Transcript Slide 1
عنوان آزمايشگاه :اسپكتروفتومتري
هدف آزمايشگاه:
آشنايي بااجزاي دستگاه اسپكتروفتومتري وقوانين
اسپكتروفتومتري
اسپکتروفتومتر ناحيه مريی Spectrophotometer
اسپكتروفتومتر
اسپكتروفتومتر يا طيف سنج يك دستگاه آزمايشگاهي اوليه است
كه جهت خواندن نتايج آزمايشهايي كه واكنش آنها از نوع
End pointهستند به كار ميرود .اين دستگاه ميزان جذب يا
عبور طول موجهاي مشخصي از انرژي تابشي (نور) از يك
محلول را اندازه گيري ميكند بيشترين كاربرد آن در
آزمايشگاه ،در بخش بيوشيمي است.اساس كار اسپكتروفتومتر
همانند بسياري از دستگاههاي آزمايشگاهي ،بر اندازه گيري
ميزان نور جذب شده توسط يك محلول رنگي است كه طبق
قانون بير-المبرت ميزان جذب نور ) (ODمتناسب با غلظت
ماده حل شده در محلول است .
• روشهای طیف سنجی براساس بر هم کنش تابش
الکترومغناطیسی با ماده بنیان گذاری شده است و چون
امواج الکترومغناطیس ،حاصل کاهش سرعت ذرات با بار
الکتریکی است بنابراین توسط ماده جذب شده و سبب
افزایش سرعت ذرات می گردد .عالوه بر این انرژی
نورانی در بر هم کنش با ماده و جذب آن توسط ماده ،باعث
برانگیختن ماده به ترازهای انرژی باالتر می گردد.
• بنابراین بسته به شدت و قدرت انرژی وارده به ذره با ماده
بر هم کنش کرده و پدیده خاصی را سبب می گردد که
اساس اندازه گیریهایی نظیر اسپکتروفتومتری را تشکیل
می دهد.
• كووت
كــووتهــا مـحـفـظــههــاي شـفــافــي هـستنـد كـه مـحـلـول
مـورد آزمـایـش در آن ریـخـتـه شـده و در جایگاه خاص
خود كه در مسیر نور تكرنگ تعبیه شده است قرار
ميگیرد .كووتها با توجه به نوع مصرف ،جنس ،شكل و
حجم متفاوتي دارند .براي مـحـلــولهــاي اسـیــدي و
قـلـیــایـي از كـووتهـاي مـخـصوص شیشهاي و براي طول
موجهاي زیر 320نـانـومـتـر از لـولـه كوارتز یا پالستیك
استفاده ميشود.
• كاليبراسيون
كالیبراسیون اسپكتروفتومتر ،فرایندي است كه در آن مراحلي جهت
تضمین صحت كار دستگاه بهكار گرفته ميشود .این روش تضمین
ميكند كه اندازه گیريهاي به دست آمده توسط وسیله مورد نـظــر
دقـیــق هـسـتـنــد .روش كــالـیـبــراسـیــون بــراي مدلهاي مختلف
متفاوت است با این حال اكثر تـولـیـدكـنـنـدگـان كـتـابـچـه راهـنـمـایـي
را كـه شـامل جزئیات كالیبراسیون و نحوه كار با دستگاه است ،براي
استفاده كاربران فراهم مي كنند.
• اسپكتروفتومتر قادر است تا به عنوان فرستنده و گـیــرنــده نــور
عـمـل كنـد .ایـن وسیلـه بـراي آنـالیـز نمونههایي از ماده تست ،توسط
عبور نور از درون نمونه و خواندن شدت طول موجها مورد استفاده
قــرار مــيگـیــرد .نـمــونــههــاي مـخـتـلـف نـور را بـه روشهـاي
مختلـف فشـرده مـيكننـد و بـه محقق اجازه ميدهند تا توسط بررسي
رفتار نور هنگام عبور از نمونه مورد نظر ،با ساختار آن بیشتر آشنا
شوند .در كالیبراسیون این وسیله ،از یك محلول مرجع جهت تنظیم
صفر دستگاه استفاده ميشود.
• در اسپكتروفتومتر تك پرتویي ،یك پرتو نور تولید و دستگاه
باید بعد از هر بار استفاده ،كالیبره شود .در نــوع دو
پــرتـویـي ،پـرتـوهـا از طـریـق نمـونـه تسـت فرستاده
ميشوند و نمونه مرجع در همان زمان ،دو مجموعه از
نتایج را كه ميتواند به عنوان مرجع و كـــالــیـبــراسـیــون
اسـتـفــاده شــود ،تــولـیــد مــيكـنــد .كـالـیبراسیون ميتواند
در آزمایشگاه توسط افراد باتجربه نیز صورت گیرد .البته
اگر دستگاه دچار آسیب یا مشكل جدي شود ،باید جهت
تعمیر و تنظیمات اولیه به كارخانه سازنده یا نمایندگيهاي
معتبر ارجاع داده شود .
