isfehan-1-molecular pathology
Download
Report
Transcript isfehan-1-molecular pathology
روشهای تشخیص مولکولی
• آنزیم ها و عملکردشان
آنزیم
عملکرد
پلیمراز DNA:پلیمرازها
RNAپلیمرازها
سنتز رشته دختر از ´ 5به ´3
آنزیم رونویسی کننده معکوس
سنتز DNAاز روی الگوی RNA
DN Aلیگاز
اتصال قطعات DNAمنقطع
اندونوکلئاز
اگزونوکلئاز
هضم اسیدنوکلئیک از وسط مولکول
هضم اسیدنوکلئیک ازانتهای مولکول
اندونوکلئاز محدود کننده
اندونوکلئازباکتریایی که DNA
راازناحیه خاص می شکافد
Restriction Endonuclease
SOUTHERN BLOT HYBRIDIZATION
• ساترن بالت:
در این روش DNAمورد سنجش قرار می گیرد
مراحل کار :
جداسازی DNAهضم DNAبا اندونوکلئازهای محدود کنندهجداسازی براساس اندازه با الکتروفورزدرآگاروزانتقال اجزاء متفاوت به نیترو سلولز با عمل موئینگیتثبیت کردن با حرارت یا UVبرروی غشاءهیبرید نمودن: ذوب نمونهاتصال پراب نشاندار شستشوردیابی:باندهای حاوی توالی های مکمل با پراب ،با اتورادیوگرافی ،کلریمترییا کمیلولومینانس ردیابی می شوند
Southern Blot
Restriction enzyme
DNA of
various sizes
Electrophorese on agarose gel
gel
Denature - transfer to
filter paper.
blot
Denature- transfer to
filter paper.
blot
Hybridize to probe
Visualize
S
o
u
t
h
e
r
n
B
lo
t
• نورترن بالت:
دراین روش RNAمورد سنجش قرار می گیرد-دراین تکنیک RNAاز سلول جدا وبدون هضم وبرش الکتروفورز میشود
نکته:
تکنیک حساستر برای شناسایی RNAسنجش محافظت در مقابل RNaseاست
دراین روش:
RNAبا پراب نشاندار هیبرید می شود RNaseبه مخلوط اضافه می شود که فقط RNAتک رشته ای وپراب غیرهیبرید را هضم می کند
مولکول های دو رشته های از هضم در برابر آنزیم RNaseمحافظت میشوند و RNAهیبرید با پراب با الکتروفورز جدا می گردند
Northern Hybridization
Isolate mRNA
(Different Lengths)
Probe with labeled DNA
• هیبریدیزاسیون در جا)(In situ hybridyzation
در این روش پرابها به DNAموجود در کروموزوم های ثابت شده رویصفحات میکروسکوپ هیبرید می شوند
DNAبرروی اسالیدثابت شده انددرهمان جا دناتوره می شوند تا دو رشته درمعرض پراب نشاندار شده قرار بگیرند به همین دلیل به این روش
هیبریدیزاسیون درجا می گویند
شایعترین روش نشاندار کردن پرابها برای هیبریدیزاسیون درجاکروموزومهابا رنگ فلورسنت است به این تکنیک هیبریدیزاسیون فلورسنت در جا
)(FISHمی گویند
کاربرد :
سیتوژنتیک تشخیصی بالینی-نقشه برداری ژنی
High Resolution Banding and FISH
Control Signals
Region-Specific Signal
The chromosome banding technique performed 20 years ago missed the
small deletion. High resolution banding developed more recently can
elucidate the abnormality. Fluorescence in situ Hybridization (FISH) is a
powerful technique in that it can reveal submicroscopic abnormalities even
in non-dividing cells.
