Transcript 조류생물학
Total RNA Reverse transcriptase Ribonucleic acid (RNA) # 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C), 우라실(U)의 4종의 염기를 포함하는 뉴클레오티드가 포 스포디에스테르결합으로 외가닥사슬모양 중합체를 형성한 폴리뉴클레오티드가 RNA이다. 약알칼리나 Rnase에 쉽게 분해된다. RNA 분리가 DNA보다 더 주의를 요하는 이유는 세포 가 분쇄되자 마자 세포내에 비활성 상태였던 Rnase가 활성화 되기 떄문이다. 더구나 실험자 의 손에 묻은 땀이나 타액에 다량의 Rnase가 함유되어 있기 때문에 RNAse오염에 주의해야 한다. RNA의 종류는 기능에 따라 리보솜을 구성하는 rRNA(분자량 3만~2백만), mRNA(분자량 5 만~5십만), tRNA(분자량 2만5천)로 구별된다. 세포 내에 대부분의 RNA는 rRNA이고, tRNA가 그 다음이며, mRNA는 수% 이하에 불과하다. 실험 목적에 따라 Total RNA를 모두 분리하거나 mRNA만 정제하여 추출 한다. RNA 연구 # 세포는 외부의 자극에 따라서 분화하거나 반응을 하게 된다. 한 개체의 모든 세포의 유 전정보는 동일한데 어째서 세포의 모양이나 기능이 다른가? 바로 세포마다 발현하는 단백질이 다르기 때문이다. 유전정보는 DNA-> RNA-> 단백질 순서로 전달되므로( central dogma) 단백질 발현 차이는 mRNA 발현 차이기 때문이다. 그렇기 때문에 특정 mRNA의 발현양을 분석하는 것이 중요한 것이다. # 옆 그림과 같이 차이가 있는 두 세포의 RNA를 분리해서 그 차이를 비교하려 할 때. total RNA를 분리해서 전기영동 해보면 차이가 없다(밴드 2개만 보임). 확인되는 밴드는 rRNA인 28s와 18s다. 우리가 관심 있는 mRNA는 전체 RNA의 1% 정도기 때문에 소량의 mRNA를 확인할 방법이 필요하다. mRNA를 확인하는 실험은 크게 2가지다. 1. Northern blot hybridization 2. RT-PCR RT-PCR # RT-PCR은 사실 RNA로부터 cDNA를 만들어 cloning하는 쪽으로 더 많이 쓰는 방법으 로 말 그대로 RT를 사용해서 PCR로 mRNA를 증폭시켜 검출하는 것이다. 아래 사진을 보면 total RNA의 차이가 없는 4개의 그룹에서 특정 mRNA를 타깃으로 RT-PCR을 하 여 전기영동하면 2,4번 샘플에 많이 검출되었음을 확인할 수 있다. # RT란 Reverse transcriptase 의 약자다. PCR에 쓰이는 Taq DNA polymerase는 DNA 를 template로 해서 DNA를 증폭하는 효소(DNA-dependent DNA polymerase)이므로 RNA로부터 직접 증폭할 수 없다. 따라서 RNA를 template로 할 경우, RNA를 주형 (template)으로 하고 여기에 상보적 DNA를 합성하는 효소를 (RNA-dependent DNA polymerase)인 reverse transcriptase를 처리해서 일단 DNA로 복사한 다음 증폭한다. 그래서 RNA를 PCR하는 방법을 RT-PCR(Revere Transcriptase-Polymerase Chain Reaction)이라고 한다. # 맨 먼저 reverse transcriptase로 RNA를 complementary DNA(cDNA)로 역전사 한 다. RNA는 single strand이기 때문에 primer는 downstream primer뿐이다. 그후 생성된 cDNA에서 일반적인 PCR의 과정을 밟아서 유전자를 증폭한다. # downstream primer는 다음과 같은 세가지 종류가 있 다. mRNA 뒤에 poly(A) tail이 붙는 것을 응용한 oligo(dT) primer, gene specific primer, 그리고 여기 저기 붙는 random primer다. Oligo(dT) primer를 쓰 면 분리한 RNA 중 mRNA는 모두 cDNA로 만들어진다. Gene specific primter를 사용하면 target gene만 cDNA로 만들어진다. 