• 1-دستگاه را روشن كنید و 10دقیقه منتظر بمانید تا
دستگاه گرم و آماده به كار شود.
2نور محفظه را تغییر دهید تا به طول موج مورد نظربرسید.
3كووت را تا نیمه با محلول واكنش پر كنید .كووت نبایدحاوي نمونه ناشناخته باشد.
4دو طرف كووت را با دستمال پاك كنید.5آن را در مـحـفـظــه قــرار دهـیـد و درب آن را ببندید.6-منتظر بمانید تا اندازه گیري تمام شود.
نحوه كار با اسپكتروفتومترD 20/20
-1دستگاه را روشن كنيد .اجازه دهيد تا به مدت 15دقيقه گرم شود .
-2طول موج مورد نظر را با دكمه قرار گرفته در كنار محفظه نمونه تنظيم كنيد.
-3محفظه نمونه را بررسي كنيد تا از خالي بودن آن مطمئن شويد .دكمه مربوط به
تنظيم صفر را كه در جـلـو و سـمـت چـپ اسـپـكـتـروفـتـومـتـر اسـت ،بچرخانيد تا
مقدار صفر را نمايش دهد.
-4براي اطمينان از پاكيزگي و كاهش اشتباه در نتايج اندازه گيري ،از دستكش
استفاده كنيد.
-5كووت را با آب مقطر پر كنيد و آن را در نگـه دارنـده قـرار دهيد .كووت را به
سمت پايين فشار دهيد تا در جاي خود تراز شود .دقت كنيد كه خارج كووت تميز و
خشك باشد.
-6دكمه كنترل نور را كه در جلو و سمت راست دستگـاه قـرار دارد ،بچـرخانيد تا
مقدار عبوري يا جذب را بخواند.
-7سپس كووت نمونه را در محفظه قرار دهيد .مقدار نشان داده شده را ثبت كنيد.
اجزاء و قسمتهای مختلف دستگاه اسپکتروفتومتر
-1منبع نورانیLight Source
-2عدسی ها:
-3شکافها ()slits
-4منوکروماتور()monochromators
-5محل نمونه:
-6دتکتور (نور سنج
-7رکوردر (الکتريک سنج)
اجزاء و قسمتهای مختلف دستگاه اسپکتروسکوپ
• اسپکتروفتومتر از دو بخش اسپکترومتر و فتومتر تشکیل شده است.
اسپکترومتر بخشی است که نور منوکروم را ایجاد کرده و دارای منبع
نور ،عدسی ،شکافها ،منوکروماتور (صافی ،منشور یا (( Grating
)systemمی باشد .بخش فتومتر دارای اسباب سنجش نور می باشد.
• -1منبع نورانی :منبع نور مورد استفاده در اسپکتروفتومتر بسته به
ناحیه مورد استفاده ،متفاوت می باشد .برای نورهای مرئی از المپ
تنگستن استفاده می شود که نورهایی با طول موج بین 350تا 800
نانومتر ایجاد می کند .و برای نورهای ماوراء بنفش ( )UVاز المپ
جیوه ،هیدروژن استفاده می شود .این المپها در ناحیه بین 200تا
600نانومتر بکار می روند .در دستگاههای پیشرفته تر هر دو نوع
المپ وجود دارد.
• -2عدسی ها( :آینه ها) :برای کنترل کردن مسیر نور ،وجود
عدسی الزم است .به جای عدسی ها از آینه هایی که به شکل
نیمدایره یا محدب ساخته شده اند می توان استفاده نمود.
• -3شکافها ( :)slitsدر هر اسپکتروفتومتری دو شکاف وجود
دارد :یکی را شکاف ورودی و دیگری را خروجی می گویند.
شکافها رل مهمی در جداکردن نور دلخواه با طول موج
مشخص دارند .به همین جهت اندازه این شکافها بسیار مهم
هستند .بیشتر دستگاهها پیچی دارند که اندازه این شکافها را می
توان برحسب احتیاج تغییر داد .هر چه طول این شکافها بیشتر
باشد پهنای نور عبوری ( )band-passبیشتر بوده و دامنه
طول موج آن نیز زیاد می باشد و به عبارت دیگر نورهای
دیگری که مورد نیاز نیستند عبور می کنند .این نور اضافی را
Stray lightمی نامند
• -4منوکروماتور( :)monochromatorsاشعه نورانی پس از
عبور از عدسی ها و شکاف مقدار و مسیر آنها کنترل شده
سپس به دستگاهی که می تواند نور پلی کروم را به منوکروم
تبدیل کند وارد می شود .پس نوری با طول موج مشخص و
انتخابی به وجود می آورند .دو نوع منوکروماتور وجود دارد
منشور و .Grating
• -5محل نمونه :ظرف محتوی نمونه را سل یا کووت
( )cuvettمی نامند که از جنس شیشه ،کوارتز یا پالستیک
است .برای اندازه گیری شدت رنگ محلولها و بالنک بکار می
رود .سلهای شیشه ای و پالستیکی برای ناحیه مرئی به کار می
رود و در ناحیه ماوراء بنفش از سل کوارتز استفاده می شود.