• روشهای آمپلیفیکاسیون:
درسه سطح زیرصورت می گیرند:
آمپلیفیکاسیون هدف آمپلیفیکاسیون پراب آمپلیفیکاسیون سیگنالروشهای آمپلیفیکاسیون هدف شامل:
انواع واکنش های زنجیره پلیمراز آمپلیفیکاسیون باواسطه رونویسی /آمپلیفیکاسیون برپایه توالی اسید نوکلئیک آمپلیفیکاسیون با جابجایی رشتهروشهای آمپلیفیکاسیون پراب شامل:
واکنش زنجیره لیگازتکنولوژی /تهاجمی کلیواز Q betaرپلیکازروشهای آمپلیفیکاسیون سیگنال شامل:
DNAشاخه ای -سنجش های تسخیر هیبرید
•
تعریف:
)polymerasechain reaction (PCR
روشی ساده وسریع برای ساخت نسخه های متعددی از توالی های حدود یک
کیلوبازی DNAمیباشد
مراحل انجام واکنش:
:Denaturationتبدیل DNAدورشته ای به DNAتک رشته ای دردمای 94:Primer Annealingاتصال پرایمرها به انتهای 3زنجیره DNAتک رشته ایدردمای 50-58
:Extentionآنزیم DNAپلیمراز دردمای 72ازانتهای 3هر پرایمر زنجیره مکمل رامی سازد
رنگ آمیزی اتیدیوم بروماید روی ژل آگاروز
bacterium Thermus aquaticus
حداقل 2پرایمر
اختصاصیت
رشته
تک
→
نسبی
موقعیت
محدودیت فاصله
قطعات 22باز
-17
←
Animation for PCR
http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcrani.html
30x
Temperature
100
Melting
94 oC
Extension
Annealing
Primers
50 oC
50
0
72 oC
3’
5’
3’
5’
3’
5’
5’
5’
3’
5’
5’
5’
94 oC
T i m e
3’
3’
5’
Melting
3’
5’
5’
5’
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
Number
12
0 1
Cycles
4
8
16
32
2
3
4
5
64
6
یک قطعه ی دقیق با
سایز مشخص دریک
ژل آکریل آمید رنگ
آمیزی شده با اتیدیوم
بروماید درتمامی
نمونه ها به جز نمونه
بالنک
فرایند تکثیر
موفق
فنل
وجود فرآورده در کنترل
بالنک
↓دما ↑منیزیم
استخراج
مجدد
کلروفرم
استات
امونیوم
حضور قطعات
غ اختصاصی یا
مقادیر کم فراورده
عدم حضور یک
قطعه در تمام
مسیر ها
↓منیزیم ↑دما
عدم موفقیت فرایند
تکثیر
محصول نهایی واکنش :PCRقطعات دورشته ای DNAکه ´ 5از شروع میشوند وطول این DNAبین دوپرایمر قرار
دارد
-آنزیم DNAپلیمراز:
DNAپلیمرازی که ازباکتریهای مقاوم به حرارت به نام Thermus aquaticusبدست می
آید
نکته :
تمام واکنشها در یک لوله حاوی اسیدنوکلئیک هدف،پرایمر،بافر تریس ,dNTP,
,kcl,mgclدر دستگاهی به نام ترموسایکلرانجام میگیرد.این دستگا ه مراحل د ناتوره
Annealing, Extension،رابه طور خودکار کنترل میکند
رعایت نکات الزم وضروری:
انتخاب پرایمربافرحرارت Annealingراباال برده تا واکنش اختصاصی تر گرددزمان Extentionرا تا حد ممکن پایین آورده تا شانس Mis primingکاهش یابد-بخاطر اختصاصی بودن PCRالزم است که از آلودگی با DNAخارجی اجتناب شود
DNA Gel Electrophoresis
• Melted agarose is poured into
a form equipped with
removable comb
• Comb “teeth” form slots in
the solidified agarose
• DNA samples are placed in the
slots
• An electric current is run
through the gel at a neutral
pH
5-26
DNA Separation by Agarose Gel
Electrophoresis
• DNA is negatively charged due to
phosphates in its backbone and
moves to anode, the positive pole
– Small DNA pieces have little frictional
drag so move rapidly
– Large DNAs have more frictional drag
so their mobility is slower
– Result distributes DNA according to
size
• Largest near the top
• Smallest near the bottom
• DNA is stained with fluorescent dye
5-27
Electrophoresis of Large DNA
• Special techniques are required for DNA
fragments larger than about 1 kilobases
• Instead of constant current, alternate long
pulses of current in forward direction with
shorter pulses in either opposite or sideways
direction
• Technique is called pulsed-field gel
electrophoresis (PFGE)
5-28
Protein Gel Electrophoresis
• Separation of proteins is done using a gel
made of polyacrylamide (polyacrylamide gel
electrophoresis = PAGE)
– Treat proteins to denature subunits with
detergent such as SDS
• SDS coats polypeptides with negative charges so all
move to anode
• Masks natural charges of protein subunits so all move
relative to mass not charge
– As with DNA smaller proteins move faster toward
the anode
5-29
PCR Reaction Components
•
•
•
•
•
•
•
•
Water
Buffer
DNA template
Primers
Nucleotides
Mg++ ions
DNA Polymerase
Extras
PCR Reaction Components
• Water
• Purity
• Contamination
– Amplification Products
PCR Reaction Components
• Buffer
• Must match polymerase
• Typically contain KCl and Tris
• Can vary over a slight range:
– Not much difference in range
from 0.8 X to 2.0 X
– Primer efficiency reduced outside
this range
http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/p06.html
PCR Reaction Components
• DNA template
• Amount of DNA present
– Less DNA means more cycles
• Complexity of DNA
– Eg. plasmid vs. whole genome
• Purity
– Interfering factors, eg. enzymes, salts
• Degradation
– PCR more forgiving of degraded DNA
• Contamination
– Amplification products
• Presence of “poisons”
– Eg. EDTA which scavenges Mg++
PCR Reaction Components
• Primers
•
•
•
•
Age
Number of freeze-thaws
Contamination
Amount
–
–
–
–
Can vary over a wide range (50X)
100-500 nM typical
Too low: low amplification
Too high: low amplification
http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/p05.html
PCR Reaction Components
• Nucleotides
• 20-400 uM works well
– Too much: can lead to mispriming and
errors
– Too much: can scavenge Mg++
– Too low: faint products
• Age
• Number of freeze-thaws
– Just 3-5 cycles is enough to make PCRs not
work well
• Dilute in buffer (eg. 10mM Tris pH 8.0
to prevent acid hydrolysis)
• Contamination
http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/p13.html
PCR Reaction Components
• Mg++ ions
• Mg is an essential cofactor of
DNA polymerase
• Amount can vary
– 0.5 to 3.5 uM suggested
– Too low: Taq won’t work
– Too high: mispriming
http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/p14.html
PCR Reaction Components
• Bottom Line:
All components work over a wide range. –
Need to avoid contamination. –
Optimization by trial-and-error. –
PCR Reaction Components
• DNA Polymerase
• Thermostable?
