Transcript 5주차_Ligation, Transformation

5주차
생화학 및 분자생물학실험
Ligation
Transformation (DNA prep.)
Content
1.
Purpose
- Ligation
- Transformation
2.
Introduction & theory
- Ligation
- X-gal(Blue white selection)
- Transformation 종류 및 방법
- Competent cell
3.
Materials & method
Experiment Scheme (gene cloning)
Purpose _ Ligation
T4 DNA ligase를 이용하여 재조합 DNA 완성의 마지막 단계인
Ligation (vector와 insert 연결)을 진행한다.
Purpose_ Transformation
재조합 DNA를 증폭시키기 위해서 competent cell에 Transformation 하
여 selection한다.
Introduction & theory
1.


Ligation
Restriction enzyme에 의해 절단된
vector와 insert를 접합하는 과정
DNA ligase를 사용하여 Ligation
(phosphodiester bond를 형성)
Introduction & theory
DNA ligase에 의해 5’ phosphate가 3’ termini hydroxyl group의
nucleophilic attack을 받아 이 둘 사이에 phospho-diester bond를 형성
Introduction & theory
1)


Ligase 종류
Bacteriophage T4 DNA ligase (Bacteriophage T4-infected E. coli )
- Cohesive 또는 blunt termini를 가지는 이중 나선 DNA를 결합
- ATP를 cofactor로 사용 (Mg2+를 포함)
- 진핵세포, virus, bacteriophage에서 찾을 수 있음
E. coil DNA ligase
- blunt-ended DNA ligation 효율성이 상대적으로 떨어짐
- NAD+를 cofactor로써 사용
- RNA는 ligation 되지 않음
- 오직 bacteria에서 찾을 수 있다
Introduction & theory
Ligation 비율
대부분의 경우 vector : insert 비율은 1:1 , 1:3 , 1:8
2)
(ng vector) x (kb size of insert)
(kb size of vector)
X (molar ratio of (insert/vector)) = (ng insert)
ex) 3.075 kb insert to be ligated with 100 ng of 2.9 kb vector in (vector : insert =1:3) ratio
((100ng vector) x (3.075 kb of insert)) ÷ (2.9 kb vector)) x (3/1)) = (318.1 ng insert)
Introduction & theory
3)
Recombinant plasmid
Insert
Vector
< pRSET-lacZ >
Introduction & theory
2.
Transformation
- 숙주 세포에 외래 DNA를 넣어주어 세포가 원래의 성질과는 다른 새로운
유전형질을 추가로 얻게 되는 것
- Bacteria를 차가운 CaCl2로 처리한 다음 잠시 열처리를 하면 bacteriophage
λ가 세포 내로 들어가 phage를 형성. 이때의 bacteria를 protoplast라고 함
(일시적으로 bacteria의 세포막이 DNA가 infection될 수 있는 competent
상태로 유도되는 것)
Introduction & theory
1)
방법
-
Electroporation
: 순간적으로 E.coli에 electric shock를
가하여 DNA를 세포 안으로 넣는 방법
-
Chemical transformation
: Cell에 화학적 처리를 하여 competent
cell을 제조하고 여기에 DNA를 삽입시
키는 방법
Introduction & theory
Chemical competent cell
bacteria에 화학적 처리를 하여 DNA가 잘 들어갈 수 있게 만든 것
2)
< Chemical competent cell 원리 >
① DNA는 phosphate에 의해 (-) charge이며, 세포막 또한 diacyl-glycerol
에 의해 (-) charge를 갖기 때문에 서로 척력이 발생
② 척력을 중화하기 위해 divalent cation (Ca2+, Rb2+) 사용
(세포막 고유의 charge가 변하게 됨에 따라 막 구조의 불안정이 야기
 흐물흐물한 상태가 되어 DNA 삽입이 가능)
Introduction & theory




