖试验 （ 3H-TdR掺入法） TdR掺入法） 原理 ： 淋巴细胞被有丝分裂原ConA或 PHA 激活后，进入细胞周期进行有丝分裂，当细 胞进入S期，细胞合成DNA明显增加，在培 养液中加入 3H标记的DNA合成原料脱氧胸 腺 嘧 啶 核 苷 (TdR)， 则 3H-TdR 作 为 合 成 DNA的 原 料 被 摄 入 细 胞 ， 掺 入 新 合 成 的 DNA中，根据同位素掺入细胞的量则可推测 淋巴细胞对刺激物的应答水平。掺入的同位 素经β-液体闪烁仪检测。 四 甲基偶氮 唑盐法 （ MTT ） 淋巴细胞被有丝分裂原等激活发生 转化，在 细胞培养终止前数 小时加入 MTT，活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶 分解MTT产生蓝色甲臜（Fo rm azan )沉积 于细胞内或细胞周围，形成甲臜的量与细 胞增殖程度成正相关。 B细胞 增殖试 验 不溶性 SPA是人 B细胞的高效促分裂 原，对 T细胞无刺激作用。在淋巴细胞悬 液中加入不溶性 SPA，混匀培养 3天，培 养结束 前 22小时加入 3H -Td R， 采用 3H Td R掺入法检测 B细胞的增殖程度。 酶联免疫斑点法 （En zym e-Link ed Imm un o spo t, ELISPOT） 在 ELI SA的 基础上建立 的检测 抗体 生成细胞 及细胞因子 产生细胞 的方 法。 体内法检测淋巴细胞 功能 原理：用生物 抗原或化学抗原作皮内试验 。 常用抗原：结 核菌素（O T） 链 激酶－链道酶（ SK－ D S） 结果判定：注 射 48-72 后 h 观察，注射 局部出 现红肿、硬结 ，直径大于 0. 5 cm为阳性。 应用：检测 免疫缺陷病、观察肿瘤患 者免疫 功能、疗效和 预后。