– Activity declines with time at
95C
•
•
•
•
Matches buffer?
Age
Contamination
Concentration: Typically 0.5 to
1.0 U/rxn
http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/p12.html
PCR Reaction Components
• Extras
• Proprietary or added by user
• Glycerol, DMSO
– Stabilize Taq, decrease secondary structure
– May help or hurt, depending on primers
– Typically already in the Taq stock
• BSA
– Frequently helps, doesn’t hurt
• Betaine
– Useful for GC-rich templates
http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/p16.html
http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/~rcruicks/additives.htm
PCR Cycling Parameters
Denaturation Temp
Annealing Temp
Extension Temp
Time
Number of Cycles
Reaction Volume
“Odd” Protocols
•
•
•
•
•
•
•
PCR Cycling Parameters
Must balance DNA •
Denaturation Step •
denaturation with Taq damage
95C for 30 - 60s typically is •
enough to denature DNA
Taq loses activity at high •
temps:
Half-life at 95C: 40 min –
Half-life at 97.5C: 5 min –
http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/p08.html
PCR Cycling Parameters
• Annealing Step
• Most critical step
• Calculate based on Tm
– Often does not give expected results
• Trial-and-Error
– Almost always must be done anyway
– Too hot: no products
– Too cool: non-specific products
• Gradient thermocyclers very useful
• Typically only 20s needed for primers
to anneal
http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/p08.html
PCR Cycling Parameters
• Extension Step
• Temperature typically 72C
– Reaction will also work well at
65C or other temps
• Time (in minutes) roughly
equal to size of the largest
product in kb
– Polymerase runs at 60bp/s
under optimum conditions
• Final “long” extension step
unnecessary
http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/p08.html
http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/p10.html
PCR Cycling Parameters
• Number of Cycles
• Number of source molecules:
–
–
–
–
>100,000: 25-30
>10,000: 30-35
>1,000: 35-40
<50: 20-30 fb. nested PCR
• Do not run more than 40
– Virtually no gain
– Extremely high chance of nonspecific products
• Best optimized by trial-and-error
http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/p08.html
PCR Cycling Parameters
• Reaction Volume
• Doesn’t affect PCR results as
long as volume is within limits.
• Heated lid important.
• 5ul, 20ul, 100ul all work.
• Slightly higher yield with lower
volumes.
http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/p03.html
PCR Cycling Parameters
• “Odd” Protocols
• Hot-Start PCR
– Taq is added last
• Touchdown PCR
– Annealing temp is progressively
reduced
Experimental Design: Controls
No positive or negative controls…
What does this result mean??
U
U
U
Only a positive control…
How do we know the result isn’t due to
contamination?
+
-
+
Both positive and negative controls…
Results can be interpreted with
confidence.
Experimental Design: Replication
-
-
Our unknown is definitely positive...
…but how sure are we?
+
+
U
U
U
We ran the same sample three
times…. Is our unknown really
positive?