طول سلها معموال 1سانتی متر است و سلهایی با طول cm
1/0تا cm 10نیز موجود می باشد .محل قرار گرفتن نمونه
بسته به اینکه دستگاه جایگاه جدا برای رفرنس (بالنک) دارد یا
نه Single beam ،و Double beamنام دارد.
• -6دتکتور (نور سنج) :نور پس از عبور از عدسیها و شکافها
و منوکروماتور به محلول لوله آزمایش رسیده و از آنجا به
نورسنج می رود .اسباب منوکروماتور ،نور دلخواه و با طول
موج مشخص را به لوله آزمایش می تاباند .رنگ این نور
مکمل رنگ محلول است .اگر رنگ محلول سبز -آبی (مثل
تعیین مقدار گلوکز بوسیله ارتو تولوییدین) به طول موج
nm 495-475باشد رنگ فیلتر -منشور یا گریتینگ باید
نارنجی یا نزدیک آن با طول موج بین nm 620-600باشد.
چون رنگهای نارنجی مکملش سبز-آبی است .بنابراین وقتی
منوکروماتور رنگ مکمل رنگ محلول را به لوله آزمایش می
تاباند مقداری از آن به وسیله محلولی که در لوله وجود داشته و
بستگی به غلظت مواد مورد آزمایش دارد ،جذب شده و بقیه آن
به نورسنج می رسد.
• نورسنج با تبدیل انرژی نورانی به انرژی الکتریکی قادر
است که مقدار جذب این نور را به وسیله محلول و یا درصد
ترانس – میتانس آن اندازه گیری نماید .دتکتورها شامل انواع
فتوشیمیائی ،فتوالکتریکی و حرارتی می باشد که در ناحیه
مرئی و ماوراء بنفش از دتکتورهای فتوالکتریکی مانند
فتوولتتیک و فتوتیوب و فتومولتی پالیر تیوب استفاده می
شود.
• -7رکوردر (الکتریک سنج) در اسپکتروفتومتر احتیاج به
دستگاهی است که جریان الکتریکی دتکتور را اندازه
بگیرد .دو سیستم گالوانومتر و نول پوینت وجود دارد که
در اسپکتروفتومترهایی که دارای نواحی مرئی باشند
معموال از یک گالوانومتر یا صفحه دیجیتالی استفاده می
شود .دیاگرام زیر ،طرح یک اسپکتروفتومتر ساده را نشان
می دهد.
•
•
•
•
اسپکتروفتومتر نشر شعله (:)Flame
ساختمان این دستگاه شبیه اسپکتروفتومتر یا فتومتر ساده است
با این تفاوت که در فتومتر ،المپ الکتریکی و در این دستگاه
نور حاصل از سوختن ماده مورد آزمایش در درون شعله به
عنوان منبع نوری در نظر گرفته میشود .در طیف سنجی نشر
شعله ،نور حاصل مستقیما اندازهگیری میشود.
اسپکتروفتومتر جذب اتمی :)(Atomic Absorption
اسپکتروفتومترهای جذب اتمی ) (AASغلظت عناصر فلزی که
از نظر پزشکی برای حفظ سالمتی مهم است را اندازه گیری
میکند .در خصوص این عناصر میتوان به کلسیم ،منیزیم،
مس ،روی و آهن اشاره نمود .اسپکتروفتومترهای جذب اتمی
همچنین برای تعیین اینکه آیا سطح درمانی داروهایی نظیر لیتیم
در خون ،تامین شده است یا خیر و همچنین برای آشکارسازی
و تعیین کمیت سموم فلزی مورد استفاده قرار میگیرد
قانون کمی جذب یا قانون بیر-المبرت:
• این قانون اساس تجزیه کمی در جذب سنجی را تشکیل می
دهد.هرگاه یک نور تکفام با شدت Iعمد بر سطح تابش
دارد که یک محلول همگن و شفاف به ضخامت Lو غلظت
مولکولی Cگردد،قسمتی از آن جذب می شود ( ، )Iaبخشی
منعکس ( ، )Irو قسمت دیگر از محلول عبور می کند و
در امتداد شعاع تابش خارج می گردد ( )Itبنابراین رابطه
ی زیر برقرار است":
• Io =Ir+Ia + It
روش محاسبه
X 100 XCجذب نور
جذب نمونه استاندارد
=2-LOG T%جذب A
=X