Transcript PCR
به نام پروردگار یادآوری • گروه بندی و انتخاب موضوع تحقیق؟ – نحوه ارایه :پاورپوینت -تحقیق در چند صفحه همراه منابع • تعریف بیوتکنولوژی – مثالهایی از بیوتکنولوژی کالسیک – بیوتکنولوژی مدرن • کلونینگ چیست؟ • تراریخت چیست؟ • انسان شبیه سازی شده؟ بیوتکنولوژی جلسه دوم PCR واكنش زنجيره‌اي پلي‌مراز Polymerase chain reaction Adenine Guanine Purine P y r im i d i n e Cytosine Thymine Uracil Thymine Adenine Adenine Cytosine Guanine Guanine Thymine Cytosine DNA همانند سازی 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ Primase Laging Strand Okazaki fragment 5’ RNA Primers 3’ Single strand binding proteins 5’ DNA Polymerase 5’ 3’ Helicase Leading Strand 5’ 3’ DNA آنزیم های کلیدی در همانند سازی • DNA Polymerase • • • • • DNA Ligase Primase Helicase Topoisomerase Single strand binding protein PCRچیست؟ • روشی که در آن قسمت خاصی از DNAالگو توسط آنزیم پلیمراز در سیکلهای گرمایی تکثیر می گردد • جایگزین روش کلونینگ ژن در باکتری: – ساده تر – کم هزینه تر – سریعتر تاریخچه كری موليس • 1985 • 1993برنده نوبل دالیل پیشرفت این روش • DNAپلیمراز مقاوم به حرارت • دستگاههای ترمال سایکلر مواد مورد نیاز • • • • • • • آب دیونيزه پلیمراز((Taq نوکلئوتید)(dNTPs پرایمرها بافر آنزیم کوفاکتور)(Mg الگو)(DNA مراحل واکنش PCR • دناتوراسیون اولیه • مراحلی که چندین سیکل تکرار می شوند – دناتوراسیون – اتصال پرایمرها – طویل شدن • طویل شدن نهایی Overview of PCR Temperature Cycling .1 94° 55° 72° Denaturation Annealing Extension 2. Every cycle DNA between primers is duplicated PCR Amplification Exponential Amplification Temperature 100 Melting 94 oC PCR 50 0 T i m e 3’ 5’ 5’ 3’ Temperature 100 Melting 94 oC PCR 50 0 T i m e 3’ 5’ Heat 5’ 3’ Temperature 100 Melting 94 oC 50 0 PCR Melting 94 oC Extension Annealing 72 oC Primers 50 oC T i m e 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ Temperature 100 Melting 94 oC 50 0 PCR Melting 94 oC Extension Annealing 72 oC Primers 50 oC T i m e 3’ 5’ Heat 5’ 5’ Heat 5’ 5’ 3’ 30x Temperature 100 Melting 94 oC 50 0 PCR Melting 94 oC Extension Annealing 72 oC Primers 50 oC T i m e 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 30x Temperature 100 50 0 3’ 5’ 5’ Melting 94 oC PCR Melting 94 oC Extension Annealing 72 oC Primers 50 oC T i m e 5’ 5’ 5’ 3’ Heat 5’ 5’ Heat 5’ 30x Temperature 100 50 0 3’ 5’ 5’ Melting 94 oC Extension Annealing 72 oC Primers 50 oC T i m e 5’ 5’ 5’ Melting 94 oC PCR 5’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 30x Temperature PCR 100 Melting 94 oC 50 0 3’ 5’ 5’ T i m e 5’ 5’ 5’ Melting 94 oC Extension Annealing 72 oC Primers 50 oC 5’ 3’ Fragments of defined length 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 30x Polymerase Chain Reaction PCR Product Plateau phase Linear phase End point analysis on agarose gels Exponential phase Cycles الکتروفورز PCR عوامل موثر در • • • • Reagent and instrument User mistakes Template Primers برخی کاربردها • • • • • • • • تشخیص بیماری ژنتیکی تعیین هویت افراد تشخیص بیماری ویروسی تیتر ویروسی توسط Real-Time PCR تکثیر قطعه خاص ژنی برای ژن کلونینگ ایجاد جهش برای ژن کلونینگ اضافه کردن قطعات خاص برای ژن کلونینگ بررسی بیان ژن RT-PCR Real Time PCR مقدمه ای بر What’s Wrong With Agarose Gels? * Low sensitivity • * Non-automated • * Size-based discrimination only • * Results are not expressed as numbers • * Ethidium bromide staining is not very • quantitative Three general methods for the quantitative detection: 1-TaqMan, Beacons, Scorpions 2. Hybridisation probes 3. DNA-binding agents (SYBR Green) The first two methods are specific formats. Fluoresces when bound to dsDNA DNA Polymerase 5' exonuclease activity Taqman probes are “hydrolysis” probes Polymerization 5’ 3’ 5’ Forward Primer TaqMan® R Probe Q 5’ 3’ 5’ Reverse Primer Displacement 5’ Forward Primer R Q 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ Reverse Primer Hydrolysis R Q 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ Polymerization Completed R Q 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ Hybridization probes Excitation FRET Emission P Amplicon 95oC Denaturation Tm 55oC Excitation FRET Emission P Fluorimeter Reading Primer/Probe Annealing 72oC Primer Extension Molecular Beacons Scorpion Product confirmation Melting curve analysis Melting peaks threshold Ct SERIES OF 10-FOLD DILUTIONS Real-Time PCR Applications • Quantification of DNA and RNA • Identify of presence and copy number of sequence – Identification and quantification of pathogen – Diagnosis of disease condition • Quantitation of Gene Expression • Array Verification Real-time PCR advantages * amplification can be monitored real-time * no post-PCR processing of products (high throughput, low contamination risk) * ultra-rapid cycling (30 minutes to 2 hours) * requirement of 1000-fold less RNA than conventional assays (3 picogram = one genome equivalent) * detection is capable down to a 2-fold change * confirmation of specific amplification by melting point analysis * most specific, sensitive and reproducible * not much more expensive than conventional PCR (except equipment cost) Real-time PCR disadvantages * not ideal for multiplexing * setting up requires high technical skill and support * high equipment cost *** * DNA contamination (in mRNA analysis) •موفق باشین