• )Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR
در این روش RNAتوسط آنزیم ) (RTبه CDNAتبدیل می شودوبه روش PCRمعمولی به
تکثیر CDNAمی پردازند
با این روش میزان RNAدرمحیط نیز قابل اندازه گیری است
دو آنزیم بکار میرود :
ناپایدار گرماییپلیمراز پایدار به گرمابا توسعه این روشها DNAپلیمراز پایدار به گرما از ترموس ترموفیلوس به دست آمده است
که بطور موثر در حاالت RTو DNAپلیمراز عمل می کند
RT-PCRتک آنزیمی ویژه تر و کاراتر از RT-PCRبا آنزیمهای ناپایدار به گرما است
کاربرد:
ردیابی RNAویروس هپاتیت C-سنجش کمیت HIV-1,HCV
• Quantitative PCR
یک رابطه خطی ممکن است بین کمیت الگوی وارد شده و مقدار محصول امپلیفیکاسیوندادهشده وجود دارد
برهمین اساس روشهای برپایه برای تعیین کمیت هدفهای و درنمونه های کلینیکی توسعهداده شده است
-یکی از روشهای قابل اطمینان وقدرتمند در PCRکمی PCR ,رقابتی((CPCRاست
• اساس :CPCR
امپلیفیکاسیون دو الگوی متفاوت با طول یکسان یا مساوی وبا توالی های اتصال پرایمر
یکسان
دراین روش :
مقدار یکی از الگوها باید مشخص باشدپس از امپلیفیکاسیون هر دو الگو قابل شنا سایی باشندنکته:
رقیب هایی موثرتر عمل می کنند که در اندازه وترکیب باز با هدف مشابه باشند
)y=I(1+e
معادله بازده محصول:
معادله بازده محصول در برای هر دو الگو نوشته میشود
در حالیکه e,nبرای هردو رقیب وهدف یکسان باشد نسبت نسبی محصول )رقیب /تست (
مستقیما بستگی به نسبت غلظت آغازین الگوی تست ورقیب دارد
کاربرد:
سیتومگالوویروسHIV-1HCV-
•: Nested PCR
دراین روش از دو جفت پرایمراستفاده میکنند محصول تکثیر اولیه توسط پرایمر اول
بعنوان DNAمدل جهت انجام PCRبرای پرایمر جفت دوم استفاده میشود
امتیازاین روش:
حساسیت واختصاصی بودن
معایب:
بزرگترین عیب Nested PCRمیزان باالی آلودگی در هنگام انتقال محصوالت دوره اول به
لوله دوم برای دوره دوم امپلیفیکاسیون میباشد
• :Multiplex PCR
دراین روش بیش از یک جفت پرایمر در یک مخلوط PCRمورد استفاده قرار می گیرد :
یک جفت پرایمر کنترل-یک جفت پرایمر تست
نکته:
این واکنش باید دقت شود که پرایمرها دمای Annealingیکسانی داشته باشند و مکمل
یکدیگر نیز نباشند
معایب:
از PCRبا پرایمر تکی حساسیت کمتری دارد
مزیت:
چند نوع هدف رااز یک نمونه انفرادی دریک واکنش ردیابی می کند
• : Real time PCR
با این روش امپلیفیکاسیون هدف و مراحل ردیابی آن به طور همزمان در تیوپ انجام میگردد
روش بسیار دقیق وقابل اطمینان در سنجش کمیت PCRاستدر این روش از یک پراب فلورسنت الیگو نوکلئوتید استفاده می شوداین پراب یک قسمت reporterویک قسمت quenchen Dyeدارداگرپراب دست نخورده بماند قسمت خاموش کننده رنگ مانع از بروز فلورسنت می شوددرصورتی که پراب به هدف متصل شودآنزیم Taqپلیمراز با عمل اگزونوکلئازی قسمتخاموش کننده رنگ پراب را برش می دهد ورنگ فلورسنت ظاهر می شود
-میزان رنگ فلورسنت متناسب با میزان تکثیر است
روشهای ردیابی هدف:
رنگ های فلورسنت مثل SYBR Green1
-آنالیز منحنی ذوب
--
مزیت:
کاهش زمان الزم برای انجام سنجش های اسید نوکلئیککاهش آلودگی آزمایشگاهی-تعیین کمیت هدف
• ARMS-PCR
تکنیکی قدرتمند برای مشخص کردن جهش های نقطه ای استپراپمر جهش یافته ونرمال در دو لوله جداگانه قرار داده میشوداگرعمل پلیمریزاسیون در لوله حاوی پرایمر نرمال انجام شود نشان از نبودجهش های نقطه ای است
اگرعمل پلیمریزاسیون درلوله حاوی پرایمر جهش یافته انجام شود نشان دهندهحضور جهش نقطه ای درباز مورد نظر است
• ANCHORD-PCR
دراین روش قطعه اسید نوکلئیکی داریم که بخشی از توالی آن مشخص وباقینامشخص است
در ابتدا به انتهای توالی نامشخص ،یک توالی به نام Linkerاضافه می شودسپس دو پرایمر طراحی می شود یکی برای توالی Linkerودیگری برایتوالی مشخص اسید نوکلئیک و واکنش PCRصورت می گیرد
موارد كاربرد:
تشخیص اختالالت ژنتیکی
تشخیص سرطان
پزشکی قانونی
شناسایی عفونت
59
Relative Sensitivities of Major Techniques used to Detect
Leukemia or Lymphoma-Associated Translocation Fusion Genes
60