그리고 random primer(주로 hexamer)는 염기서열이 일정치 않지만 길이가 고정된 primer다. 이런 primer를 넣고 반응시키면 길이도 다 양하고 모든 RNA(rRNA, tRNA 포함)가 모두 cDNA로 만들어져서cDNA pool이라고 부른다. Trizol # Trizol reagent에는 phenol이 guanidinium thiocyanate(Rnase 저해제)와 함께 들어있 다. -Trizol 에 들어있는 페놀은 acid phenol이어서 단백질을 변성시키고 지질을 녹여서 세포막을 파괴한다. 또한 산성이 강해서 DNA를 변성시킨다(cf.DNA 추출 시 사용했던 페놀은 약한 산성). -DNA와 RNA는 성질이 조금 다르다. DNA는 알칼리에서는 안정하지만 RNA는 알칼리 에서 가수분해가 일어나서 조각조각난다(degradation). 반대로, acidic 할 때 DNA는 degradation 되지만 RNA는 안전하다. 그래서 acid phenol을 처리하면 DNA는 제거되 고 RNA만 추출된다. -세포를 깬 후 chloroform 시약을 첨가하면 비로소 층이 갈리게 되는데, RNA는 상층액 에 분리된다. http://www.youtube.com/watch?v=RmPsLoIPRwc 실험: total RNA 분리 (1) 재료 및 장비 - 3.5ml dish(cell 배양) - Trizol(실온보관) - RNase free tube - Filter tip - Chloroform(실온보관) - Isopropyl alcohol(실온보관) - 70% ethanol(-20℃보관) - RNase free dH2O - 원심분리기 - 파이펫(1000, 200), tip (blue, yellow) - Vortex Mixer - Spectrophotometer (2) 실험방법 Homogenization ① 3.5 dish에 꽉 채워 키운 세포에 Trizol 1ml을 넣고 강하게 vortexing한 후 실온에서 5분 간 반응시킨다 Notice! 주위 환경의 RNase contamination 방지하기 위해서 시약에 DEPC라는 RNase inhibitor를 처리한다. 용기는 대개 1회용을 쓰고, 어쩔 수 없는 경우 autoclave하고 또는 장갑을 착용하고 RNA work 만을 위한 용기를 쓴다. -참고# 배양세포 RNA를 분리하는 방법은 우선 세포를 모으고 (cell harvest ) PBS로 washing을 거쳐 tube에 모은다. # 조직을 쓰는 경우에는 이런 정도로 세포가 파괴되지 않기 때문에 세포를 갈아준다. - 조직을 liquid nitrogen을 이용해서 동결시킨다음 막자 사발에 놓고 가는 방법 - Glass homogenizer를 이용해서 가는 방법 - Polytron homogenizer를 이용해서 가는 방법 RNA층 분리 ② 200μL chloroform을 첨가하고 vortexing한 후 실온에서 2-3분간 반응시킨다. ③ 12000xg, 15분간 4℃에서 원심분리해서 새 튜브에 상등액만 옮긴다. RNA 침전 ④ 200μL isopropyl alcohol을 넣고 상하로 흔들어 실온에서 10분간 반응시킨다. ⑤ 12000xg, 10분간 4℃에서 원심분리한 후 육안으로 하얀색 침전물(pallet)을 확인한다. RNA 세척 ⑥ 상층액을 쏟아내고 70% cold ethanol을 튜브 반대쪽 벽면에 뿌려서 침전물이 세척 (washing)되도록 한다. ⑦ 뒤집어서 말린다. RNA 수득 ⑧ 50 μL RNase free dH2O 로 수득 후 -80℃ Deep freezer에 보관