저온 상태의 competent cell에 유전자
주입
Divalent cation에 의해 세포막 주변에
(-) charge를 가지는 유전자 분포
42 ℃ 온도에서 30 sec~1 min 30 sec)
heat shock
DNA를 활발하게 움직이게 하여 cell 안
으로 삽입, cell 표면의 구멍을 확장
Introduction & theory
3)
Competent cell 종류
a.
유전자 재조합용
DH5α competent E. coli
- gene cloning을 위해 가장 보편화되어 있으며 일반적으로 많이 사용
- recA1, endA1, LacZ 등을 mutation 시킨 균종
- 통상적으로 90초간 heat shock을 시행
①
Top10 competent E. coli
- 유전자를 흡수할 수 있는 효율이 좋은 편이어서 소량의 유전자를 형질전환 할 때 사용
ex) cDNA library, site-directed mutagenesis 등
- 통상적으로 30초간 heat shock을 시행
②
Introduction & theory
단백질 발현용
b.
BL21
- Control Strains으로써 λ DE3 용원균은 아니지만 그 외에는 발현용 숙주와 동일 유전자
형을 갖는 대장균으로 발현의 control용 숙주로 사용
①
BL21(DE3)
- 높은 수준의 단백질 발현 및 induction에 용이
- IPTG로 lacUV5 promoter로부터 T7 polymerase 유도 가능
- 유도되지 않은 독성 단백질이 발현 될 수 있는 단점이 있음
②
Introduction & theory
BL21(DE3)pLysS
- 목적 단백질이 대장균에 강한 독성이 있는 경우 사용
- Induction 하기 전 T7 RNA polymerase 활성을 억제할 수 있는 T7 lysozyme 유전자를 가짐
- Chloramphenicol에 저항성을 가지며 단백질 induction 용이
③
BL21-codon plus competent E. coli
- Heterologous protein은 종종 드믄 tRNA들을 포함하고 있어 BL21 strain에서는 제한적임
 BL21-codon plus strain은 rare tRNA coding gene이 포함되어 제한이 적음
④
Rosetta
- BL21에서 파생, 대장균에서 거의 사용되지 않는 codon을 포함하고 있는 진핵생물의 단
백질의 발현을 향상시키기 위해 설계됨 (tRNAs는 7개의 rare codon 제공)
- Chloramphenicol 저항성
- Lon and ompT proteases (단백질분해효소)의 결핍으로 단백질의 안정성 향상
⑤
Introduction & theory
4) Transformation 이후, colony형성의 3 가지 type
a.
b.
c.
Transformation이 제대로 진행되지
않아 plasmid가 없는 경우
Transformation은 제대로 진행 되었
으나, ligation이 제대로 진행되지 않
은 경우
Transformation과 ligation 두 가지가
모두 제대로 진행된 경우
Introduction & theory

X-gal (Blue white selection)
< IPTG >
Blue
X-gal
(5-bromo-4-chloro-3-indolylbeta-D-galactopyranoside)
Introduction & theory
Materials & Method
1.
2.
Ligation
Transformation
Ligation
<Materials>
Heating block, T4 DNA ligase, 10X T4 DNA ligase buffer, Vector(pRSET A), insert(Lac Z), LB,
LB plate, competent cell (DH5α), ice, spreader, incubator, alcohol lamp, centrifuge
1.
2.
3.
Heating block을 25 ℃로 맞춘다.
Autoclave된 e-tube에 reaction mixture를 만든다.
Materials
Vol. (ul)
Vector (50 ng/ul)
1
Insert (50 ng/ul)
3
10X T4 ligase buffer
2
T4 DNA ligase
1
DW
13
Total
20
25℃ heating block에서 2시간 ligation한다. (4℃, Over Night 가능)
Transformation
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
Heating block을 42 ℃로 맞추고, ampicillin이 첨가된 LB plate를 37 ℃ pre-incubation
Deep freezer에 보관 중인 DH5α를 꺼내어 ice에서 녹인다
Alcohol lamp를 켜고 ligation한 DNA를 1 μl 따서 DH5α에 첨가한다(pipetting)
15 min 이상 ice에 꽂아둔다
42 ℃에서 1 min 30 sec heat shock한다
Ice에 2 min 꽂아둔다
Autoclave된 LB broth medium을 200 μl 따서 첨가한다
37 ℃에서 1 hr incubation한다
37 ℃ incubator에 넣어둔 ampicillin LB plate에 8.에서 준비한 cell을 따서 spreading 한다
37℃에서 overnight incubation한다
 다음 날 colony 확인